專利名稱：馬鈴薯金線蟲檢測用引物及探針的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，具體地說涉及馬鈴薯金線蟲檢 測用引物、探針及其檢測方法。
背景技術：
馬鈴薯金線蟲(G/oZ)ocfera mstoc/n'e似^ )和馬鈴薯白線蟲(G 戸肌&)合稱馬鈴薯孢嚢線蟲，是馬鈴薯上毀滅性的有害生物之一， 也是國際上公認的重要檢疫性有害生物，據估計在歐洲每年造成的 經濟損失達數億歐元，目前已經隨帶土的馬鈴薯種薯傳播到幾乎所 有的馬鈴薯生產國家。由于我國采取了嚴格的植物檢疫措施，禁止 從疫區(qū)國家輸入種用馬鈴薯種薯，目前馬鈴薯孢嚢線蟲我國未尚有 發(fā)生。但是，在中國入世談判過程中，分別與加拿大和荷蘭簽署了 有關進口種用馬鈴薯的植物檢疫議定書，其后又與美國、英國簽署 了類似的議定書，因此，該線蟲隨進口馬鈴薯種薯傳入我國的風險 日益增大。
本研究選擇馬鈴薯金線蟲ITS序列設計一條熒光標記探針和一 對引物，建立了馬鈴薯金線蟲的熒光PCR檢測方法，可快速準確地 檢測馬鈴薯金線蟲。

發(fā)明內容
為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了用于馬鈴薯金線蟲實時熒光PCR檢測的引物、4笨針及其檢測方法。
本發(fā)明通過分析已報道馬鈴薯金線蟲ITS序列的基礎上，分別 設計引物和熒光探針。所述的引物對由正向和反向引物組成，其核 苷,列分別為正向引物SEQ ID No. l( FP )和反向51物SEQ ID No.2 (RP)，所述探針核苷酸序列為SEQIDNo.3 ( LP )。
本發(fā)明還進一步給出了應用上述引物和探針的熒光PCR檢測方 法，其以樣品總DNA為模板，反應結束后根據擴增曲線判定結果。
具體地說本發(fā)明以樣品總DNA為模板，進行實時熒光PCR反 應，即在25^L反應體系中力口入2.5 fiL 10x反應緩沖液(1 mM Tris-HCl pH 9.0, 5 mM KC1, 0.01% Triton X-100), 2 mM Mg2+， 50 |LiM dNTP, 1U r叫DNA聚合酶，上下游引物FP和RP各400 nM, 200 nM TaqMan探針，lng才莫板DNA，最終用滅菌水補足25 ptL。
其中TaqMan 4笨針是4笨針SEQ ID No.3的5，端標記有FAM熒光 染料，3'端標記淬滅基團TAMRA。
其中，上述反應條件可以是反應程序為第一步95。C 3 min， 第二步95°C 15s, 60。C25s, 40個循環(huán)。
當然，可以根據本發(fā)明給出的引物對或者其擴增產物序列設計 其他類型的^^笨針，以適用不同方法的熒光PCRJ全測。
進一步，還可以將本發(fā)明引物、探針以及相關試劑組裝成試劑 盒，以方便使用。
更具體地，本發(fā)明的技術方案為
本發(fā)明提供了 一種馬鈴薯金線蟲檢測用引物，其核苷酸序列為
SEQIDNo.l (正向)5，-ACTCCATGTTGTACGTGCCG-3， SEQIDNo.2 (反向)5'-CACGGCCACGGACGTAG-3，
本發(fā)明還提供了一種與權利要求1所述引物配合使用的探針， 該探針的核苷酸序列為
SEQ ID No.3: 5 ，-TGCGGCATGTCTGCGCTTGTG畫3'
該探針一端標記有報告熒光染料，另 一端采用了淬滅基團。
更具體地，上述探針的5，端標記有FAM熒光染料，3'端標記淬 滅基團TAMRA。
本發(fā)明還提供了 一種檢測馬鈴薯金線蟲的檢測方法，該方法以 樣品總DNA為模板，利用上述引物以及探針進行實時熒光PCR擴 增，反應結束后根據擴增曲線判定結果。
上述實時熒光PCR的反應過程程序為第一步95°C 3 min,第二 步95。C15s， 6CTC25s, 40個循環(huán)后觀察反應結果。
本發(fā)明還提供了 一種含有上述引物FP和RP的試劑盒，該試劑 盒還可以包括上述的LP探針。
本發(fā)明的根據馬鈴薯金線蟲ITS序列設計上述引物及探針具有 優(yōu)異的特性，探針的特異性好，用于熒光PCR檢測靈敏性高。其能 夠快速筒單地判斷樣品是否有馬鈴薯金線蟲，為進出口安全提供了 保證。


圖1是本發(fā)明特異性引物和探針?；詸z測；GR1至GR8為馬鈴薯金線蟲；GP1至GP6為馬鈴薯白線蟲；BCN為甜菜孢嚢線蟲； CCN燕麥3包嚢線蟲；CN為Ozcto^ra sp.; CK1至CK3為對照。
圖2馬鈴薯金線蟲混合體系及未知孢嚢線蟲的檢測，MX1至 MX6為馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的混合樣品，CK1為沒有模板 的對照；CK2為純水的對照。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明
的范圍。 實施例
引物及探針的設計和合成
根據馬鈴薯金線蟲ITS序列，采用探針設計軟件Express 2.0設 計出引物及探針，引物序列為
FP (正向)5，-ACTCCATGTTGTACGTGCCG-3， RP(反向)5，-CACGGCCACGGACGTAG-3， 所述探針的序列為
LP: 5, -TGCGGCATGTCTGCGCTTGTG-3 ，，
該探針的5，端用報告熒光染料FAM標記，3'端采用淬滅基團
TAMRA作標記，獲得的探針命名為TaqMan探針。
Real-time PCR擴增方法的建立
1、實時熒光PCR反應體系
采用25-jllL反應體系，具體的反應體系包括2.5 lOx反應緩沖 液(1 mM Tris-HCl pH 9.0, 5 mM KC.l， 0.01% Triton X-100 ) , 2 mM Mg2+, 50 (iM dNTP, 1U TaqMan聚合酶，上下游上述引物FP和RP各400nM， 200nMTaqMan探針，lng模板DNA，最終用滅菌水補 足25/xL。反應程序為第一步95。C3min，第二階段95°C 15s， 60°C 25s, 40個循環(huán)。
2、反應體系M優(yōu)化
實時焚光PCR進行兩步反應，對復性-延伸溫度進行了優(yōu)化； 確定能得到最大的ARn值時的最低引物濃度和鎂離子濃度，以使用 最小循環(huán)閾(CV)和最大AR。值來作這一優(yōu)化。研究結果表明，在 本焚光PCR反應體系中，最佳反應條件為正反向引物濃度配比 1200nM/1200nM， Mg"濃度為3.0 mM,探針濃度為600nM，復性 -延伸溫度為60°C。
馬鈴薯金線蟲引物FP和RP特異性和LP探針?；詸z測 用上述引物和TaqMan探針對14個馬鈴薯孢嚢線蟲群體和其 它幾個孢嚢線蟲進行的熒光PCR檢測結果表明，來自馬鈴薯金線蟲 的8個群體都檢測到熒光，而其它孢嚢線蟲均不產生熒光，因此特 異性引物和探針能有效地將馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲及其它孢 嚢線蟲區(qū)分開來，說明上述引物和探針的專化性。(結果參見圖l)
檢測靈^t度
將馬鈴薯金線蟲的DNA在紫外分光光度計上測其DNA的量， 然后進行10倍梯度稀釋和測量，結果表明線蟲DNA濃度越大Cr值 越小，同時能夠檢測的最低DNA濃度為10fg。
ABI Prism熒光沖企測系統記錄的Cr值與DNA模板濃度呈線形關 系(Y=-2.428X+28.03， R2=0.993 ),表明檢測結果的有效性，并可 以用于目標DNA的定量分析。同時，對單個干孢嚢進行的靈敏度檢測試驗，結果表明從單個孢嚢中提取的DNA量足以熒光PCR檢觀'J， 并且效果很好。
未知孢嚢線蟲及馬鈴薯金線蟲混合樣品的檢測
使用上述特異性引物和TaqMan探針對1個來自俄羅斯的馬鈴 薯孢嚢線蟲樣品和6個馬鈴薯金線蟲與馬鈴薯白線蟲的混合樣品進 行檢測，在混合樣品中也都可檢測到馬鈴薯金線蟲的存在；未知樣 品產生熒光，證明該未知樣品為馬鈴薯金線蟲。(結果參見圖2)序 列 表 <110> 中國檢驗檢疫科學研究院 <120> 馬鈴薯金線蟲檢測用引物及探針 <160> 3
< 170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 1
actccatgtt gtacgtgccg <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 cacggccacg gacgtag <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3
tgcggcatgt ctgcgcttgt g
權利要求
1、一對馬鈴薯金線蟲檢測用引物，其核苷酸序列為SEQ ID No.15’-ACTCCATGTTGTACGTGCCG-3’SEQ ID No.25’-CACGGCCACGGACGTAG-3’
2、 一種與權利要求1所述引物配合使用的探針，其核苦酸序列 為SEQIDNo.3: 5，-TGCGGCATGTCTGCGCTTGTG-3',該探針一 端標記有報告熒光染料，另一端標記淬滅基團。
3、 如權利要求2所述的探針，其特征在于，該探針5，端標記有 FAM熒光染料，3，端標記淬滅基團TAMRA。
4、 一種檢測馬鈴薯金線蟲的檢測方法，該方法以樣品總DNA 為模板，利用權利要求1所述的引物以及權利要求2或3所述的探 針進行實時熒光PCR擴增，反應結束后根據擴增曲線判定結果。
5、 如權利要求4所述的方法，其特征在于，實時熒光PCR擴 增的反應程序為第一步95°C 3 min，第二步95°C 15s, 60°C 25s, 40 個循環(huán)后觀察反應結果。
6、 一種試劑盒，其含有權利要求1所述引物。
7、 如權利要求6所述的試劑盒，其還包括權利要求2或3所述 的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種馬鈴薯金線蟲檢測用引物和探針，本發(fā)明還進一步提供了檢測馬鈴薯金線蟲的檢測方法。本發(fā)明通過分析已報道馬鈴薯金線蟲ITS序列的基礎上，分別設計引物和熒光探針。所述的引物對由正向和反向引物組成，其核苷酸序列分別為正向引物SEQ ID No.1(FP)和反向引物SEQ ID No.2(RP)，所述探針核苷酸序列為SEQ ID No.3(LP)。本發(fā)明還進一步給出了應用上述引物和探針的熒光PCR檢測方法，其以樣品總DNA為模板，反應結束后根據擴增曲線判定結果。本發(fā)明探針特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度高，為進口馬鈴薯種薯安全提供了保證。
文檔編號C12N15/11GK101545008SQ200910079368
公開日2009年9月30日 申請日期2009年3月9日 優(yōu)先權日2009年3月9日
發(fā)明者曹愛新, 朱水芳, 葛建軍, 趙文軍, 陳洪俊 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院