專利名稱：一株可降解多環(huán)芳烴的鹽單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株可降解多環(huán)芳烴的鹽單胞菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以鏈狀、角狀或串狀排列組成的化合物，主要來自于木材、化石燃料、煤焦油產(chǎn)品或食物 等有機(jī)質(zhì)的不完全燃燒，多環(huán)芳烴在環(huán)境中分布廣泛，在大氣、水體、土壤、沉積物和食品中 都有檢出。多環(huán)芳烴大多數(shù)為有毒物質(zhì)，許多有三致效應(yīng)，即致癌、致畸變和致突變，迄今 為止已發(fā)現(xiàn)的多環(huán)芳烴類致癌物及其衍生物已經(jīng)超過400種，不乏苯并(a)芘這樣的強(qiáng)致 癌物質(zhì)。多環(huán)芳烴具有的半揮發(fā)性、親脂性、高生物蓄積性和難降解等特性，使其能夠在環(huán) 境中長時(shí)間存在、長距離遷移并富集于生物體，給人類健康和生態(tài)系統(tǒng)安全造成長期而嚴(yán) 重的危害。因此，1998年，美國、加拿大和歐洲共32個(gè)國家訂立的《關(guān)于長距離越境空氣 污染物公約》中將多環(huán)芳烴明確定為必須控制的持久性有機(jī)污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)。環(huán)境中的多環(huán)芳烴除少部分可以發(fā)生光化學(xué)分解外，大部分主要依賴生物降解途 徑慢慢消失，因此微生物降解是控制多環(huán)芳烴污染較為經(jīng)濟(jì)有效的方法。然而，多環(huán)芳烴污 染常常伴隨著鹽濃度較高的環(huán)境，例如多環(huán)芳烴隨著石油的突發(fā)事故、落地油及含油污水 排放等對(duì)沿海濕地中的鹽堿灘環(huán)境造成嚴(yán)重污染，含油和含鹽量都比較高(鹽度> 3.5% w/v)的油田采出水排放會(huì)使接納環(huán)境中的鹽度和多環(huán)芳烴含量同時(shí)升高，釀成污染。普通 降解菌雖然能有效降解多環(huán)芳烴卻難以在較高的鹽濃度下生長，而嗜鹽降解菌的研發(fā)能夠 解決這一矛盾，因此對(duì)控制多環(huán)芳烴污染有重要意義。中度嗜鹽菌是指能夠在鹽濃度為3% 15%的條件下有最佳生長能力的極端微 生物類群。中度嗜鹽菌分布極其廣泛，在鹽湖、海洋等鹽水環(huán)境，鹽堿地、鹽池等鹽土環(huán)境 和鹽漬發(fā)酵食品等人工環(huán)境中都能夠被發(fā)現(xiàn)。中度嗜鹽菌易于在高鹽環(huán)境中生長繁殖，因 而能夠最大程度減少發(fā)酵過程中其它菌類的污染；同時(shí)營養(yǎng)要求比較簡單，可以利用多種 有機(jī)物作為碳源和氮源；它們獨(dú)特的生理生化特性使其具有較高的應(yīng)用價(jià)值。中度嗜鹽菌 在高鹽濃度下能夠降解苯甲醛、苯酚等有毒有害的難降解物質(zhì)，所以利用中度嗜鹽菌在生 理生化上的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)來處理環(huán)境污染日益受到關(guān)注。Maltseva等人分離的1-18菌株具有 高活性的兒茶酚過氧化酶、粘康酸環(huán)異構(gòu)酶和二烯內(nèi)脂水解酶活性，在含有5. 85% NaCl, pH8. 4 9. 4的條件下可降解苯甲酸、3-氯苯甲酸和4-氯苯甲酸。海桿菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)在高達(dá)20 %的鹽濃度下仍能降解烴類。鹽單胞菌(Halomonas halodurans)可裂解苯甲酸脂和芳烴類的芳香環(huán)。有些鹽單胞菌(Halomonas)的菌株可以 降解酚類物質(zhì)，也有些鹽單胞菌科(Halomonadaceae)的菌株能夠利用氯代芳烴化合物作 為碳源和能源。已有研究采用含中度嗜鹽菌的生物膜反應(yīng)器處理鹽度達(dá)15%的污水，苯酚 的降解率達(dá)到99%。然而，目前關(guān)于可降解多環(huán)芳烴的中度啫鹽菌的報(bào)道還很少，已發(fā)現(xiàn)的 多環(huán)芳烴降解菌中，缺少像中度嗜鹽菌這樣能在高鹽度和較寬的鹽度范圍發(fā)揮降解作用的菌種，也很少有能夠降解多種多環(huán)芳烴類物質(zhì)的嗜鹽菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株可降解多環(huán)芳烴的鹽單胞菌。 本發(fā)明所提供的鹽單胞菌是從山東省東營市仙河鎮(zhèn)勝利油田的土壤中篩選得到 的。根據(jù)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等證實(shí)屬于鹽單 胞菌屬(Halomonas)，將其命名為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A_l。仙河鹽單胞 菌(Halomonas xianhensis) A-I已于2009年3月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究 所)，保藏登記號(hào)為CGMCC Na 2941。仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1CGMCC Ns 2941為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞 呈桿狀、無鞭毛，沒有運(yùn)動(dòng)性，大小為(1. 15 1. 40) μ mX (0. 50 0. 63) μ m。該菌株的菌
落呈圓形、光滑、隆起、黃色、有光澤、邊緣整齊特征。仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-ICGMCC Na 2941 為好氧細(xì)菌，可生長 pH 范圍為5. 5 9. 0，最適生長pH值為7. 2 ；可生長溫度范圍為10 42°C，最適生長溫度為 300C ；該菌株屬于嗜鹽微生物，能在0. 05 27. 5%的鹽度范圍內(nèi)進(jìn)行生長繁殖，最適宜生 長的鹽度范圍為4 10%。仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941無法利用蔗糖、麥芽糖、 α -乳糖和D-木糖產(chǎn)酸，可利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-半乳糖和 D-葡萄糖產(chǎn)酸；該菌株不能水解明膠和吐溫80 ；該菌株的氧化酶、過氧化氫酶、脲酶為陽 性，DNA酶為陰性；該菌能使硝酸鹽還原，但不具有亞硝酸鹽還原能力；該菌能利用D-阿拉 伯糖、D-纖維二糖、乳糖、酪氨酸、L-天冬酰胺作為唯一碳源和能源。仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Ns 2941對(duì)抗生素中的磺胺甲惡 唑、氯林霉素和萬古霉素敏感，而對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟鈉、頭孢噻酚鈉、環(huán)丙沙星、慶大霉 素、鏈霉素、氨芐青霉素、克拉霉素、紅霉素、盤尼西林和四環(huán)素具有抗性。仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Ns 2941細(xì)胞中的脂肪酸主要包 括十六碳飽和脂肪酸(27. 1% )、十六碳《7c單不飽和脂肪酸(24. 0% )、十八碳《7c單不 飽和脂肪酸(21. 27% )、ω 8c-環(huán)式十九碳飽和脂肪酸(8. 0% )和3_羥基十二碳飽和脂肪 酸，并含有少量的十二碳飽和脂肪酸(3.84% )和十碳飽和脂肪酸(2.79% )；主要呼吸醌 為泛醌Q9。仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis)A-1CGMCC Ns 2941 的 G+C 摩爾百分含 量為67. ；該菌株16S rRNA基因序列的GenBank登錄號(hào)為EF421176，與鹽單胞菌屬 的模式菌株期望鹽單胞菌DSM 9502T (Halomonas desiderata DSM 9502τ)、壁生鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789T)、潘泰萊里亞鹽單胞菌 DSM 9661T (Halomonas pantelleriensis DSM 9661τ)和坎帕尼亞鹽單胞菌 DSM15293T (Halomonas campaniensis DSM 15293τ)的16S rRNA基因序列同源性分別為96. 0%、95. 6%、95. 5%和95. 3%，與鹽單 胞菌屬其它菌株的16S rRNA基因序列相似性低于95%。仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis)A-ICGMCC Na 2941 與壁生鹽單 胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789τ)和潘泰萊里亞鹽單胞菌 DSM9661T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661T)的 DNA 雜交同源性都很低，分別為18%和 18% ；同時(shí)，該菌株的生理生化特性、細(xì)胞壁脂肪酸組成也與上述模式菌株有明顯差異，說 明仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Ns 2941是鹽單胞菌屬的一個(gè)新菌種。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降解多環(huán)芳烴的方法。本發(fā)明所提供的降解多環(huán)芳烴的方法，是用所述仙河鹽單胞菌 (Halomonasxianhensis)A-ICGMCC Na 2941對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理，使多環(huán)芳烴得到降解。上述方法中，所述多環(huán)芳烴為菲、蒽或熒蒽。以仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Na 2941為活性成分制備的生 物制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Ns 2941是鹽單胞菌 屬的新菌種，分離自石油污染的高鹽環(huán)境，能夠降解菲、蒽或熒蒽等多種多環(huán)芳烴，并利用 菲、蒽或熒蒽作為生長的唯一碳源。在鹽度為5%、加有0.5%酵母粉的液體培養(yǎng)基中，10 天內(nèi)能將100mg/L的菲全部降解，平均降解速率達(dá)IOmg/(L · d)；同時(shí)該菌株能夠在高鹽度 (27.5%)和較寬的鹽度范圍內(nèi)(0.05 27. 5%)生長，屬于中度嗜鹽細(xì)菌類，對(duì)控制鹽環(huán) 境中多環(huán)芳烴的污染有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，尤其適合高鹽環(huán)境以及鹽濃度變化較大的環(huán)境。本發(fā) 明的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Na 2941可用于多環(huán)芳烴的降解。下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對(duì)本發(fā)明的限 制。


圖1為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941在掃描電子顯微 鏡下的形態(tài)照片圖2為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941在透射電子顯微 鏡下的形態(tài)照片圖 3 為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941 的 16S rRNA 基 因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析4為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941對(duì)菲的降解曲線 圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1、仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCCNa 2941的分離及鑒定一、采用醋酸-硝酸混合纖維素膜平板法分離菌株海鹽合成培養(yǎng)基(SSDM)的組成為=NaCl79. 45g/L、MgCl2 · 6H20 6. 9g/L、 MgSO4 ·7Η20 10. 45g/L、CaCl2 · 7Η20 0. 75g/L、KCl 2. lg/L,NaHCO3 0. lg/L,NaBrO. 25g/L、微 量元素溶液lmL/L ；以上各成分的含量對(duì)應(yīng)鹽度為10%的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的鹽度等于培養(yǎng) 基中各無機(jī)鹽組分質(zhì)量之和除以培養(yǎng)基的體積)，其它鹽度的培養(yǎng)基可按此比例進(jìn)行配制； 另含有(NH4)2SO4 4.0g/L，其余為水；采用5M KOH濃縮液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7. 5。其中，微量元素溶液的組成為=Ca(NO3)2 · 4H20800mg/L、FeSO4. 7H20 400mg/L、CuSO4 · 5H20 80mg/L、 ZnSO4 · 7H20 40mg/L、MnSO4 · 4H20 40mg/L、NaMO4 · 2H20 8mg/L、H3BO3 6mg/L、K2HPO4 500mg/ L，其余為水。將菲、蒽和熒蒽分別溶解于乙醚中，分別配制成濃度為lmg/mL的菲溶液、蒽溶液 和熒蒽溶液。 在鹽度為5%的上述海鹽合成培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分含量為1. 5 1. 8%的瓊脂 糖后，0. 06MPa條件下滅菌20min，隨后趁熱將培養(yǎng)基均勻傾倒于玻璃培養(yǎng)皿中，等培養(yǎng)基 凝固后，放置于37°C環(huán)境中，使固體培養(yǎng)基表面的水分完全蒸發(fā)。隨后在平板培養(yǎng)基的表面 覆上已滅菌的醋酸_硝酸混合纖維素膜(微孔濾膜，孔徑0. 45 μ m、直徑90mm，購自北京經(jīng) 科宏達(dá)生化試劑生物技術(shù)公司)，在膜上分別加ImL上述配制的濃度為lmg/mL的菲的乙醚 溶液、蒽的乙醚溶液或熒的乙醚溶液并涂布均勻，待乙醚完全揮發(fā)后，蓋好平板待用。同時(shí) 將ImL不含菲、蒽或熒蒽的乙醚涂布在上述纖維素膜平板上作為空白對(duì)照。將采自山東省東營市仙河鎮(zhèn)勝利油田的土壤樣品加入到鹽度為5%的上述海鹽合 成培養(yǎng)基中，常溫條件下200r/min振蕩30min ；吸取ImL懸浮液于離心管中，5000r/min離 心IOmin ；棄去上清液，再加入相同體積的鹽度為5%的上述海鹽合成培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌。以 上洗滌過程重復(fù)3次，再將菌體沉淀進(jìn)行一系列梯度稀釋后分別涂布在上述含有菲、蒽或 熒蒽的醋酸_硝酸混合纖維素膜平板上，將涂布后的平板置于30°C條件下靜置培養(yǎng)15天。 實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。結(jié)果表明，空白對(duì)照平板上沒有任何菌落生長，說明沒有外加菲、蒽或熒蒽作為碳 源的平板上，土壤樣本中的微生物無法生長；相應(yīng)的，在加有菲、蒽或熒蒽的平板上有菌株 能夠生長，說明這些單菌落對(duì)應(yīng)的菌株能夠降解菲、蒽或熒蒽并以菲、蒽或熒蒽為唯一碳源 生長。挑取能夠降解菲的單菌落A-I作進(jìn)一步研究。二、菌株的形態(tài)特征SSDMY培養(yǎng)基的配制在鹽度為5%的上述步驟一的海鹽合成培養(yǎng)基中加入酵母 粉，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為5. 0g/L，0. 06MPa條件下滅菌20min。將上述步驟一分離得到的菌株A-I接種至SSDMY培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生 長后期，菌落大小穩(wěn)定后，進(jìn)行單菌落平均狀態(tài)的描述。主要包括菌落的大小、顏色、透明 度、濕潤度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī) 貝U、放射狀等)。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形 態(tài)，結(jié)果如圖1和圖2所示；同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，于40X 100倍的光學(xué)顯微鏡下觀察菌體 細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果表明，上述步驟一篩選到的菌株的菌落直徑為2 4mm，呈圓形、光滑、隆起、 黃色、有光澤、邊緣整齊；在電子顯微鏡下觀察，菌體細(xì)胞呈桿狀、無鞭毛，沒有運(yùn)動(dòng)性，大小 為(1. 15 1. 40) μ mX (0· 50 0. 63) μ m。三、菌株的生長特性上述步驟一篩選到的菌株屬于革蘭氏陰性、好氧細(xì)菌。該菌株最適生長PH值是 7. 2，可生長pH范圍是5. 5 9. 0 ；最適生長溫度為30°C，可生長的溫度范圍為10 42°C。 該菌株屬于中度嗜鹽細(xì)菌，能在0. 05 27. 5%的鹽度范圍內(nèi)進(jìn)行生長繁殖，適宜生長鹽范圍度為4 10%。四、菌株的生化特征1、碳源利用以SSDM為基本培養(yǎng)基，另包括以Biolog通用的95種碳源的糖、醇、酸作為唯一碳源，檢查菌株細(xì)胞的生長。2、糖類產(chǎn)酸糖類產(chǎn)酸培養(yǎng)基的組成為(NH4)2HPO4lg/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、KCl 0. 2g/L、 酵母浸膏0. 2g/L、糖或醇類10g/L，pH7. 2 7. 5 ；上述培養(yǎng)基配好后，加入質(zhì)量百分含量為 2%的溴百香里蘭，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為lmL/L。在糖類產(chǎn)酸培養(yǎng)基中分別加入D-半乳糖、海藻糖、D-葡萄糖、甘露糖、D-術(shù)糖、 D-果糖、麥芽糖和蔗糖，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為1%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH為7.5 ；再在每 升培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分含量為1. 6%的溴甲酚紫水溶液1 2mL，該指示劑的變色范圍為 pH4.5(黃色) 7.0(紫色)。將上述步驟一篩選到的菌株接種于上述培養(yǎng)基中后，35°C培 養(yǎng)24h后開始觀察培養(yǎng)基的顏色。以不接種上述步驟一篩選到的菌株的試管為陰性對(duì)照。 培養(yǎng)基顏色變黃色者為產(chǎn)酸陽性菌株，陰性反應(yīng)要連續(xù)觀察7 14d。3、淀粉水解肉湯培養(yǎng)基的組成為牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L。在肉湯培養(yǎng)基中加入可溶性淀粉，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為0.2%。將上述步驟 一篩選到的菌株點(diǎn)接于上述培養(yǎng)基平板上(每個(gè)平板點(diǎn)接5株)，35°C培養(yǎng)2 5d形成菌 苔后，在平板上滴加Lugal氏碘液(同革蘭氏染色的碘液)，使碘液覆蓋在平板表面。如在 菌苔周圍或菌苔下(將菌苔移去后觀察)的培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)橥该鳎瑒t為淀粉水解陽性菌 株；若菌苔下和菌苔周圍的培養(yǎng)基都為深藍(lán)色，說明該菌株為淀粉水解陰性。4、明膠水解明膠水解培養(yǎng)基的組成為蛋白胨5g/L、明膠100 150g/L，pH7. 2 7. 4。將明膠水解培養(yǎng)基調(diào)pH為7. 2 7. 4，分裝于試管中，使管中培養(yǎng)基的高度約為 4 5cm。取上述步驟一篩選到的菌株穿刺接種于上述培養(yǎng)基中，20°C培養(yǎng)2d后觀察結(jié)果。 為判斷陰性結(jié)果，需培養(yǎng)3 4周。若培養(yǎng)基部分或者全部變成可流動(dòng)的流體，則為明膠水 解陽性菌株；若仍為固態(tài)，則說明是明膠水解陰性菌株。5、吐溫80水解在鹽度為5%的SSDMY培養(yǎng)基中加入吐溫80，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為1%，將 上述步驟一篩選到的菌株接種于上述培養(yǎng)基中，每個(gè)平板點(diǎn)接3 5株，35°C培養(yǎng)2 4d， 菌落周圍有白色暈圈出現(xiàn)為陽性反應(yīng)。6、氧化酶活性將上述步驟一篩選到的菌株接種在SSDMY固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)24h。在一干凈 的培養(yǎng)皿內(nèi)放一張“新華1號(hào)”定性濾紙，滴加質(zhì)量百分含量為的四甲基對(duì)苯二胺鹽酸 鹽溶液使濾紙浸濕，用竹簽挑取菌苔，在濾紙上畫線。Irnin之內(nèi)濾紙變紫色者為陽性反應(yīng)， 反之為陰性反應(yīng)。7、過氧化氫酶活性將上述步驟一篩選到的菌株接種于SSDMY固體培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)24h，在菌苔上加入數(shù)十滴體積百分含量為3%的H2O2溶液，立即檢查結(jié)果。在5min之內(nèi)出現(xiàn)氣泡者為陽性反應(yīng)，但是往往立即出現(xiàn)氣泡，個(gè)別菌株也會(huì)在Imin之內(nèi)出現(xiàn)氣泡；無氣泡出現(xiàn)者 為陰性反應(yīng)。8、DNA 酶活性提取上述步驟一篩選到的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941的DNA，在鹽度為5%的SSDMY培養(yǎng)基中分別加入上述DNA和甲苯胺蘭 (Toluid-blue)，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為2%。和0. 1%。，將上述步驟一篩選到的菌 株接種于上述培養(yǎng)基中，每個(gè)平皿點(diǎn)接3 5株，35°C培養(yǎng)2 4d，如果菌落周圍有粉紅色 暈圈出現(xiàn)則為反應(yīng)陽性，反之為陰性。9、脲酶活性在鹽度為5%的SSDMY培養(yǎng)基中加入酚紅，調(diào)節(jié)pH值，使溶液呈橙黃色，0. 06MPa 滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至40 50°C時(shí)加入過濾除菌的尿素溶液，使其在培養(yǎng)基中的終 濃度為2%，制作試管斜面。將上述步驟一篩選到的菌株劃線接種于上述試管斜面上，35°C 培養(yǎng)2 4d后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變成粉紅色為陽性，反之為陰性反應(yīng)。10、硝酸鹽還原反應(yīng)硝酸鹽還原能力檢測(cè)培養(yǎng)基的組成為蛋白胨10g/L、琥珀酸鈉10g/L、NaN03lg/L、 K2HPO4 lg/L, MgSO4 0.5g/L、KCl 0. 2g/L ;ρΗ7· 2。將上述步驟一篩選到的菌株接種于上述培養(yǎng)基中，分別在接種2、5和7d后檢查硝 酸鹽還原情況，以不接種上述步驟一篩選到的菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。具體檢查方法如下在白色比色皿中加入1滴含有上述步驟一篩選到的菌株的菌 液，再加入Griess試劑A、B各1滴，如出現(xiàn)粉紅、玫瑰紅、橙色或棕色，則表明硝酸鹽被還原 成亞硝酸；如加入Griess試劑后無顏色變化，可加入二苯胺試劑3 5滴，若出現(xiàn)藍(lán)色反 應(yīng)，說明培養(yǎng)液中的硝酸鹽依然存在，則該菌為硝酸鹽反應(yīng)陰性；如果加入二苯胺試劑后無 任何顏色出現(xiàn)，說明亞硝酸鹽被進(jìn)一步分解為其他產(chǎn)物，為硝酸鹽反應(yīng)陽性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述步驟一篩選到的菌株不能利用蔗糖、麥芽糖、α -乳糖和 D-木糖產(chǎn)酸，可利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖產(chǎn) 酸；該菌株不能水解吐溫80、明膠和可溶性淀粉；該菌株有氧化酶、過氧化氫酶、脲酶和硝 酸鹽還原的活性，但是沒有DNA酶、亞硝酸還原的活性；該菌株能利用D-阿拉伯糖、纖維二 糖、乳糖、酪氨酸、L-天冬酰胺作為唯一碳源和能源。五、抗生素抗性上述步驟一篩選到的菌株對(duì)抗生素中的磺胺甲惡唑、氯林霉素和萬古霉素敏感； 而對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟鈉、頭孢噻酚鈉、環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、克拉霉 素、紅霉素、盤尼西林和四環(huán)素具有抗性。六、與鹽單胞菌屬模式菌株生理生化特征的比較將上述步驟一篩選到的菌株的生理生化特征與鹽單胞菌屬模式菌 株的生理生化特征相比較，結(jié)果如表1所示。其中，潘泰萊里亞鹽單胞菌DSM 9661T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661τ)和壁生鹽單胞菌 DSMZ 14789T(Halomonas muralisDSMZ 14789τ)均來自德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Culture, DSMZ)。
表1篩選得到的菌株與鹽單胞菌屬模式菌株的生理生化特征比較 表1中，+表示結(jié)果為陽性，-表示結(jié)果為陰性，ND表示未檢測(cè)，W表示反應(yīng)較弱。七、菌株的細(xì)胞化學(xué)成分分析
1、呼吸醌的檢測(cè)(1)取質(zhì)量大于Img的上述步驟一篩選到的菌株，10000r/min離心lOmin，用30mL 質(zhì)量百分含量為的NaCl溶液洗滌菌體，離心。(2)將上述步驟(1)得到的菌體沉淀轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加入質(zhì)量百分含量為 的NaCl溶液IOmL和由氯仿-甲醇組成的混合液(氯仿和甲醇的體積比為2 l)20mL,
振蕩均勻直至菌體分散，4°C 10000r/min離心lOmin。(3)離心后樣品分三層，上層是水，中層是殘?jiān)?，下層是氯?脂溶性成分)，用 滴管小心去除上層水層，將下層氯仿層轉(zhuǎn)移至IOOmL茄形瓶中。(4)再次用20mL由氯仿-甲醇組成的混合液(氯仿和甲醇的體積比為2 1)對(duì) 中間混層進(jìn)行萃取，振蕩30min以上，4°C 10000r/min離心lOmin，小心將氯仿層轉(zhuǎn)移合并 至上述步驟(3)的IOOmL茄形瓶中，重復(fù)萃取殘?jiān)^程1次，合并萃取液。(5)將萃取液合并在IOOmL茄形瓶中，40°C水浴，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干后，在茄 形瓶中加入20mL正己烷，搖床振蕩30min，用滴管轉(zhuǎn)移至50mL離心管中。(6)加入IOmL純水于離心管中，劇烈振蕩清洗兩次，小心移出上層溶液至IOOmL茄 形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干后，加入20mL正己烷溶解(此步注意不要引入水)。(7)將兩個(gè)S印-Park Plus Silica連接，用5mL正己烷沖洗小柱子，將上述步驟 (6)制備的樣品上柱，使流速控制在10-20滴/min以內(nèi)，再用20mL的正己烷以同樣流速洗 柱子。(8)采用含2%體積百分含量乙醚的正己烷洗脫液20mL進(jìn)行洗脫，甲基萘醌類 (menaquinone)洗出液接入到50mL茄形瓶中；再用含10%體積百分含量乙醚的正己烷洗脫 液20mL進(jìn)行洗脫，泛醌(ubiquinone)洗出液接入到另一 50mL茄形瓶中。(9)將上述步驟(8)中的兩個(gè)樣品分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)掉溶劑，加入2_3mL丙 酮，小型搖床上搖動(dòng)數(shù)分鐘，最后分別轉(zhuǎn)移至保存管中(溶液顏色與樣品有關(guān))。(10)將保存管抽至真空，加入200uL丙酮，隨后采用高效液相色譜分析，采用C18反 相色譜柱，流動(dòng)相為甲醇和異丙醚的混合液(體積比9 2)。結(jié)果表明，上述步驟一篩選到的菌株主要以輔酶Q9(泛醌9)作為主要呼吸醌。2、脂肪酸檢測(cè)(1)溶液的配制溶液I 將45g氫氧化鈉溶于300mL甲醇的水溶液中(甲醇和水的體積比為 1:1);溶液II 將190mL比重為1. 19g/mL的濃鹽酸和275mL甲醇溶于135mL蒸餾水中；溶液III 將200mL正己烷與200mL乙醚混合均勻；溶液IV 將10. 8g氫氧化鈉溶于900mL蒸餾水中；溶液V 飽和的氯化鈉溶液(質(zhì)量百分含量為26. 5% )。(2)提取方法和步驟取適量上述步驟一篩選到的菌株的培養(yǎng)物置于SmL螺口玻璃管中，加入ImL溶液 I，擰緊螺蓋，沸水浴5min，取出振蕩5-lOs，再度擰緊螺蓋，繼續(xù)沸水浴25min ；待樣品冷卻后，加入2mL溶液II，擰緊螺蓋振蕩，隨后精確控制溫度為80士 1 °C，水 浴lOmin，冰浴冷卻；此步驟需嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間，以免羥基酸和環(huán)式脂肪酸受到破壞；
在冷卻的樣品管中加入1. 25mL溶液III，快速振蕩IOmin左右，棄去下層水相；在剩余的有機(jī)相中加入3mL溶液IV及幾滴溶液V，快速振蕩5min左右，取三分之 二的上層有機(jī)相置于氣相色譜樣品瓶中備用。(3)分析方法采用氣相色譜儀(HP 6890)，配備分流/不分流進(jìn)樣口，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)及氣相色譜化學(xué)工作站(HP Chemstation ver A 5. 01)；色譜柱為Ultra-2柱(長 25m,內(nèi)徑0. 2mm,液膜厚度0. 33 μ m)；爐溫為二階程序升溫起始溫度170°C，每分鐘升溫 5°C至260°C，隨后以40°C /min升溫至310°C，維持1. 5min ；進(jìn)樣口溫度250°C，載氣為氮?dú)猓?流速為0.5mL/min，分流進(jìn)樣模式，分流比100 1，進(jìn)樣量2 μ L ；檢測(cè)器溫度為300°C，氫氣 流速30mL/min，空氣流速216mL/min，補(bǔ)充氣(氮?dú)?流速30mL/min。結(jié)果表明，上述步驟一篩選到的菌株細(xì)胞壁脂肪酸中主要包括十六碳飽和脂 肪酸(27. 1%)、十六碳《7c單不飽和脂肪酸(24.0%)、十八碳《7c單不飽和脂肪酸 (21.27% ω 8c-環(huán)式十九碳飽和脂肪酸(8.0%)和3_羥基十二碳飽和脂肪酸，還含有 少量的十二碳飽和脂肪酸(3. 84% )和十碳飽和脂肪酸(2. 79% )。將該菌細(xì)胞壁中脂肪酸組成與潘泰萊里亞鹽單胞菌DSM 9661T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661τ)和壁生鹽單胞菌 DSMZ 14789T(Halomonas muralisDSMZ 14789τ)進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。表2篩選得到的菌株與鹽單胞菌屬模式菌株的脂肪酸組成比較 八、菌株的16S rRNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析提取上述步驟一篩選到的菌株的總DNA，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，正向引物 為 5 ‘ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘，反向引物為 5 ‘ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為先94°C 6min;然后94°C 45s，54°C 45s, 72°C 90s，共30個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后連接到T-Easy載體上，送英俊生物有限公 司進(jìn)行測(cè)序；采用Clustal X程序(1. 64b)，系統(tǒng)發(fā)育分析通過MEGA (2. 1)軟件采用近鄰結(jié) 合法和最大簡約法分析。
結(jié)果表明，上述步驟一篩選到的菌株的16S rRNA基因序列如GenBankAccession No. EF421176所示，其16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析圖如圖3所示。根據(jù)其16S rRNA基因序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果判定，上述步驟一篩選到 的菌株屬于鹽單胞菌屬(Halomonas)，并且與鹽單胞菌屬的模式菌株期望鹽單胞菌DSM 9502T (Halomonas desiderata DSM 9502τ)、壁生鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789T)、潘泰萊里亞鹽單胞菌DSM 14789T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661τ)和 坎帕尼亞鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonascampaniensis DSM 15293τ)的 16S rRNA 基因序 列的同源性分別為96.0%,95. 6%,95. 5%和95. 3%，與鹽單胞菌屬其它菌株的16S rRNA 基因序列的相似性低于95%。九、與鹽單胞菌屬模式菌株的DNA-DNA雜交分析1、菌體細(xì)胞基因組DNA純度的測(cè)定提取上述步驟一篩選到的菌株的總DNA，取10 μ L DNA樣品于1. 5mL離心管中，力口 入190 μ L 0. 1 X SSC溶液進(jìn)行溶解，使總體積為200 μ L，即將DNA樣品稀釋20倍，用槍吸打 數(shù)次，將DNA樣品混勻、打碎。用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)量260nm、280nm、230nm和270nm時(shí) 的紫外吸收值，適合做DNA/DNA雜交實(shí)驗(yàn)的DNA樣品必須符合以下條件0D(260nm)/0D(280nm) > 1. 8，說明蛋白質(zhì)含量符合要求；OD (260nm) /OD (230nm) > 2. 0，說明糖含量符合要求；OD (260nm) > OD (270nm)，說明酚含量符合要求。2、G+C摩爾百分含量的測(cè)定采用熱變性溫度法測(cè)定DNA樣品的G+C摩爾百分含量，儀器包括紫外分光光度計(jì) (Lambda Bio 20型)、溫度控制儀(PTP-I)、循環(huán)水浴。整個(gè)測(cè)定過程由UV Winlab軟件控 制。具體測(cè)定過程如下(I)Tm值的測(cè)定將上述DNA樣品用0. IX SSC溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使其吸光度為0. 2 0. 5 ；依次 打開UV Winlab軟件中的DNADEF. MTD窗口和PE Applications軟件中的Templab窗口設(shè) 定合適的參數(shù)，然后開始測(cè)定。在兩個(gè)比色杯中各加入ImL 0. 1 X SSC溶液，將比色杯放入比色架內(nèi)，根據(jù)計(jì)算機(jī) 的提示進(jìn)行儀器的調(diào)零；然后將比色杯取出，加入200 μ L上述稀釋好的DNA樣品溶液，插入 溫度傳感器探頭，將比色杯放回可加熱的比色架內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)控制溫控儀升溫，在30min 內(nèi)使樣品溫度由70°C均勻的上升到90°C，其間記錄DNA樣品在260nm處的吸光值，得到DNA 樣品的變性曲線。測(cè)定結(jié)束后，利用計(jì)算機(jī)相關(guān)軟件計(jì)算出變性曲線的一階導(dǎo)數(shù)曲線，記錄 一階導(dǎo)數(shù)曲線峰值所對(duì)應(yīng)的溫度，即為DNA樣品的解鏈溫度，即Tm值。(2) DNA的G+C摩爾百分含量的計(jì)算如果DNA的G+C摩爾百分含量值在25 % 75 %的范圍內(nèi)，其Tm值與DNA的G+C 摩爾百分含量之間呈線形關(guān)系。為消除溫度誤差及其他實(shí)驗(yàn)誤差，需用大腸桿菌K12菌株 (購自北京經(jīng)科宏達(dá)生化試劑生物技術(shù)公司)的DNA作為參照。在0.1 XSSC溶液中，G+C 摩爾百分含量的計(jì)算公式為DNA 的 G+C 摩爾百分含量=51. 2+2. 08 X [Tm(X)-Tm(R)]。其中，Tm⑴為上述步驟一篩 選到的菌株的Tm值；Tm(R)為大腸桿菌K12菌株的Tm值。3、DNA-DNA 雜交試驗(yàn)(I)DNA樣品的剪切用于DNA-DNA雜交的樣品濃度要求A26tl (260nm吸光度)大于 2. 0 (約100 μ g/mL)。先將上述步驟一篩選到的菌株的DNA用0. 1 X SSC調(diào)到A26tl = 2. 0左 右，為使樣品的濃度一致，要求各樣品的A26tl值的差異小于0. 1。取3mL上述步驟一篩選到的 菌株的DNA置于5mL離心管中，加入0. 72mL 10 X SSC溶液，使緩沖液的終濃度為2 X SSC。用 超聲波剪切DNA樣品，其輸出功率為6W，剪切的時(shí)間為4min，間隔時(shí)間為2s，重復(fù)3次。因超 聲波剪切時(shí)會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)?shù)臒崃?，可能?dǎo)致剪切的DNA樣品發(fā)生降解，因此在剪切過程中DNA 樣品應(yīng)置于冰上。剪切完畢后迅速將樣品按0. 6mL分裝在1.5mL離心管中，置于-20°C保存。 通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)樣品的剪切質(zhì)量。一般要求DNA片段的大小集中在2X IO5 5 X IO5Da (400 800bp)。(2) DNA變性將上述剪切過的DNA用0. IX SSC溶液精確配制成OD26tl為1. 5-2. 0， 根據(jù)公式T0R(最適復(fù)性溫度)=0. 51X (G+C摩爾百分含量)+47°C，計(jì)算TOR值，根據(jù)TOR 值設(shè)定溫度，預(yù)熱比色杯。(3)打開分光光度計(jì)和電腦，選擇合適的程序，固定波長為260nm，固定溫度為 T0R，用2 X SSC溶液調(diào)零，總時(shí)間為30min，每隔15s測(cè)一次吸光度值。(4)吸取200 μ L上述制備的DNA樣品，分別和200 μ L預(yù)備雜交的DNA (即同一屬 的模式菌株期望鹽單胞菌DSM 9502T (Halomonas desiderata DSM 9502τ)、壁生鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789T)、潘泰萊里亞鹽單胞菌 DSM 14789T (Halomonas pantelleriensis DSM 9661τ)和坎帕尼亞鹽單胞菌 DSM14789T (Halomonas campaniensis DSM 15293τ)的基因組DNA)混合，將上述DNA混合液分別加到1. 5mL離心管中，同時(shí)加 400 UL 10X SSC于另一離心管中，將上述離心管全部放入100°C水浴IOmin后，用預(yù)熱的槍 頭吸取96 μ L熱的10XSSC溶液加入到裝有上述DNA混合液的熱的離心管中，使其終濃度 為2X SSC,迅速吸取稀釋后的DNA混合溶液200 μ L加入到預(yù)熱到TOR溫度值的比色杯中， 測(cè)定吸光度，并做出復(fù)性曲線。(5)根據(jù)下面的公式計(jì)算雜交率 式中Va、Vb、Vm分別表示樣品A、B和混合樣品M(A+B)的復(fù)性速率。4、DNA-DNA雜交分析結(jié)果上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述步驟一篩選到的菌株的DNA與已發(fā)表的鹽單胞菌屬的模 式菌株潘泰萊里亞鹽單胞菌DSM 9661T(Halomonas pantelleriensis DSM 9661τ)和壁生鹽 單胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789τ)的 DNA 同源性都比較低，分別為 11 % 和18%。且該菌株的G+C摩爾百分含量為67. 1%，而潘泰萊里亞鹽單胞菌DSM 9661τ和壁 生鹽單胞菌DSM 14789τ的G+C摩爾百分含量分別為65. 0%和62. 4%。基于以上測(cè)定結(jié)果，將上述步驟一篩選到的菌株鑒定為仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-1，并于2009年3月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為 CGMCC Na 2941。
實(shí)施例2、仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1CGMCC Ns 2941 降解菲的性 能將菲溶于二甲基甲酰胺中，過濾除菌；在鹽度為5%的上述實(shí)施例1的海鹽合成培 養(yǎng)基中加入酵母粉，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為0. 5%，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入上述過濾除菌 的菲溶液，使菲在培養(yǎng)基中的終濃度為100mg/L。將仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-ICGMCC Ns 2941 按照 5% 的接種量接 入上述培養(yǎng)基中，在30°C、轉(zhuǎn)速為200r/min的好氧避光條件下培養(yǎng)10d。同時(shí)，以不加菲但 是加入二甲基甲酰胺的培養(yǎng)基作為對(duì)照，用于檢查仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC No 2941是否能利用二甲基甲酰胺；以不接種細(xì)菌的作為空白對(duì)照，用于扣除菲 揮發(fā)的影響；以接種仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis)A-ICGMCC Na 2941死菌體的作 為死菌對(duì)照，用于扣除菌體吸附的影響。培養(yǎng)過程中，定時(shí)取樣，利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定菲的降解率； Waters600E液相色譜儀，色譜柱為Supelcosil LC18-DB,流動(dòng)相(甲醇和水，體積比為 80 20)，流速 lmL/min，檢測(cè)波長 254nm。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。菲的降解曲線如圖4所示，結(jié)果表明，仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Na 2941在10天內(nèi)能將100mg/L的菲全部降解，對(duì)菲的平均降解速 率可達(dá) IOmg/ (L · d)。實(shí)施例3、仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941 降解蒽的性 能將蒽溶解于乙醚中，配制成為濃度為lmg/mL的溶液。在鹽度為5%的上述海鹽合成培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分含量為1. 5 1. 8%的瓊脂 糖后，0. 06MPa條件下滅菌20min，隨后趁熱將培養(yǎng)基均勻傾倒于玻璃培養(yǎng)皿中，等培養(yǎng)基 凝固后，放置于37°C環(huán)境中，使固體培養(yǎng)基表面的水分完全蒸發(fā)。隨后在平板培養(yǎng)基的表面 覆上已滅菌的醋酸_硝酸混合纖維素膜(微孔濾膜，孔徑0. 45 μ m、直徑90mm，購自北京經(jīng) 科宏達(dá)生化試劑生物技術(shù)公司)，在膜上加ImL上述配制的濃度為lmg/mL的蒽的乙醚溶液 并涂布均勻，待乙醚完全揮發(fā)后，蓋好平板待用。同時(shí)將不含蒽的乙醚涂布在上述纖維素膜 平板上作為空白對(duì)照。將仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-ICGMCC Ns 2941 接種于 SSDMY 液體 培養(yǎng)基中，常溫條件下140r/min振蕩培養(yǎng)4天；吸取ImL菌懸液于離心管中，5000r/min離 心IOmin ；棄去上清液，將菌體沉淀涂布在上述含有蒽的醋酸-硝酸混合纖維素膜平板上， 將涂布后的平板置于30°C條件下靜置培養(yǎng)15天。結(jié)果表明，空白對(duì)照平板上沒有任何菌落生長，說明沒有外加蒽作為碳源的平板 上，仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941無法生長；相應(yīng)的，在加有蒽 的平板上仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941能夠生長，說明仙河鹽 單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941能夠降解蒽并以蒽為唯一碳源生長。實(shí)施例4、仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Ns 2941 降解熒蒽的 性能將熒蒽溶解于乙醚中，配制成為濃度為lmg/mL的溶液。
在鹽度為5%的上述海鹽合成培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分含量為1. 5 1. 8%的瓊脂 糖后，0. 06MPa條件下滅菌20min，隨后趁熱將培養(yǎng)基均勻傾倒于玻璃培養(yǎng)皿中，等培養(yǎng)基 凝固后，放置于37°C環(huán)境中，使固體培養(yǎng)基表面的水分完全蒸發(fā)。隨后在平板培養(yǎng)基的表面 覆上已滅菌的醋酸_硝酸混合纖維素膜(微孔濾膜，孔徑0. 45 μ m、直徑90mm，購自北京經(jīng) 科宏達(dá)生化試劑生物技術(shù)公司)，在膜上加ImL上述配制的濃度為lmg/mL的熒蒽的乙醚溶 液并涂布均勻，待乙醚完全揮發(fā)后，蓋好平板待用。同時(shí)將不含熒蒽的乙醚涂布在上述纖維 素膜平板上作為空白對(duì)照。將仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-1CGMCC Ns 2941 接種于 SSDMY液體培 養(yǎng)基中，常溫條件下140r/min振蕩培養(yǎng)4天；吸取ImL菌懸液于離心管中，5000r/min離心 IOmin ；棄去上清液，將菌體沉淀涂布在上述含有熒蒽的醋酸-硝酸混合纖維素膜平板上， 將涂布后的平板置于30°C條件下靜置培養(yǎng)15天。結(jié)果表明，空白對(duì)照平板上沒有任何菌落生長，說明沒有外加熒蒽作為碳源的平 板上，仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2941無法生長；相應(yīng)的，在加有 熒蒽的平板上仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Ns 2941能夠生長，說明仙 河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Ns 2 941能夠降解熒蒽并以熒蒽為唯一碳 源生長。
權(quán)利要求
仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1，其保藏登記號(hào)為CGMCC№2941。
2.仙河鹽單胞菌(Halomonasxianhensis) A-1CGMCC Ns 2941在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述多環(huán)芳烴為菲、蒽或熒蒽。
4.一種降解多環(huán)芳烴的方法，是用權(quán)利要求1所述仙河鹽單胞菌 (Halomonasxianhensis)A-lCGMCC No 2941對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理，使多環(huán)芳烴得到降解。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述多環(huán)芳烴為菲、蒽或熒蒽。
6.一種降解多環(huán)芳烴的生物制劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述仙河鹽單胞菌 (Halomonas xianhensis)A-1CGMCC Ns2941。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物制劑，其特征在于所述多環(huán)芳烴為菲、蒽或熒蒽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可降解多環(huán)芳烴的鹽單胞菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1CGMCC№2941是鹽單胞菌屬的新菌種，分離自石油污染的高鹽環(huán)境，能夠降解菲、蒽或熒蒽等多種多環(huán)芳烴，并利用菲、蒽或熒蒽作為生長的唯一碳源。在鹽度為5％、加有0.5％酵母粉的液體培養(yǎng)基中，10天內(nèi)能將100mg/L的菲全部降解，平均降解速率達(dá)10mg/(L·d)；同時(shí)該菌株能夠在高鹽度(27.5％)和較寬的鹽度范圍內(nèi)(0.05～27.5％)生長，屬于中度嗜鹽細(xì)菌類，對(duì)控制鹽環(huán)境中多環(huán)芳烴的污染有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，尤其適合高鹽環(huán)境以及鹽濃度變化較大的環(huán)境。本發(fā)明的仙河鹽單胞菌(Halomonas xianhensis)A-1CGMCC№2941可用于多環(huán)芳烴的降解。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101838616SQ20091008001
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日
發(fā)明者寧大亮, 王慧, 趙百鎖 申請(qǐng)人:清華大學(xué)