專利名稱：一段dna分子、含有該dna分子的重組表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一段DNA分子、含有該DNA分子的重組表達載體及其應用。
背景技術：
小麥低分子量谷蛋白占胚乳貯藏蛋白含量的40%，古谷蛋白含量的60-70%, 是胚乳中含量最豐富的蛋白質組成成分，在面團中起"骨架"的作用，并賦予面包、 面條以及其他專用食品所需的粘彈性，對小麥品質有重要作用。由于小麥低分子量 谷蛋白在組成上具有高度的異質性和復雜性，分離、分析比較困難，加上目前尚不 成熟的生物學鑒定技術，嚴重制約了人們對低分子量谷蛋白的研究。
迄今為止，已經從小麥及其近緣種中克隆到至少80個具有完整編碼框的低分 子量谷蛋白基因，由于亞基鑒定及分離極其困難，甚至不可行，g能根據(jù)不完善的 理論推測基因的功能。實驗證明，這種方法是不可靠的，容易對生產實踐造成誤導。 因此必須采用實驗手段對低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)的結構與功能進行鑒定。
低分子量谷蛋白亞基結構與功能的鑒定是建立在分離到單個亞基的基礎之上， 目前有兩種分離低分子量谷蛋白亞基的方法第一種方法是利用SDS-PAGE、 2-DE 和MS技術，先將低分子量谷蛋白基因編碼的亞基鑒定出來(Lietal., Cloning and characterization of a novel at the G7w-J3 locus from wild emmer wheat (JW",cwm f"rg/(iwm L. var. cfcocco/cfes). Euphytica. 2008. 159:181-190.)，再通過SDS-PAGE多 次回收，富集目的亞基。這種方法的工作量大、程序繁瑣、耗費大，且分離到的亞 基不純(實驗證明SDS-PAGE上的單一蛋白條帶往往被2-DE分離出多個蛋白質組 分)。第二種方法是利用體外表達體系，將克隆到的低分子量谷f白亞基基因表達 出來， 一方面利用誘導蛋白將胚乳中的內源蛋白亞基鑒定出來(Li etal., Molecular cloning, heterologous expression, and phylogenetic analysis of a novel y-type HMW glutenin subunit gene from the G genome of 7h'"c簡"wo/ / eev/. Genome. 2007. 50:1130-1140.);另一方面，直接富集誘導蛋白用于亞基功能鑒定(Xuetal., Functional properties of a new low-molecular-weight glutenin subunit gene from a bread wheat cultivar. Theor. Appl. Genet. 2006. 113:1295-1303)。與前者相比，這種方法操
作簡便、成本低廉、易操作、結果可靠。然而，制約該方法廣泛應用的瓶頸因素是:與一般真核基因相比，低分子量谷蛋白亞基基因由于其結構的復雜性，利用現(xiàn)有的 體外表達載體很難獲得穩(wěn)定的、高表達量的蛋白，而低表達量的蛋白又不足以用配 粉實驗鑒定它的功能以及進一步研究其分子結構。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一段DNA分子、含有該DNA分子的重組表達載體以及該載 體的應用。
本發(fā)明所提供的DNA分子，是如下l) -3)中任一所述的DNA分子
1) 由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；
2) 在嚴格條件下可與1)限定的DNA序列雜交且能促進目的基因轉錄和翻譯的 DNA分子；
3) 與l)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且能促進目的基因轉錄和翻 譯的DNA分子。
所述3)中的DNA分子，與l)的DNA分子最好有95X以上的同源性。
為了便于將所述DNA分子連入表達載體中，所述DNA分子的上游和下游還分別 包括一個酶切位點，所述DNA分子上游的酶切位點為AWeI酶切位點，所述DNA分 子下游的酶切位點為Wcol酶切位點。
為了使所述目的基因編碼的蛋白更容易檢測，所述DNA分子中還包括組氨酸編 碼序列，所述組氨酸編碼序列位于所述DNA分子和其下游的酶切位點之間。
上述DNA分子中還包括凝血酶酶切位點，用于將所述組氨酸編碼序列和所述 DNA分子切除；所述凝血酶酶切位點位于所述組氨酸編碼序列和其下游的酶切位點 之間。
具體的，所述DNA分子是如下1) -3)中任一所述的DNA分子
1) 由序列表中序列2所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；
2) 在嚴格條件下可與1)限定的DNA序列雜交且能促進目的基因轉錄和翻譯的 DNA分子；
3) 與l)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且能促進目加基因轉錄和翻 譯的DNA分子。
所述3)中的DNA分子，與l)的DNA分子最好有95X以上的同源性。 含有上述DNA分子的重組表達載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。 所述重組表達載體的出發(fā)載體為pET-30a，所述重組表達載體的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示。
含有上述重組表達載體的轉基因細胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。 所述重組菌是將所述重組表達載體導入大腸桿菌中得到的重組菌。 所述重組表達載體可用于促進目的基因的轉錄和翻譯。 所述目的基因具體可為低分子量谷蛋白亞基的編碼基因。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備低分子量谷蛋白亞基的方法。 本發(fā)明所提供的制備低分子量谷蛋白亞基的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)所述重組菌，得 到低分子量谷蛋白亞基。
目前，低分子量谷蛋白亞基基因的原核表達極其困難，存在表達效率低、表達 量低和不穩(wěn)定表達等致命問題，限制了低分子量谷蛋白亞基的應用。本發(fā)明克服了 低分子量谷蛋白亞基基因體外表達的難題，成功地在原核表達載體中表達了多個低 分子量谷蛋白亞基基因，且表達量足以達到用配粉實驗鑒定它的功能以及進一步研 究其分子結構。本發(fā)明獲得的重組表達載體不僅適用于低分子量谷蛋白亞基基因的 表達，還適用于用常規(guī)載體不能表達的、具有與低分子量谷蛋白亞基類似結構的特 殊基因的原核表達，同時也適用于其他普通基因的原核表達。這將為低分子量谷蛋 白亞基的結構與功能鑒定提供支持，對小麥的品質改良具有重要的現(xiàn)實意義。


圖1為人工合成的促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子的結構示意圖。
圖2為重組表達載體的結構示意圖。
圖3為SDS-PAGE鑒定JwZJWf-m7的表達。
圖4為SDS-PAGE和Western-blot驗證Zj;丄M^-m7和Zy丄M^-m2的表達。 圖5為重組表達載體表達水平的鑒定。
具體實施例方式
下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物 材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。 實施例1、重組表達載體的構建 1、 DNA分子的合成
人工合成一段DNA分子，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示(即 序列表中序列3的自5'末端第5079-5184位)。序列表中序列2的自5'末端第 1-6位為酶切位點，第7-63位為促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子(其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示)，第64-81位為組氨酸編—碼序列，第82-99 位為凝血酶酶切位點，第100位為消除移碼突變而添加的一個堿基，第101-106位 為A^oI酶切位點。所合成的DNA分子的結構示意圖如圖l所示。其中，l為A^el 酶切位點，2為促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子，3為組氨酸編碼序列，4為凝 血酶酶切位點，5為為了消除移碼突變而添加的一個堿基G， 6為A^oI酶切位點。
AWeI和Wcol酶切位點可以確保將促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子準確地 插入到pET-30a載體中；組氨酸編碼序列用于檢測目的基因編碼蛋白的可靠性；凝 血酶酶切位點用于將組氨酸編碼序列和目的基因切除，以獲得完整插入序列的目的 基因編碼蛋白。
2、重組表達載體的構建
將上述步驟1合成的DNA分子與pMD19-T克隆載體相連接，i6'C保溫30分鐘 獲得重組載體。將獲得的重組載體轉入大腸桿菌DH-5a的感受態(tài)細胞中，得到重組 菌。將獲得的重組菌用下列引物進行菌落PCR擴增
F弓I物5 ，陽CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ，；
R弓I物5 ，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ，。
檢測重組載體中插入片段的長度，篩選出含有目的基因(步驟1中合成的DNA 分子)長度的插入片段的陽性克隆。
挑取含有目的基因的單菌落接種于含有80nl/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 t:培養(yǎng)過夜。將菌液移至1.5ml的離心管中，12000rpm離心2分鐘，棄上清，收集 菌體。提取質粒進行測序，測序結果表明，該質粒的序列與設計65序列完全相符。
將測序結果正確的質粒用AWeI和TVcoI進行雙酶切，回收酶切產物與用相同 酶切的質粒pET-30a相連接，獲得重組表達載體EP-1，將該重組表達載體EP-1轉 化大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細胞。提取質粒進行測序，測序結果表明，所獲得的重組 表達載體EP-1的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示。該重組表達載體EP-1 的結構示意圖如圖2所示。其中，1為T7啟動子，2為Lac操縱子，3為7V^ I酶 切位點，4為促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子，5為組氨酸編碼序列，6為凝血 酶酶切位點，7為為了消除移碼突變而添加的一個堿基G， 8為A^oI酶切位點，9 為多克隆位點，IO為終止密碼子，11為T7終止子。
實施例2、 LMW-GS基因爿附丄MF-w/的表達與鑒定
以克隆自尾狀山羊草PI254863中的基因Jm丄M^-m/為材料，,、對上述實施例1
7獲得的重組表達載體EP-1的有效性作初步驗證，同時以不含有上述實施例1中步 驟1合成的DNA分子的質粒pET-30a作為對照。
提取尾狀山羊草PI254863的基因組DNA并以其為模板，對4m丄MfT-m7基因 (v4w丄MT-w/基因在NCBI基因庫的登錄號為EU329425)進行PCR擴增。設計引 物去掉信號肽，并在Forward和Reverse引物的5'端分別加上五coRI和J^o I酶切 位點，使擴增片段能插入正確的閱讀框，引物序列如下
Forward: 5，-ACAGAATTCATGGAGACTAGCTGC-3，，
Reverse: 5 ，-AAACTCGAGGTAGGCACCAACTC-3 ，。
將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA凝膠純化回收試劑盒(購 自Takara公司)將特異性條帶純化回收。將回收的PCR產物用￡coR I和Wo I迸 行雙酶切，酶切產物分別與用相同酶切的上述實施例1獲得的重組表達載體EP-l 和用相同酶切的質粒pET-30a按照3: 1的質量比混合，加入T4 DNA連接酶(購 自Promega公司)，4 °C連接過夜。 "'
取上述連接產物，分別轉化大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選和卡 那霉素(Kana)抗性篩選。分別挑取白色單菌落接種于含又Kana(10ug/ml)的LB培養(yǎng) 基中，37'C培養(yǎng)過夜，堿裂解法小量制備質粒，取質粒分別進行酶切鑒定(五^RI 和I),以確定Jw丄M^-w7基因己分別連接到表達載體EP-1和pET-30a上， 將獲得的重組表達載體分別命名為EP-1-Jm丄M^-wJ和pET-30a-^w丄M^-w/。
將上述重組表達載體EP-l-Jw丄AW-mJ和pET-30a-Jm丄MJf-w7分別轉化大腸 桿菌BL-21 (DE3)感受態(tài)細胞，挑取白色單菌落接種于含Kana(10pg/ml)的LB培 養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，獲得飽和培養(yǎng)物；取飽和培養(yǎng)物100jnl加入到10ml含Kana(10ug/ml) 的LB培養(yǎng)基中，37。C條件下150rpm搖培約4小時，直至OD6。o=0.6，向其中加入 IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)，使其在菌液中終濃度為0.5mmol/L在相同條件下 繼續(xù)培養(yǎng)3小時。
上述誘導培養(yǎng)結束后，取1.8ml菌液于2.0 ml eppendorf離心管中，10000rpm 離心5min，去上清；加入12(Hil異丙醇，充分渦漩后，加入DTT，使其終濃度為 1%; 65。C水浴60min，然后12000rpm離心5min，取上清；再加入等體積的lxLoading buffer, 65'C水浴30min，取10^1進行SDS-PAGE電泳。
結果如圖3所示。其中，泳道l-3均為含有重組表達載體EP-l-^m丄M^-m/的 大腸桿菌中目的蛋白的檢測結果，泳道4為含有重組表達載體pET-30a- Jm丄MT-m/的大腸桿菌中目的蛋白的檢測結果。
實驗設三次重復，結果表明，重組表達載體EP-l-^m丄M^-m7中Jm丄AW-m/ 基因編碼的蛋白已經表達；而重組表達載體？￡丁-30&-^wZMT-m/中卻沒有 」m丄Mf-m7基因編碼蛋白的表達。
實施例3、 LMW-GS基因Zy丄MF-m7和Z_vZM^-m2的表達與鑒定
以來自面包小麥中優(yōu)9507中的基因Zy丄M^-m/和Zy丄M^-m2為材料，對上述 實施例1獲得的重組表達載體EP-1的有效性作進一步驗證，同時以不含有上述實 施例1中步驟1合成的DNA分子的質粒pET-30a作為對照。
提取面包小麥中優(yōu)9507的基因組DNA并以其為模板，分別對々AM^-基因 和ZjlMf-m2基因(Zy丄MFF-m/基因和Zj丄Mf-w2基因在NCBI基因庫的登錄號 分別為EU329426和EU329427)進行PCR擴增。設計引物去掉信號肽，并在Forward 和Reverse引物的5'端分別加上&0RI和Zto I酶切位點，使擴增片段能插入正確 的閱讀框，引物序列如下
Forward: 5，-ACAGAATTCATGGAGACTAGATGC腸3，，
Reverse: 5，-AAACTCGAGGTAGGCACCAACTC陽3，。 .'
將PCR擴增產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA凝膠純化回收試劑盒 (購自Takara公司)將特異性條帶純化回收。將回收的PCR產物分別用￡coR I和 屈ol進行雙酶切，酶切產物分別與用相同酶切的上述實施例1獲得的重組表達載 體EP-l和用相同酶切的質粒pET-30a按照3: 1的質量比混合，加入T4DNA連接 酶(購自Promega公司)，4'C連接過夜。
取上述連接產物，分別轉化大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選和卡 那霉素(Kana)抗性篩選。分別挑取白色單菌落接種于含又Kana(10ug/ml)的LB培養(yǎng) 基中，37'C培養(yǎng)過夜，堿裂解法小量制備質粒，取質粒分別進行酶切鑒定(五coRI 和Ji7w I)，以確定Z_vZJWF-/ /基因、基因已分別連接到表達載體EP-1 和pET-30a上，將獲得的重組表達載體分別命名為EP-l- ZjlMFF-^7、 EP-l-Zy丄A/^-w2、 pET-30a- Zy丄M^-wJ和pET-30a隱Zy丄M^扁/w2。
將上述重組表達載體EP-l- Zy丄Mf-m/、 EP-l- Zy丄AW-m2、 pET-30a- Z少丄W-m/ 和pET-30a-Z;;丄M^-w2分別轉化大腸桿菌BL-21 (DE3)感受態(tài)細胞，挑取白色單 菌落接種于含Kana(l(Hig/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，獲得飽和培養(yǎng)物；取飽和培 養(yǎng)物100|il加入到10ml含Kana(10ug/ml)的LB培養(yǎng)基中，37。C條件下150rpm搖培約4小時，直至OD60『0.6，向其中加入IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)，使其在菌 液中終濃度為0.5mmol/L，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)3小時。
上述誘導培養(yǎng)結束后，取1.8ml菌液于2.0mleppendorf離心管中，10000rpm 離心5min，去上清；加入120pl異丙醇，充分渦漩后，加入DTT，使其終濃度為 1%; 65。C水浴60min，然后12000rpm離心5min，取上清；再加入等體積的lxLoading buffer, 65'C水浴30min，取10pl進行SDS-PAGE電泳。
結果如圖4a所示。其中，泳道1為含有重組表達載體pET-3qa-Z^丄M^-m/的 大腸桿菌中目的蛋白的檢測結果，泳道2為含有重組表達載體EP-l-Z少丄M^-m7的 大腸桿菌中目的蛋白的檢測結果，泳道3為含有重組表達載體EP-l- Z少ZMFT-m2的 大腸桿菌中目的蛋白的檢測結果。
實驗設三次重復，結果表明，重組表達載體￡ -1-^:^^-附/或￡ -1-Zj丄Mf-m2中々丄Mff-m7或Z^AW-m2基因編碼的蛋白均已經表達；而重組表達
Zj^MF-m2基因編碼蛋白的表達。
由于重組表達載體EP-l- Zj/ZJWF-m7或EP-l- Zy丄MfT-m2中含有組氨酸標簽， 故原核表達產物是含有六個組氨酸的融合蛋白，利用特異性高的抗His標簽的單克 隆鼠抗體(購自北京康為世紀生物科技有限公司)進行Westem-bl,ot雜交。
結果如圖4b所示。其中，泳道1為含有重組表達載體pET-30a-Z^:M^-的 大腸桿菌中目的蛋白的檢測結果，泳道2為含有重組表達載體EP-l-Z:^M^-m7的 大腸桿菌中目的蛋白的檢測結果，泳道3為含有重組表達載體EP-l- ZyZJWf-m2的 大腸桿菌中目的蛋白的檢測結果。
實驗設三次重復，結果表明，重組表達載體￡ -1-2:^^^-附/或￡ -1-Zy丄MF-w2中Zy丄M^-m7或基因編碼的蛋白均已經表達；而重組表達
Z;;丄AW-m2基因編碼蛋白的表達。
SDS-PAGE和Western-blot實驗均證明了 Zy丄AW-m7和Zy丄AW-w2基因可以利 用重組表達載體EP-1進行表達。 ，.
實施例4、重組表達載體表達水平的鑒定
以上述實施例3中含有Zj;丄AW-m/基因的重組表達載體EP-l- Zy丄W-m/為實 驗材料，鑒定Z:)AM^-m7基因編碼蛋白的表達情況。
10按照上述實施例2中的方法誘導和提取目的蛋白，取10pl進行SDS-PAGE電 泳，同時電泳5^1蛋白Marker (購自天根公司)，電泳的結果如圖5所示。其中， 泳道1為Zy丄Mfr-m/基因編碼蛋白的表達情況，泳道2為蛋白Marker。將電泳的 圖片掃描后用AlphaEaseFC軟件進行分析。
實驗設三次重復，結果表明，重組表達載體EP-l-Zy丄MT-m/所表達的目的蛋 白的濃度高達40-50mg/L。根據(jù)這一結果，一次誘導1.5L菌液，從中提取的LMW-GS 就可以滿足3次重復配粉功能鑒定實驗的需求(10g標準粉添加25 mg目的蛋白)。序列表
〈160〉 3
<210> 1
〈211〉 57
<212〉 醒 <213>人工序列 <220〉 〈223〉
〈400〉 1
aagaccttcc "tcgtctttgc cctcctcgcc gttgtggcga caagtgccat tgcgcag 57
<210> 2
<211> 106
<212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220> <223>
<400> 2
catatgaaga ccttcctcgt ctttgccctc ctcgccgttg tggcgacaag tgccattgcg GO
cagcaccatc atcatcatca tctggtgcca cgcggttctg ccatgg 106
<210> 3 <211> 5395 <212> DNA〈213〉人工序列
<220〉
<223>
〈400> 3
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaa/tac gcga/tcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
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ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt ccca/tacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
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cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
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14aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aa￡gacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
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ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
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tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
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gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
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ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca ceigggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag t叫ggcaacc 3120
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catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
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gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cciegcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga
atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca tcggctgaat ttgeittgcga gtgagatatt tatgccagcc
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa ca/ttagtgca
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac
cccgctttcc agtcgggaaa 3540
gggagaggcg gtttgcgtat 3600
caacagctga ttgcccttca 3660
ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
gggaacgatg ccctcattca 3900
gtcgccttcc cgttccgcta 3|960
agccagacgc agacgcgccg 4020
gtgacccaat gcgaccagat 4080
aatactgttg atgggtgtct 4140
ggcagcttcc acagcaatgg 4200
gacgcgttgc gcgagaagat 4260
taccatcgac accaccacgc 4320
aatttgcgac ggcgcgtgca 4380gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tc( cgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc erttaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980
gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 5040
ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgca tatgaagacc tt-6ctcgtct 5100
ttgccctcct cgccgttgtg gcgacaagtg ccattgcgca gcaccatcat catcatcatc 5160
tggtgccacg cggttctgcc atggctgata tcggatccga attcgagctc cgtcgacaag 5220
cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc 5280
18cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg 5340 gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggat 539權利要求
1、一段DNA分子，是如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；2)在嚴格條件下可與1)限定的DNA序列雜交且能促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子。
2、 根據(jù)權利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的上游和下 游還分別包括一個酶切位點，所述DNA分子上游的酶切位點為A^el酶切位點，所 述DNA分子下游的酶切位點為TVcoI酶切位點。
3、 根據(jù)權利要求2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子中還包括組 氨酸編碼序列，所述組氨酸編碼序列位于權利要求1所述DNA分子和其下游的酶切 位點之間。
4、 根據(jù)權利要求3所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子中還包括凝 血酶酶切位點，所述凝血酶酶切位點位于所述組氨酸編碼序列和其下游的酶切位點 之間。
5、 根據(jù)權利要求4所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子是如下l)-3) 中任一所述的DNA分子1) 由序列表中序列2所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；2) 在嚴格條件下可與1)限定的DNA序列雜交且能促進目的基因轉錄和翻譯的 DNA分子；3) 與l)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且能促進目的基因轉錄和翻 譯的DNA分子。
6、 含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的重組表達載體，其特征在于所 述重組表達載體的出發(fā)載體為pET-30a，所述重組表達載體的脫氧核糖核苷酸序列 如序列表中序列3所示。
7、 含有權利要求6所述重組表達載體的轉基因細胞系或重組菌。
8、 權利要求1-5中任一所述的DNA分子或權利要求6所述的重組表達載體在促 進目的基因轉錄和翻譯中的應用。
9、 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述目的基因為低分子量谷蛋 白亞基的編碼基因。
10、 一種制備低分子量谷蛋白亞基的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)權利要求7所述的重組 菌，得到低分子量谷蛋白亞基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一段DNA分子。該DNA分子是如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；2)在嚴格條件下可與1)限定的DNA序列雜交且能促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能促進目的基因轉錄和翻譯的DNA分子。利用該DAN分子構建的重組表達載體不僅適用于低分子量谷蛋白亞基基因的表達，還適用于用常規(guī)載體不能表達的、具有與低分子量谷蛋白亞基類似結構的特殊基因的原核表達，同時也適用于其他普通基因的原核表達。這將為低分子量谷蛋白亞基的結構與功能鑒定提供支持，對小麥的品質改良具有重要的現(xiàn)實意義。
文檔編號C12N1/00GK101532016SQ200910082590
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權日2009年4月24日
發(fā)明者張淼怡, 晏月明, 李小輝, 軻 王, 王順利 申請人:首都師范大學