專利名稱：生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的方法，特別是涉及一種生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)動(dòng) 物細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗的方法。
背景技術(shù)：
豬瘟(HC)是由豬瘟病毒(Hog cholera virus, HCV)引起的豬的一種高度傳染性 疾病，它流行廣泛，發(fā)病率、死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)有預(yù)防和控制豬 瘟的最有效的方法是接種豬瘟疫苗現(xiàn)用于豬瘟病毒培養(yǎng)的細(xì)胞載體主要有牛睪丸原代細(xì)胞(BT細(xì)胞)、豬腎細(xì)胞(PK 細(xì)胞)、豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)等。由于我國牛群較普遍存在BVD/MBV病，用牛睪丸細(xì)胞原 代細(xì)胞制苗，易造成細(xì)胞外源病毒污染，且產(chǎn)毒滴度不高，批間差異大，給疫苗產(chǎn)量、效力的 提高帶來困難。而且牛睪丸細(xì)胞為原代細(xì)胞，細(xì)胞的壽命有限，每次制苗需重新獲得細(xì)胞。 而豬腎細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞為連續(xù)傳代細(xì)胞系，取材容易易于放大進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，有逐漸取 代牛睪丸細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗的趨勢。非專利文獻(xiàn)1表明PK、ST、MPK細(xì)胞對豬瘟病毒敏感， 多種豬瘟病毒疫苗株在豬腎細(xì)胞或豬睪丸細(xì)胞上適應(yīng)而得到疫苗株?，F(xiàn)有的豬腎細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)工藝為轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)培養(yǎng)，細(xì)胞 擴(kuò)增較為緩慢，且過程條件不均一，批間差較大，同樣也存在產(chǎn)毒滴度較低的問題。生產(chǎn)規(guī) 模放大的方式為增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量、擴(kuò)建廠房、添購重復(fù)設(shè)備等，而且培養(yǎng)過程對PH、溶氧、營養(yǎng) 物補(bǔ)加等不可定量監(jiān)控，過程較粗放。同時(shí)由于所需轉(zhuǎn)瓶較多，存在易污染的機(jī)會。另外由于轉(zhuǎn)瓶的特性，使其培養(yǎng)方式只能為批培養(yǎng)，單位體積細(xì)胞數(shù)量較少，單次 培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物較少。專利文獻(xiàn)1公開了一種細(xì)胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，但是其所用生 產(chǎn)方法為傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，對生產(chǎn)疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量仍有一定的限制。將生物反應(yīng)器技術(shù) 結(jié)合微載體技術(shù)應(yīng)用到宿主細(xì)胞培養(yǎng)上，通過接種豬瘟病毒毒株進(jìn)行病毒培養(yǎng)和收獲，并 用于制備疫苗的生產(chǎn)工藝還未見報(bào)道。專利文獻(xiàn)1 :CN 101181637A非專利文獻(xiàn)1 豬瘟病毒及其疫苗研究進(jìn)展，中國病毒學(xué)，第11卷第3期第201 207頁，1996年9月

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種使用大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗 方法。該方法可解決現(xiàn)工業(yè)大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)效率低下，規(guī)模放大粗放，單位體積動(dòng)物細(xì)胞數(shù) 量較少的問題，進(jìn)行集約生產(chǎn)。同時(shí)由于生物反應(yīng)器各連接管路均為密閉管道，可減少污染 的發(fā)生，易于控制產(chǎn)品的批間質(zhì)量，還可優(yōu)化培養(yǎng)方式，使用特殊的培養(yǎng)策略-灌注培養(yǎng)模 式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞時(shí)刻處于最佳生長狀態(tài)。本發(fā)明提供一種大規(guī)模生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗的方法，其 包括以下步驟
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1)用轉(zhuǎn)瓶或小規(guī)模反應(yīng)器微載體擴(kuò)增培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液；2)在大規(guī)模反應(yīng)器的微載體上接種由步驟1)生產(chǎn)的細(xì)胞懸液并進(jìn)行培養(yǎng)；3)將豬瘟疫病毒接種于上述步驟2)的大規(guī)模反應(yīng)器微載體上的細(xì)胞并進(jìn)行繁 殖；
4)收獲病毒液，生產(chǎn)豬瘟疫苗。 其中，所述小規(guī)模反應(yīng)器的體積為IOL以下，所述大規(guī)模反應(yīng)器的體積為100 IOOOLo本發(fā)明具有如下有益效果1.細(xì)胞培養(yǎng)、病毒復(fù)制采用的設(shè)備為生物反應(yīng)器，可對培養(yǎng)過程進(jìn)行監(jiān)控及定量 控制，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞的貼附載體_微載體，并采用優(yōu)化的灌注培養(yǎng)系統(tǒng)及方 法，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，提高單位體積細(xì)胞的數(shù)量，從而提高病毒的產(chǎn)毒量。2.采用本發(fā)明培養(yǎng)的豬瘟細(xì)胞毒液病毒含量高，提高單位生產(chǎn)效率，并且使用高 滴度抗原制造的豬瘟疫苗可大大提高疫苗的免疫效力。產(chǎn)品效力及安全性與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相當(dāng) 或優(yōu)于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。


圖1是表示反應(yīng)器微載體培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞生長曲線的圖；圖2是反應(yīng)器微載體培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的細(xì)胞照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種大規(guī)模生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗的方法，其 包括以下步驟1)用轉(zhuǎn)瓶或小規(guī)模反應(yīng)器微載體擴(kuò)增培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液；2)在大規(guī)模反應(yīng)器的微載體上接種由步驟1)生產(chǎn)的細(xì)胞懸液并進(jìn)行培養(yǎng)；3)將豬瘟疫病毒接種于上述步驟2)的大規(guī)模反應(yīng)器微載體上的細(xì)胞并進(jìn)行繁 殖；4)收獲病毒液，生產(chǎn)豬瘟疫苗。其中，所述小規(guī)模反應(yīng)器的體積為IOL以下，所述大規(guī)模反應(yīng)器的體積為100 IOOOLo就本發(fā)明而言，首先，從細(xì)胞工作種子液氮庫中復(fù)蘇ST或PK細(xì)胞，先在方瓶中傳 代擴(kuò)增，再培養(yǎng)到轉(zhuǎn)瓶，進(jìn)而消化轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小規(guī)模反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)瓶或小規(guī) 模反應(yīng)器中放大動(dòng)物細(xì)胞數(shù)量，挑選形態(tài)健康、生長良好的細(xì)胞作為下一級反應(yīng)器的種子 細(xì)胞。接著，連接反應(yīng)器氣路管、進(jìn)液管、出液管等管路，水化微載體，然后將微載體置反 應(yīng)器罐體中同時(shí)進(jìn)行高壓濕熱滅菌，通過反應(yīng)器的微載體/細(xì)胞截留裝置將高壓液體排 出，然后打入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)備用。微載體水化過程稱取一定量微載體置一干凈容器，使用無Ca2+、Mg2+的 PBS(50-100mL/g)在室溫下水化過夜并不時(shí)溫和攪拌。棄去上清，加入新鮮的無Ca2+， Mg2+的PBS(30-50mL/g)，溫和攪拌幾分鐘洗滌2次，棄去洗滌的PBS，加入無Ca2+、Mg2+的PBS(30-50mL/g)。高壓濕熱過程連接反應(yīng)器個(gè)管路，121°C高壓濕熱滅菌30min微載體商品化的微載體如與GE生產(chǎn)的Cyt0deXl、Cyt0deX3等類似的微載體均可 使用。微載體的加入量3_20g/L，優(yōu)先選用5-10/L。然后，將挑選形態(tài)健康、生長良好的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)細(xì)胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化， 制成細(xì)胞懸液，按一定細(xì)胞密度(2X 105-6X 105個(gè)/ml)接種反應(yīng)器，調(diào)節(jié)反應(yīng)器的溫度、培 養(yǎng)液PH、溶氧等參數(shù)，使細(xì)胞生長于最適宜環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。同時(shí)采用灌注培養(yǎng)模式進(jìn)行 培養(yǎng)。溶氧是細(xì)胞代謝中的重要養(yǎng)分。它可以影響細(xì)胞的產(chǎn)率，且間接或直接地影響細(xì)胞 的代謝。在低氧壓下，細(xì)胞往往生長緩慢。而氧壓過高，使培養(yǎng)液會變得對細(xì)胞具有毒性。細(xì)胞生物反應(yīng)器有相應(yīng)的通氣系統(tǒng)?？赏ㄟ^微機(jī)有序地定量地控制加入動(dòng)物細(xì)胞 培養(yǎng)罐內(nèi)的空氣、氧氣、氮?dú)夂投趸妓姆N氣體的流量，使其保持最佳的比例來控制細(xì)胞 培養(yǎng)液中的PH值和溶氧水平，使系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)?？筛鶕?jù)需要選擇傳統(tǒng)培養(yǎng)基添加 8-10 %新生牛血清或特殊低血清培養(yǎng)基添加3-5 %新生牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增。胰蛋白酶/EDTA消化液濃度0. 25%胰蛋白酶0. 02% EDTA細(xì)胞接種密度2X 105_6X 105個(gè)/ml反應(yīng)器溫度37 士 0.2 °C培養(yǎng)液pH 6. 8-7. 4，優(yōu)選于 7. 0-7. 2培養(yǎng)液溶氧30-50%灌注過程細(xì)胞接種第2天，根據(jù)細(xì)胞的生長匯合情況判斷是否需進(jìn)行灌注培養(yǎng) 及灌注體積。一般初始灌注體積為反應(yīng)器1個(gè)工作體積，以后逐漸增加日灌注量。細(xì)胞長滿時(shí)間及密度培養(yǎng)5天左右細(xì)胞密度可達(dá)4X 106_7X 106個(gè)/ml。另外，待接種細(xì)胞還可以是由小規(guī)模反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的傳代細(xì)胞，其特殊之處 在于用胰蛋白酶/EDTA消化液消化的過程和條件停止小規(guī)模反應(yīng)器的攪拌，使微載體自 然沉降，泵出上清培養(yǎng)液，用PH7. 6的含有0. 02% (w/v) EDTA的無Ca2+，Mg2+離子的PBS洗滌 2-3遍，EDTA-PBS溶液使用量為反應(yīng)器1個(gè)工作體積，然后用消化液(0. 25%胰酶-0. 02% EDTA)作用。條件如下溫度37°CpH 7. 4-8. 0,優(yōu)選 7. 6-7. 8轉(zhuǎn)速30-80rpm,優(yōu)選60-70rpm時(shí)間10min-30min，優(yōu)選 15_20min反應(yīng)結(jié)束后加入消化時(shí)工作體積的1-2倍的細(xì)胞培養(yǎng)液終止胰酶的作用，即得到 微載體與細(xì)胞分離開來的混合液。然后通過一個(gè)大約lOOum的對于動(dòng)物細(xì)胞無毒性的篩網(wǎng) 無菌過濾，得到細(xì)胞懸液。接著，用細(xì)胞維持液將新鮮毒種制成病毒懸液接種反應(yīng)器微載體良好單層細(xì)胞， 細(xì)胞沉降后更換為維持培養(yǎng)液，pH值在7. 1-7. 5的范圍之間，優(yōu)選于7. 3-7. 4，溫度37°C左 右。每隔2-3日沉降微載體細(xì)胞，收獲1次，從第2次起的第2收、第3收的病毒液作為工 作毒種。其它收次檢測合格的毒液作為制苗毒液使用，并將病毒液置_15°C -20°C保存， 留樣檢測，檢測方法及要求按照《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)進(jìn)行。
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維持液:MEM低血清培養(yǎng)基(MD 611北京清大天一生物技術(shù)有限公司)新生 牛血清毒種接種量5體積％實(shí)施例
以下，對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些示例。實(shí)施例1 (反應(yīng)器微載體培養(yǎng)從轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的種子豬睪丸細(xì)胞)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)ST細(xì)胞(來自于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，當(dāng)細(xì)胞長成致密 單層時(shí)，細(xì)胞密度約達(dá)到IXio6個(gè)/ml以上時(shí)，挑選形態(tài)健康、生長良好的單層細(xì)胞作為工 作細(xì)胞，所述密度是通過將同批轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)的細(xì)胞抽取一瓶制成細(xì)胞懸液來檢測細(xì)胞密度， 以此作為該批次的密度。連接反應(yīng)器氣路管、進(jìn)液管、出液管等管路，水化CytodeXTMl微載體(GE Healthcare)，然后將微載體置反應(yīng)器罐體中同時(shí)進(jìn)行121°C高壓濕熱滅菌，通過反應(yīng)器的 微載體/細(xì)胞截留裝置將高壓液體排出，然后打入新制備的細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)備用。將30個(gè)15L轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)細(xì)胞使用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，制成細(xì)胞懸液，按 5父105個(gè)/!111的細(xì)胞密度接種到0^￥0冊5 100L反應(yīng)器(北京天和瑞生物科技公司)，采 用灌注培養(yǎng)模式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)條件細(xì)胞接種密度5X IO5個(gè)/ml，工作體積70L，微 載體濃度8g/L，反應(yīng)器溫度36-37°C，培養(yǎng)液pH 7. 0-7. 2，培養(yǎng)液溶氧30_50%。灌注過 程細(xì)胞接種第2天，根據(jù)細(xì)胞的生長匯合情況(一般細(xì)胞大約匯合90%時(shí))和檢測培養(yǎng)液 中的葡萄糖含量，判斷是否需進(jìn)行灌注培養(yǎng)及灌注體積。一般初始灌注體積為反應(yīng)器1個(gè) 工作體積，以后逐漸增加日灌注量，以保證反應(yīng)器中的葡萄糖濃度不低于0. 1-0. 5g/L。圖1 是表示反應(yīng)器微載體培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞生長曲線的圖，細(xì)胞長滿時(shí)間及密度培養(yǎng)5天，密度 達(dá) 5. 4X IO6 個(gè)/ml。實(shí)施例2 (反應(yīng)器微載體培養(yǎng)從轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的種子豬腎細(xì)胞(PK-15))將實(shí)施例1的培養(yǎng)細(xì)胞改為豬腎細(xì)胞(PK-15)(來自于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物 保藏中心)，除此之外，按照與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行操作。細(xì)胞長滿時(shí)間及密度培養(yǎng)4 天，密度達(dá)4. 3X IO6個(gè)/ml。實(shí)施例3 (100L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)5L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的豬睪丸細(xì)胞)用CLAVORUS 5L反應(yīng)器傳代擴(kuò)增ST細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到5 X IO5個(gè)/ml以上時(shí)， 挑選形態(tài)良好無污染的單層細(xì)胞作為工作細(xì)胞及生產(chǎn)細(xì)胞，所述密度是通過將同批小規(guī)模 反應(yīng)器生產(chǎn)的細(xì)胞抽取一個(gè)制成細(xì)胞懸液來檢測其細(xì)胞密度，以此作為該批次的密度。連接CLAVORUS 100L反應(yīng)器氣路管、進(jìn)液管、出液管等管路，水化Cytodexl 微載 體，然后將微載體置反應(yīng)器罐體中同時(shí)進(jìn)行121°C高壓濕熱滅菌，通過反應(yīng)器的微載體/細(xì) 胞截留裝置將高壓液體排出，然后打入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)備用。按下述過程用胰蛋白酶/EDTA消化液消化挑選好的CLAVORUS 5L反應(yīng)器生產(chǎn)的 細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。消化過程停止小型反應(yīng)器的攪拌，使微載體自然沉降，泵出上清培 養(yǎng)液，用 PH7. 6 的含有 0. 02% (w/v)EDTA 的無 Ca2+，Mg2+ 離子的 PBS 洗滌 2-3 遍，EDTA-PBS 溶液使用量為反應(yīng)器1個(gè)工作體積，1個(gè)工作體積是指反應(yīng)器總體積的70%，然后用消化液 (0. 25%胰酶-0. 02% EDTA)作用。作用條件如下溫度:37°C，PH 7. 6，轉(zhuǎn)速60rpm，時(shí)間 20min。反應(yīng)結(jié)束后加入消化時(shí)工作體積的1-2倍的細(xì)胞培養(yǎng)液終止胰酶的作用，即得到微載體與細(xì)胞分離開來的混合液。然后通過一個(gè)大約lOOum的對于動(dòng)物細(xì)胞無毒性的篩網(wǎng)無 菌過濾，得到細(xì)胞懸液。將所得細(xì)胞懸液按5 X 105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種到CLAVORUS 100L反應(yīng)器，采 用灌注培養(yǎng)模式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)條件細(xì)胞接種密度5X 105個(gè)/ml，工作體積70L，微 載體濃度10g/L，反應(yīng)器溫度36-37°C，培養(yǎng)液pH:7. 0-7. 2，培養(yǎng)液溶氧30-50 %。灌注 過程細(xì)胞接種第2天，根據(jù)細(xì)胞的生長匯合情況(一般細(xì)胞大約匯合90%時(shí))和檢測培 養(yǎng)液中的葡萄糖含量，判斷是否需進(jìn)行灌注培養(yǎng)及灌注體積。一般初始灌注體積為反應(yīng)器 1個(gè)工作體積，以后逐漸增加日灌注量，以保證反應(yīng)器中的葡萄糖濃度不低于0. 1-0. 5g/L。 細(xì)胞長滿時(shí)間及密度培養(yǎng)5天，密度達(dá)6 X 106個(gè)/ml。實(shí)施例4 (1000L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)10L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的豬睪丸細(xì)胞)將5L的反應(yīng)器換成10L的反應(yīng)器，將100L的反應(yīng)器換成1000L的反應(yīng)器，除此之 外，按照與實(shí)施例3相同的方法操作，細(xì)胞長滿時(shí)間及密度培養(yǎng)5天，密度達(dá)5. 8X 106個(gè) /ml。實(shí)施例5 (豬睪丸細(xì)胞(ST)毒種的繁殖及制苗毒液的繁殖)豬瘟病毒中國兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)維持液:MEM低血清培養(yǎng)基(MD 611北京清大天一生物技術(shù)有限公司)新生 牛血清毒種接種量5體積％繁殖過程用細(xì)胞維持液將新鮮毒種制成病毒懸液接種于100L反應(yīng)器微載體良 好生長的單層細(xì)胞，細(xì)胞沉降后更換為維持培養(yǎng)液，維持PH7. 4左右，溫度37°C左右。每隔 2-3日沉降微載體細(xì)胞，收獲1次，從第2次起的第2收、第3收的病毒液作為工作毒種。其 它收次檢測合格的毒液作為制苗毒液使用，并將病毒液置_15°C -20°C保存，留樣檢測， 檢測方法及要求按照《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)進(jìn)行，凍融1次，過濾、滅活、乳 化后制備疫苗。比較例1 (轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟病毒)轉(zhuǎn)瓶規(guī)格為15L反應(yīng)溫度37°C培養(yǎng)液pH: 7.1培養(yǎng)液溶氧30-50%轉(zhuǎn)瓶常規(guī)培養(yǎng)ST細(xì)胞后按照與實(shí)施例5相同的方法進(jìn)行ST毒種的繁殖及制苗毒 液的繁殖，按照中華人民共和國獸藥典)》(2005年版)的方法檢測收獲毒液，結(jié)果列于下表。表1轉(zhuǎn)瓶間歇換液收毒與100L反應(yīng)器微載體灌注培養(yǎng)ST細(xì)胞收獲毒液比較
7毒液收獲形式接毒后收獲天 數(shù)收獲體 積病毒平均毒價(jià)15L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)間歇收獲3015L>5 x 105家兔感染 量100L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)連續(xù) 收獲302500L>5 x 105家兔感染 量由表1可以看出，1個(gè)100L反應(yīng)器微載體灌注培養(yǎng)ST細(xì)胞收獲豬瘟病毒液的量相 當(dāng)于160多個(gè)15L轉(zhuǎn)瓶的產(chǎn)量。工業(yè)上的應(yīng)用性利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的豬瘟疫苗各批次間質(zhì)量差異小、產(chǎn)量大、成本低等特點(diǎn)， 是目前工業(yè)化大生產(chǎn)放大的最佳策略之一，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
一種大規(guī)模生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗的方法，其包括以下步驟1)用轉(zhuǎn)瓶或小規(guī)模反應(yīng)器微載體擴(kuò)增培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液；2)在大規(guī)模反應(yīng)器的微載體上接種由步驟1)生產(chǎn)的細(xì)胞懸液并進(jìn)行培養(yǎng)；3)將豬瘟疫病毒接種于上述步驟2)的大規(guī)模反應(yīng)器微載體上的細(xì)胞并進(jìn)行繁殖；4)收獲病毒液，生產(chǎn)豬瘟疫苗。其中，所述小規(guī)模反應(yīng)器的體積為10L以下，所述大規(guī)模反應(yīng)器的體積為100～1000L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)用微載體培養(yǎng)細(xì)胞是按以 下過程進(jìn)行的將微載體經(jīng)水化和121°C高溫滅菌之后，接種所述動(dòng)物細(xì)胞，微載體的 加入量為3-20g/L，接種密度為2X 105-6X 105cells/ml，接著培養(yǎng)細(xì)胞到細(xì)胞密度為 4X 106-7X 106cells/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)細(xì)胞采用灌注培養(yǎng)方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述動(dòng)物細(xì)胞為豬睪丸細(xì) 胞即ST細(xì)胞或豬腎細(xì)胞即PK15細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)的細(xì)胞培養(yǎng)階段的培養(yǎng)液的pH值 維持在6. 8-7. 4的范圍內(nèi)，步驟3)的病毒繁殖的pH值維持在7. 1-7. 5的范圍內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液和步驟3)病毒 繁殖的培養(yǎng)液的PH值維持在7. 1-7. 4的范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟1)中的細(xì)胞懸液用0.25%胰 酶-0. 02% EDTA消化液消化，其pH值維持在7. 4-8. 0。
全文摘要
本發(fā)明提供一種大規(guī)模生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗的方法，其包括以下步驟1)用轉(zhuǎn)瓶或小規(guī)模反應(yīng)器微載體擴(kuò)增培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞；2)在反應(yīng)器的微載體上接種步驟1)生產(chǎn)的細(xì)胞懸液并進(jìn)行培養(yǎng)；3)將豬瘟疫病毒接種于反應(yīng)器微載體上的細(xì)胞并進(jìn)行繁殖；4)收獲病毒液，生產(chǎn)豬瘟疫苗。利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的豬瘟疫苗各批次間質(zhì)量差異小、產(chǎn)量大、成本低。
文檔編號C12N7/00GK101875917SQ20091008276
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者劉俊生, 張韌, 王建超, 陳文慶 申請人:北京清大天一科技有限公司