專利名稱：：一種檢測(cè)傳染病病原體的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，特別是涉及檢測(cè)傳染病病原體的方法及試劑盒。技術(shù)背景在傳染病流行的初期，準(zhǔn)確、快速、便捷地對(duì)傳染病的病原體進(jìn)行4全測(cè)，是控制傳染病流行的關(guān)鍵。雖然國(guó)內(nèi)和國(guó)際上已經(jīng)建立了傳染病的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，但是現(xiàn)有的檢測(cè)手段各有局限性。血清學(xué)檢查利用相應(yīng)的抗體與抗原結(jié)合檢測(cè)到病原體，此方法診斷快速，簡(jiǎn)單、易于操作，但必須制備出針對(duì)該病原體的抗體后才能夠進(jìn)行檢測(cè)，尤其是在還沒有抗體來源的情況下不適用于傳染病的早期診斷。病原體分離法是通過直接對(duì)病原體進(jìn)行分離培養(yǎng)，檢測(cè)鑒定病原體。此方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)(至少要花費(fèi)一周時(shí)間)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全條件要求非常高，所以很難在疫情發(fā)生現(xiàn)場(chǎng)采用，而且不是所有的病原體都能通過病原體分離法獲得。核酸檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)快速，尤其是近年來發(fā)展的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealtimePCR),靈敏度高，且能夠監(jiān)控整個(gè)反應(yīng)進(jìn)程，但一直存在DNA污染造成的假陽性率高的問題，而且由于其臨界值不明顯，因此檢測(cè)結(jié)果灰區(qū)較寬，無法標(biāo)準(zhǔn)化，而且由于儀器要求高，投入大，對(duì)操作人員要求高，需要進(jìn)行專業(yè)技能培訓(xùn)，還限制了多重檢測(cè)的應(yīng)用。同時(shí)該方法對(duì)于病原體含量極低的樣本仍然無法檢測(cè)。NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA,依賴核臥l^列的擴(kuò)增技術(shù))是一項(xiàng)連續(xù)、等溫、基于酶反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的、核糖核酸酶H、噬菌體T7核糖核酸聚合酶和兩條特別設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，其上游引物3'末端與模板的3'末端互補(bǔ)，5，末端含有噬菌體T7的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，下游引物3'末端序列與模板的5'末端序列一致，5，末端含有與捕獲探針互補(bǔ)的序列。在擴(kuò)增起始階段，上游引物與正義RNA模板結(jié)合后，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成與耙標(biāo)RNA互補(bǔ)的反義cDNA，而原來的的RNA模板則被RnaseH降解。接著下游引物與cDNA雜交，在反轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶特性的作用下合成雙鏈cDNA，即對(duì)應(yīng)靶標(biāo)RNA的雙鏈cDNA拷貝。由于雙鏈cDNA—端包含有T7RNApolymerase的啟動(dòng)子序列，從而誘導(dǎo)了RNA聚合酶的活性，合成大量的與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的反義RNA鏈。如此循環(huán)反復(fù)，RNA拷貝數(shù)被不斷放大。同時(shí)由于雙鏈cDNA的另一末端還整合了與捕獲探針互補(bǔ)的序列，因此所產(chǎn)生的互補(bǔ)RNA又能特異的結(jié)合捕獲纟笨針，以用于下一步的檢測(cè)。酶連接寡核苷酸捕獲技術(shù)原理是NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物首先特異性地與捕獲探針一端結(jié)合，后者的另一端能固定連接在微孔板上，然后加入病原體特異性檢測(cè)探針及反應(yīng)底物，檢測(cè)產(chǎn)生的比色信號(hào)，這一檢測(cè)讀數(shù)與RNA的擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，以此來檢測(cè)NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物總量，判斷病毒模板的感染情況。此方法操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，適用于大量樣品的快速檢測(cè)。EB病毒、單純皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒均為DNA病毒，引起的呼吸道傳染病共同癥狀為發(fā)燒、頭痛，常見于兒童期發(fā)病，并通常伴有皮瘆發(fā)生，這些病原體致病性高并且難以區(qū)分，極易延誤診斷和治療的最佳時(shí)機(jī)。目前尚未見報(bào)道同時(shí)能檢測(cè)及鑒別上述四種傳染病病原體的檢測(cè)方法，也沒有相應(yīng)的臨床^r測(cè)試劑盒上市。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不能同時(shí)檢測(cè)多種傳染病病原體的缺陷，提供一種對(duì)可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行4企測(cè)的方法，包括(i)擴(kuò)增生物樣品的核酸片段，所述核酸片段為以下的一種或一種以上的組合EB病毒的EBNA-1基因的如SEQIDNO.l所示的核酸片段；單純皰滲病毒的UL30基因的如SEQIDNO.2所示的核酸片段；巨細(xì)胞病毒的UL83基因的如SEQIDN0.3所示的核酸片段；腺病毒的外殼蛋白六聚體基因的如SEQIDNO.4所示的核酸片段；(ii)用纟笨針進(jìn)行片全測(cè)，所述探針與步驟(i)擴(kuò)增產(chǎn)物中的一種特異性雜交。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是所述步驟(i)利用NASBA技術(shù)擴(kuò)增樣品的核酸片段。NASBA優(yōu)選的運(yùn)行條件為41。C45。C溫育90~150分鐘。本發(fā)明步驟(ii)中優(yōu)選的是所述探針與步驟(i)所得擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交在固體支持物上進(jìn)行。可以固定探針和核酸片段的一種或多種，例如，固定在反應(yīng)板上。術(shù)語"固體支持物，，是指保持其雜交特性前提下寡核苷酸探針可以偶聯(lián)的固體底物，通常，固體底物是尼龍末、纖維素膜、微珠、芯片或反應(yīng)板。在固定之前，可以修飾探針，以促進(jìn)固定或提高雜交效率。這樣的修飾包括同聚物加尾，與NHb基團(tuán)或生物素、半抗原偶聯(lián)。或者，探針和核酸片段都是不固定的，雜交可以在液體介質(zhì)中進(jìn)行，其才企測(cè)可以用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明還提供步驟(i)使用的引物，其核苷酸序列如下所示第1組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片^a,其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；第2組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；第3組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.ll所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.12所示；第4組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。上述第1組至第4組引物分別對(duì)應(yīng)檢測(cè)EB病毒、單純皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、^泉病毒。在實(shí)際應(yīng)用中，還有一種可能是4吏用上述引物組別中的任意一種或一種以上的組合，來擴(kuò)增并才企測(cè)EB病毒、單純皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒中某一種或幾種，如使用第2組和第4組的序列進(jìn)行單純皰滲病毒和腺病毒的檢測(cè)等。本發(fā)明還提供所述步驟(ii)使用的捕獲探針，其核苷S交序列如SEQIDN0.17所示，其直接或間接的連接在固體支持物上,且與步驟(i)所得擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。本發(fā)明還提供步驟(ii)中使用的檢測(cè)探針序列1如SEQIDNO.7所示，檢測(cè)如SEQIDNO.1所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.10所示，牙全測(cè)如SEQIDNO.2所示的核酸片l殳；序列3如SEQIDNO.13所示，檢測(cè)如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDNO.16所示，檢測(cè)如SEQIDNO.4所示的核酸片段。上述序列14分別對(duì)應(yīng)檢測(cè)擴(kuò)增后的EB病毒、單純皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒。檢測(cè)探針可用多種生物方法進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)選地，所述檢測(cè)探針由生物素進(jìn)行結(jié)果判定。本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方案是由多個(gè)反應(yīng)管在同一時(shí)間進(jìn)行步驟(ii)所述檢測(cè)步驟，每個(gè)反應(yīng)管使用的檢測(cè)探針為序列1至序列4中的一種且與步驟(i)所使用的引物對(duì)應(yīng)共同檢測(cè)某一種病原體的存在。上述方法的吸光度結(jié)果處理可以采取如下方案測(cè)試K個(gè)陰性對(duì)照樣品，取其吸光度值，按以下公式確定臨界值m+KxSD，m為陰性對(duì)照吸光度算術(shù)平均值，SD為陰性對(duì)照吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差，K依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)條件而定，如檢測(cè)的群體數(shù)或樣本數(shù)。檢測(cè)讀數(shù)大于臨界值則判定為檢測(cè)結(jié)果"陽性"；檢測(cè)讀數(shù)小于臨界值則判定為檢測(cè)結(jié)果"陰性"。本發(fā)明的術(shù)語"引物"指作為合成引物延伸產(chǎn)物的起始位點(diǎn)的單鏈寡核苦酸序列，其與待復(fù)制的核酸鏈互補(bǔ)，長(zhǎng)度和序列必須適合于延伸產(chǎn)物的合成。本發(fā)明術(shù)語"探針"指單鏈寡核苷酸，用于與核酸片段特異性雜交。"特異性雜交"指所述探針與核酸的整個(gè)區(qū)域或一部分在特定的實(shí)驗(yàn)條件下形成雙鏈體，且在這些條件下，所述探針不與待檢測(cè)樣品中存在的其他核酸或核酸的其他區(qū)域形成雙《連體。探針和核酸片段雜交后，可以通過任意合適的方式，進(jìn)行雜交的檢測(cè)，例如可以檢測(cè)的標(biāo)記探針和/或核酸片段，為了輔助檢測(cè)，優(yōu)選靶核酸片段進(jìn)行NASBA擴(kuò)增或PCR擴(kuò)增。本發(fā)明還提供一種對(duì)可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增EB病毒的EBNA-1基因如SEQIDNO.1所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增單純皰滲病毒的UL30基因如SEQIDNO.2所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增巨細(xì)胞病毒的UL83基因如SEQIDNO.3所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增腺病毒的外殼蛋白六聚體基因如SEQIDNO.4所示核酸片段的引物中的一組或一組以上。優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒的引物選自以下4組引物第1組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；第2組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.9所示；第3組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；第4組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒還包含如核苦酸序列SEQIDN0.17所示的捕獲探針。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒還包含以下至少一種與引物對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針序列1如SEQIDNO.7所示，檢測(cè)如SEQIDNO.1所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.10所示，檢測(cè)如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.13所示，檢測(cè)如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDNO.16所示，檢測(cè)如SEQIDNO.4所示的核酸片段。本發(fā)明所述試劑盒還可以包含一種或多種下述組分雜交緩沖液或制備所述雜交緩沖液的說明書；洗滌溶液或制備所述洗滌溶液的說明書；檢測(cè)形成的雜交體的組分；用于將探針附著到固體支持物上的組分。本發(fā)明所述對(duì)可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測(cè)的方法，對(duì)比現(xiàn)有技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)在于(1)檢測(cè)速度快，效率高，可根據(jù)需要，隨機(jī)兩重、三重或多重組合同時(shí)檢測(cè)多種致病病原體，也可才全測(cè)單個(gè)病原體；(2)靈敏度高，NASBA可檢測(cè)到病毒的最小濃度為10-11pM，高于經(jīng)典的病原分離法的敏感性；(3)特異性強(qiáng)，由于外來雙鏈DNA無T7啟動(dòng)子序列，不能被擴(kuò)增，這就顯著提高了NASBA反應(yīng)的特異性；由于擴(kuò)增過程中的引物和檢測(cè)過程中的纟笨針雙重作用，再次保證了病原體4企測(cè)的特異性，而且NASBA的反應(yīng)條件溫和，且比PCR反應(yīng)需要的時(shí)間短，因此轉(zhuǎn)錄更加忠實(shí)于模板，進(jìn)一步減少了錯(cuò)配率；(4)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定，整個(gè)檢測(cè)過程只需要酶標(biāo)儀這種常規(guī)的儀器；(5)適用于早期診斷，適用于不明原因發(fā)熱引起的重大傳染疾病的早期快速才企測(cè)、多種病原體的隨才幾組合4企測(cè)以及大量樣品的才企-險(xiǎn)。(6)適用范圍廣，取樣簡(jiǎn)單。樣品中DNA、肝素、EDTA、檸檬酸鹽、血紅蛋白、白蛋白和脂質(zhì)等的污染將不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，因而適用于各種待檢樣品如咽喉拭子、糞便、血液等。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)其進(jìn)行各種改造和修改，這些等價(jià)形式同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1設(shè)計(jì)和制備引物、探針序列。根據(jù)NCBI搜索選取EB病毒、單純皰瘆病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒的特異性基因序列，它們分別是EB病毒的EBNA-1基因序列，GENEBANK登錄號(hào)為U21205,選取序列高度保守部分作為靶核酸序列，本發(fā)明選取的靶序列是EBNA-1基因161-308，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；單純皰滲病毒的UL30基因序列，GENEBANK登錄號(hào)為X14112,本發(fā)明選取的耙核酸序列為UL30基因的64208-64374，其核苷S臾序列如SEQIDN0.2所示；巨細(xì)胞病毒的UL83基因序列，GENEBANK登錄號(hào)為X17403,本發(fā)明選取的耙核酸序列是UL83基因的120206-120397,其核苦酸序列如SEQIDNO.3所示；腺病毒的外殼蛋白六聚體基因序列，GENEBANK登錄號(hào)為X84646,本發(fā)明選取的靶核酸序列是外殼蛋白六聚體基因的34-149，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；分析上述病毒特異性基因的信息，經(jīng)序列分析軟件DNAman進(jìn)行引物間/內(nèi)二聚體的排除，并經(jīng)BLAST驗(yàn)證引物的特異性和與相近病原體的同源性，設(shè)計(jì)出針對(duì)上述病原體檢測(cè)的NASBA引物和探針。捕獲探針的核苷S臾序列如SEQIDNO.17所示；引物及對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針如下所示第1組用于擴(kuò)增EB病毒的EBNA-1基因如SEQIDNO.l所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示、檢測(cè)探針如SEQIDNO.7所示；第2組用于擴(kuò)增單純皰滲病毒的UL30基因如SEQIDNO.2所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示、檢測(cè)探針如SEQIDNO.10所示；第3組用于擴(kuò)增巨細(xì)胞病毒的UL83基因基因如SEQIDNO.3所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.ll所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示、檢測(cè)探針如SEQIDNO.13所示；第4組用于擴(kuò)增腺病毒的外殼蛋白六聚體基因如SEQIDNO.4所示的核酸片I殳的上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.14所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示、檢測(cè)探針如SEQIDN0.16所示；實(shí)施例2制備本發(fā)明所述試劑盒。組成為1、擴(kuò)增體系引物(4組)Tris/HC1氯化鉀BSA二石克蘇糖醇三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物反轉(zhuǎn)錄酶核斗唐核酸酶HRNaseH噬菌體T7核糖核酸聚合酶陰性對(duì)照為無RNA酶水陽性對(duì)照是5pM人工合成的EB病毒的EBNA-1基因序列、單純皰滲病毒的UL30基因序列、巨細(xì)胞病毒的UL83基因序列、腺病毒的外殼蛋白六聚體基因序列。每組10uM10-100mMl曙10mM1-5g/ml1-5mM200-1000uM5-300U5-300U5-300U2、#:測(cè)體系檢測(cè)探針(4組，均由地高辛標(biāo)記)26捕獲探針(生物素標(biāo)記)26|iM清洗緩沖液lxTBS雜交緩沖液10mg/mlBSA，50mMTris-HC1(pH7.5)才企測(cè)緩沖液lxTBS:1.4MNaCl，30mMKCl，260mM檢測(cè)濃縮液堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛的抗體終止液3MNaOH底物10mM對(duì)硝基苯磷酸鹽溶液陰性對(duì)照為無RNA酶水；陽性對(duì)照是5pM人工合成的EB病毒的EBNA-1基因序列、單純皰滲病毒的UL30基因序列、巨細(xì)胞病毒的UL83基因序列、腺病毒的外殼蛋白六聚體基因序列。對(duì)可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)刊4企測(cè)的方法，同時(shí)也是本發(fā)明所述試劑盒的使用方法。1、核酸提取取待測(cè)痰液樣品，離心取上清，加入lml異硫氰酸胍，混勻后再加入lmlTRIZOL,振蕩混勻，冰浴中放置5分鐘.加入350ul氯仿，充分4展蕩混勻，靜止分層后，立即于4。C,12000r/min離心20分鐘.將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預(yù)冷)混勻.-20。C方丈置lh，4。C,12000r/分鐘離心20分鐘，沉淀即總RNA.加入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C，12000r/分鐘離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫》丈置10分鐘，加適量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測(cè)核酸樣品，-80匸保存?zhèn)溆谩?、NASBA擴(kuò)增反應(yīng)在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中配制如下所示的20plNASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系，在41。C溫育90分鐘，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)檢測(cè)。NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系(20^1)的終濃度具體為實(shí)施例3:4寺測(cè)核酸樣品200pM引物lpMAMV10URNaseH10UT7RNA聚合酶10UTris/HCl10mM氯化鉀1mMBSA100mg/ml二石克蘇^唐醇1mM三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物200uM3、NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)取步驟2所得5plNASBA產(chǎn)物，加1pi檢測(cè)探針溶液(每孔各加一種)和ljil捕獲探針溶液，和43)^1雜交緩沖液混勻后加入包被了抗生物素蛋白鏈菌素的微孔板(購(gòu)自Thermofisherscientific)每個(gè)獨(dú)立的孔中，在45。C溫育l小時(shí)，'以250WlxTBS,pH7.4清洗小孔三次。每次傾去溶液后要拍干微孔板，每孔加100^1檢測(cè)緩沖液與檢測(cè)濃縮液的混合物(按檢測(cè)濃縮液檢測(cè)緩沖液=1:500稀釋)，4全測(cè)濃縮液購(gòu)自Sigma,P/NN7653,在室溫下溫育30分鐘，以250pllxTBS,pH7.4清洗小孔三次，每次傾去溶液后要拍干微孔板，微孔加100ial底物，避光室溫溫育5分鐘，100)al終止液并輕輕搖動(dòng)來終止顯色反應(yīng)，將微孔板和微孔板板框放入標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板分光光度計(jì)并讀取405nm吸光度。100pl底物加100(il終止液作為背景參照。4、^:測(cè)結(jié)果分析上述吸光度結(jié)果處理采取如下方案測(cè)試8個(gè)陰性對(duì)照樣品測(cè)定其吸光度值，按以下公式確定臨界值m+8xSD，m為陰性對(duì)照吸光度算術(shù)平均值，SD為陰性對(duì)照吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差。臨界值為0.15+0.035x8=0.43。凈企測(cè)讀數(shù)大于臨界值則判定為"陽性"；檢測(cè)讀數(shù)小于臨界值則判定為"陰性"。實(shí)施例4:對(duì)可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)的方法，同時(shí)也是本發(fā)明所述試劑盒的使用方法。1、核酸提取取待測(cè)血液樣品，取新鮮全血2ml加1ml3%檸檬酸鈉，混勻后4°C,3000r/分鐘離心，10分鐘，取上清，加入lml異硫氰酸胍，混勻后再加入1mlTRIZOL,振蕩混勻，水浴中放置5分鐘.加入350ul氯仿，充分振蕩混勻，靜止分層后，立即于4。C，12000r/分鐘離心20分鐘.將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預(yù)冷)混勻，-201^文置1h,4。C,12000r/min離心20分鐘，沉淀即總RNA.加入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C,12000r/min離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫;故置10分鐘，加適量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測(cè)核酸樣品，-80"保存?zhèn)溆谩?、NASBA擴(kuò)增在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中配制如下所示的20^1NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系，在41°C溫育90分鐘，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)才企測(cè)。NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系(20^1)的終濃度具體為4寺測(cè)核酸樣品600uM引物2uMAMV150U脂aseH150UT7RNA聚合酶150UTris/HCl10mM氯化鉀lmMBSA200mg/ml二馬充蘇壽唐醇3mM三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物600uM3、NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)取步驟2所得5^NASBA產(chǎn)物，加1檢測(cè)探針溶液(每孔各加一種)和lpl捕獲探針溶液，和43pl雜交緩沖液混勻并加入包被了抗生物素蛋白鏈菌素的樣吏孔板(購(gòu)自Thermofisherscientific公司)每個(gè)獨(dú)立的孔中，在45。C溫育1小時(shí)，以250pilxTBS，pH7.4清洗小孔三次。每次傾去溶液后要拍干微孔板，每孔加100^1檢測(cè)緩沖液和檢測(cè)緩沖液的混合物(按檢測(cè)濃縮液才企測(cè)緩沖液=1:500配置)，在室溫下溫育30分鐘，以250pllxTBS,pH7.4清洗小孔三次，每次傾去溶液后要拍干微孔板，微孔加100pllOmMTris/HC1，避光室溫溫育5分鐘，加lOO)il終止液并輕輕搖動(dòng)來終止顯色反應(yīng)，將微孔板和微孔板板框放入標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板分光光度計(jì)并讀取405nm吸光度，使用100^110mMTris/HCl加100^1終止液作為背景參照。當(dāng)檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有某3種病原體時(shí)，只需在配制擴(kuò)增體系時(shí)，分別在3個(gè)反應(yīng)管加入該3種病原體對(duì)應(yīng)的引物，檢測(cè)時(shí)加入該3種病原體對(duì)應(yīng)的4笨針溶液，其他步驟同。4、檢測(cè)結(jié)果分析測(cè)定10個(gè)已知的陰性樣品的吸光度，臨界值是m(陰性對(duì)照吸光度算術(shù)平均值)+10xSD(陰性對(duì)照吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差)，臨界值通常為0.15+0.03x10=0.45。檢測(cè)讀數(shù)大于臨界值則判定為檢測(cè)結(jié)果"陽性"；檢測(cè)讀數(shù)小于臨界值則判定為檢測(cè)結(jié)果"陰性"。實(shí)施例5:檢測(cè)EB病毒的靈敏度實(shí)驗(yàn)1、核酸擴(kuò)增取lmlEB病毒標(biāo)準(zhǔn)品加入1ml異硫氰酸胍，混勻后再加入1mlTRIZOL,振蕩混勻，冰浴中方文置5分鐘.加入350ul氯仿，充分振蕩混勻，靜止分層后，立即于4°C,12000r/min離心20分鐘.將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預(yù)冷)混勻.-20。C》文置lh，4。C,12000r/min離心20分鐘，沉淀即總RNA.加入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C,12000r/min離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫放置10分鐘，加適量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測(cè)核酸樣品，測(cè)定其濃度。在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中分別標(biāo)記，配制如下所示的20^NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系，并同時(shí)設(shè)置兩個(gè)陰性對(duì)照，EB病毒RNA配制為10-9pm、10"。pm、lO-"pm、10-12pm的終濃度，每種濃度設(shè)置復(fù)管，以無RNA酶水作為陰性對(duì)照，41。C水浴95分鐘。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)檢測(cè)。NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系(20^1)的終濃度具體為:EB病毒RNA引物(第l組)AMV10URNaseH10UT7RNA聚合酶10UTris/HC110mM氯化鉀1mMBSA100mg/ml二硫蘇糖醇1mM三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物200uM取擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列分析，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，與EB病毒EBNA-1基因序列161-308—致。2、核酸;險(xiǎn)測(cè)1)在支持板框上安放一個(gè)微孔板板條，該微孔板包被了抗生物素蛋白鏈菌素(購(gòu)自Thermofisherscientific公司)。2)每個(gè)微孔中依次加入43nl雜交緩沖液、力。1iiH企測(cè)探針溶液(第1組)和1(!l捕獲〗笨針溶液，5^1擴(kuò)增產(chǎn)物，輕敲支持板以混合溶液(注意避免產(chǎn)生氣泡)。3)牢牢蓋上封口膜避免蒸發(fā)，45。C水浴60分鐘。4)傾去溶液后，以250fxllxTBS,pH7.4清洗小孔五次，且每次清洗30s,傾去溶液后拍干微孔板。5)每孔加100jil檢測(cè)緩沖液和檢測(cè)濃縮液的混合物(按檢測(cè)濃縮液緩沖液=1:500配置)，牢牢蓋上封口膜避免蒸發(fā)。6)在室溫下溫育30分鐘。7)傾去溶液后，以250|illxTBS，pH7.4清洗小孔五次，且每次清洗30s,每次傾去溶液后拍干微孔板。8)孩i孔加100)al連接液(小心避免在孔中引入泡沫)。9)避光室溫溫育5分鐘。10)孩吏孔加100|il終止液并輕輕搖動(dòng)來終止顯色反應(yīng)。11)將微孔板和微孔板板框放入標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板分光光度計(jì)并讀取405nm吸光度。結(jié)果如表1所示。表l.本發(fā)明所述方法檢測(cè)不同濃度EB病毒的吸光度值<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>4、結(jié)果分析經(jīng)分光光度計(jì)讀取吸光度值進(jìn)行結(jié)果判定，測(cè)定7個(gè)已知的陰性樣品(水)的吸光度，臨界值是m(陰性對(duì)照吸光度算術(shù)平均值)+7xSD(陰性對(duì)照吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差)，臨界值為0.17+0.04x7=0.45。檢測(cè)讀數(shù)大于臨界值則判定為檢測(cè)結(jié)果"陽性"；檢測(cè)讀數(shù)小于臨界值則判定為檢測(cè)結(jié)果"陰性"。即第1組的引物與第1組的檢測(cè)探針可以檢測(cè)到EB病毒的最低濃度是lO"1pM。實(shí)施例6:檢測(cè)其他病原體的靈敏度實(shí)驗(yàn)參照實(shí)施例5,配制不同濃度的單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒，用其對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行NASBA擴(kuò)增后測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物序列，其核普酸與耙基因一致。用相應(yīng)的捕獲探針和檢測(cè)探針進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到的最低濃度均能達(dá)到10"1pM。實(shí)施例7:EB病毒的引物特異性試驗(yàn)將EB病毒EBNA-1基因161-308如SEQIDNO.l所示的基因片段隨機(jī)進(jìn)行突變，突變后的核苷酸序列如SEQIDN0.18所示，為了敘述方便，將其稱為EB病毒EBNA-1基因片段的干擾序列。配制等濃度的實(shí)施例5EB病毒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增所得EBNA-1基因、上述干擾序列以及人DNA,取其中之一或兩兩混合或三種混合共配制成7種不同的待測(cè)樣品，每種待測(cè)樣品設(shè)置復(fù)管，在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中分別標(biāo)記，配制如下所示的20plNASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系，并同時(shí)i殳置兩個(gè)無RNA酶水的陰性對(duì)照，4rC水浴95分鐘。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)4企測(cè)。NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系(20jil)的終濃度具體為待測(cè)樣品引物(第l組)AMVRNaseHT7RNA聚合酶Tris/HC1氯化鉀BSA二硫蘇糖醇三磷酸核苷與脫氧-800pMlpM10U10U10U10mM1mM100mg/ml1mM舉酸核苷等濃度混合物200uM進(jìn)行SDS—PAGE電泳分析，結(jié)果表明僅混合了EB病毒標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)管有擴(kuò)增產(chǎn)物，取擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列分析，其序列即為如SEQIDNO.l所示的核苷酸序列的5'連接了一段與捕獲探針互補(bǔ)的序列。實(shí)施例8:其他引物的特異性實(shí)驗(yàn)參照實(shí)施例7,將單純皰滲病毒的UL30基因如SEQIDNO.2所示的核酸片段、巨細(xì)胞病毒的UL83基因如SEQIDN0.3所示的核酸片段、腺病毒的外殼蛋白六聚體基因如SEQIDNO.4所示的核酸片段的幾個(gè)堿基隨機(jī)突變后形成的干擾序列分別與其對(duì)應(yīng)的把核酸片段、人DNA進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，即取其中之一或兩兩混合或三種混合共配制成7種不同的待測(cè)樣品，分別在不同的反應(yīng)管用相應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，SDS-PAGE電泳分析表明僅有混合了靶核酸的反應(yīng)管有擴(kuò)增產(chǎn)物，取擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列分析，其序列即為耙核酸序列5'連接了一段與捕獲探針互補(bǔ)序列。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本發(fā)明提供的引物特異性強(qiáng)，分析原因在于由于外來雙鏈DNA無T7啟動(dòng)子序列，不能被擴(kuò)增，這就顯著提高了NASBA反應(yīng)的特異性；而且NASBA的反應(yīng)條件溫和，且比PCR反應(yīng)需要的時(shí)間短，因此轉(zhuǎn)錄更加忠實(shí)于模板，進(jìn)一步減少了錯(cuò)配率。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>北京?？祷蛐酒_發(fā)有限公司<120>—種檢測(cè)傳染病病原體的方法及試劑盒<130>MP090692<160>18<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉148<212〉DNA<213>EB病毒的EBNA-1基因161-308<400〉1gtcacgtagaaaggactaccgatgaaggaacttgggtcgccggtgtgttcgtatatggag60gtagtaagacctccctttacaacctcaggcgaggaattgcccttgctattccacaatgtc120gtcttacaccattgagtcgtctcccctt148<210>2<211>167<212>DNA<213>單純皰滲病毒UL30基因64208-64374<400>2atcaacttcgactggcccttcttgctggccaagctgacggacatttacaaggtccccctg60gacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggacataggccagagc120cacttccagaagcgcagcaagataaaggtgaacggcatggtgaacat167<210〉3<211>192<212>DNA<213>巨細(xì)胞病毒UL83基因120206-120397<400>3ccaagatgcaggtgataggtgaccagtacgtcaaggtgtacctggagtccttctgcgagg60acgtgccctccggcaagctctttatgcacgtcacgctgggctctgacgtggaagaggacc120tgacgatgacccgcaacccgcaacccttcatgcgcccccacgagcgcaacggctttacgg180tgttgtgtccca192<210>4<211>116<212>DNA<213>腺病毒外殼蛋白六聚體基因34-149<400>4tacatgcacatcgccggacaggacgcttcggagtacctgagtccgggtctggtgcagttc60gcccgggccacagacacctacttcagtctggggaacaagtttaggaaccccacggt116<210>5<211>45<212>DNA<213>引物EB-F<400>5gatgcaaggtcgcatatgaggtcacgtagaaaggactaccgaaga45<210>6<211>55<212>DNA<213〉引物EB-R<400>6aattctaatacgactcactatagggagaaggaaggggagacgactcaatggtgta55<210>7<211>26<212>DNA<213>探針EB-P<400>7ggtagtaagacctccctttacaacct26<210>8<211>43<212>DNA<213>引物HSV-F<400>8gatgcaaggtcgcatatgagatcaacttcgactggcccttcgt43<210>9<211>53<212>DNA<213>引物HSV-R<400>9<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><213>探針CMV-P<400>13tgacccgcaacccgcaacccttcat25<210>14<211>40<212>DNA<213>引物Ad-F<■〉14gatgcaaggtcgcatatgagtacatgcacatctccggaca40<210>15<211>54<212>DNA<213>引物Ad-R<400>15aattctaatacgactcactatagggagaaggacagtgggattcctgaacttgtt54<210>16<211>22<212>DNA<213>探針Ad畫P<400>16caggatgcttcggagtatctga22<210>17<211>20<212>DNA<213>捕獲纟笨針<400>17gatgcaaggtcgcatatgag20<210>18<211>148<212>DNA<213>EB病毒的EBNA-1基因片段的干擾序列<400>18gtcacgagtcaaggactaccgatgaaggaacttgggtcgccggtgtgttcgtatatggag60gtagtaagacctccctttacaacctcaggcgaggaattgcccttgctattccacaatgtc120gtcttacaccattgagtcgtctcccctt148權(quán)利要求1、一種對(duì)可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括(i)擴(kuò)增生物樣品的核酸片段，所述核酸片段為以下的一種或一種以上的組合EB病毒的EBNA-1基因的如SEQIDNO.1所示的核酸片段；單純皰疹病毒的UL30基因的如SEQIDNO.2所示的核酸片段；巨細(xì)胞病毒的UL83基因的如SEQIDNO.3所示的核酸片段；腺病毒的外殼蛋白六聚體基因的如SEQIDNO.4所示的核酸片段；(ii)用探針進(jìn)行檢測(cè)，所述探針與步驟(i)擴(kuò)增產(chǎn)物中的一種特異性雜交。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)利用NASBA技術(shù)擴(kuò)增樣品的核酸片段，NASBA運(yùn)行條件為41。C45。C溫育90150分鐘。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中所述探針與步驟(i)所得擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交在固體支持物上進(jìn)行。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)使用以下4組寡核香酸序列的一種或一種以上的組合作為引物進(jìn)行擴(kuò)增第l組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；第2組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；第3組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.ll所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；第4組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(ii)使用捕獲探針，其核香酸序列如SEQIDN0.17所示，所述捕獲探針直接或間接的連接在固體支持物上。6、根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中使用以下的核苷酸序列作為檢測(cè)探針序列1如SEQIDNO.7所示，檢測(cè)如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.10所示，才全測(cè)如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.13所示，才企測(cè)如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDNO.16所示，檢測(cè)如SEQIDNO.4所示的核酸片段。7、一種對(duì)可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片4更的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDNO.2所示的核酸片段的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDNO.3所示的核酸片段的引物和用于擴(kuò)增SEQIDNO.4所示的核酸片段的引物中的一組或一組以上。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述引物選自第l組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；第2組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；第3組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；第4組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包含如核苷酸序列SEQIDNO.17所示的捕獲探針。10、根據(jù)權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，還包含以下至少一種與引物對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針序列1如SEQIDN0.7所示，檢測(cè)如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.10所示，檢測(cè)如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.13所示，檢測(cè)如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDNO.16所示，檢測(cè)如SEQIDNO.4所示的核酸片段。全文摘要本發(fā)明公開一種對(duì)可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述傳染病病原體包括EB病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和腺病毒，包括擴(kuò)增生物樣品的核酸片段和用探針進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增的引物以及用于檢測(cè)的探針。本發(fā)明還提供包含上述引物的試劑盒。本發(fā)明所述方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，樣本范圍廣，可同時(shí)檢測(cè)多種傳染病病原體，適用于呼吸道傳染病的早期診斷。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101545014SQ20091008389公開日2009年9月30日申請(qǐng)日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者于常海,馮曉燕,劉樂庭申請(qǐng)人:北京?？祷蛐酒_發(fā)有限公司