專(zhuān)利名稱(chēng)：：流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針及檢測(cè)流感病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種rRT-PCR檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針及檢測(cè)流感病毒的方法。
背景技術(shù)：
：流感病毒基因組由8條負(fù)鏈RNA節(jié)段構(gòu)成。根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)不同分為A型、B型、C型。A型流感病毒根據(jù)表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型；B型和C型流感病毒不分亞型。A型常引起世界性大流行；B型、C型則以局部暴發(fā)和散發(fā)流行為特征。2009年3月，墨西哥和美國(guó)先后發(fā)現(xiàn)了甲型H1N1流感病毒感染病例，至2009年5月21日，全球己經(jīng)有42個(gè)國(guó)家出現(xiàn)甲型H1N1流感確診病例，確診病例超過(guò)l萬(wàn)，感染人數(shù)呈不斷上升趨勢(shì)。目前的數(shù)據(jù)顯示，該病毒已經(jīng)具備了人際傳播的能力，人群對(duì)該病毒的免疫低下，因此病毒在人際之間的傳播能力較普通流感病毒強(qiáng)。甲型H1N1流感潛伏期一般1至7天，早期癥狀與普通流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等，有些還會(huì)出現(xiàn)腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等。部分患者病情來(lái)勢(shì)兇猛、突然高熱、體溫超過(guò)39'C，甚至繼發(fā)嚴(yán)重肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、休克及Reye綜合征、呼吸衰竭及多器官損傷，最后導(dǎo)致死亡。甲型流感H1N1亞型病毒的基因核酸序列與季節(jié)性流感病毒H1N1接近，病原的診斷需要采用較為復(fù)雜和繁瑣的基因序列測(cè)定，難以在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用的流感病毒檢測(cè)方法為雞胚病毒分離培養(yǎng)方法，靈敏度高。上述現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下缺點(diǎn)操作費(fèi)時(shí)、需3周時(shí)間，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求也比較高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用方便的流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針及檢測(cè)流感病毒的方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針，包括以下一種或多種引物和探針甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性弓I物和探針；所述甲型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)甲型流感病毒M基因相對(duì)保守區(qū)；所述兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針針對(duì)新甲型H1N1流感病毒HA基因相對(duì)保守區(qū)；所述新甲型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)新甲型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)。本發(fā)明的應(yīng)用上述的流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針檢測(cè)流感病毒的方法，包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測(cè)樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR試劑盒加入所述引物和探針進(jìn)行核酸擴(kuò)增；之后，根據(jù)Ct值判斷rRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽(yáng)性。由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明所述的流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針及檢測(cè)流感病毒的方法，由于包括針對(duì)甲型流感病毒M基因、新甲型H1N1流感病毒HA基因、新甲型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)引物和探針，可以通過(guò)rRT-PCR法檢測(cè)流感病毒，操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用方便。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的流感病毒rRT-PCR(real-timeRT-PCR)檢測(cè)引物和探針，其較佳的具體實(shí)施方式是，包括以下一種或多種引物和探針甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性引物和探針；所述甲型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)甲型流感病毒M基因相對(duì)保守區(qū)；所述兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針針對(duì)新甲型H1N1流感病毒HA基因相對(duì)保守區(qū)；所述新甲型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)新甲型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)。所述引物和探針可以包括長(zhǎng)度為1928bp的寡核苷酸片段；其中，針對(duì)M基因和HA基因的探針與目的基因負(fù)鏈的堿基序列一致，針對(duì)NP基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。所述甲型流感病毒特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3，；5，-GGGCATTYTGGACMAKCGTCTACG-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMARA3，；第一組所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-ACATTCGAAGCAACTGGAAA-3，；5，-GTRTTRCAATCGTGGACTGG-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TCCATTGCGAAKGCATATCTCGG-BHQ1-3';第二組所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-GGGTAAARCTGGAATCRACAA-3，；5，-CCAGGGAGACTAMCAGTACCA-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TTGGCGATCTAYTCAACTGYCGCC--朋Ql-3，；一所述新甲型流感病毒特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-TCMGACATGCGAACRGAAGTT-3，；5，-GGGYTCGTTGCCTTTTCGT-3，；探針序列5，HEX-CCAGAAGATTTGTCCTTCCA--BHQ1-3，。上述探針序列兩端的標(biāo)記FAM、TAMARA、BHQ1、HEX為熒光素標(biāo)記。本發(fā)明應(yīng)用上述的流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針檢測(cè)流感病毒的方法，其較佳的具體實(shí)施方式是，包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測(cè)樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR試劑盒加入所述引物和探針進(jìn)行核酸擴(kuò)增；所述流感病毒可以包括以下一種或多種病毒甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。本發(fā)明中的引物和探針序列(5'—3')及其檢測(cè)的靶片段如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具體實(shí)施例包括了寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)、待檢樣本的處理、檢測(cè)和分析。為進(jìn)一步說(shuō)明流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物及應(yīng)用方法，參照下列實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明實(shí)施例一甲型流感病毒H1N1rRT-PCR寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)與合成GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/ge畫(huà)es/FUJ/FLU.html)中禾口中國(guó)國(guó)家流感中心病毒序列數(shù)據(jù)庫(kù)中下載豬源流感病毒H1N1和甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1等亞型M基因、NP基因和HA基因全序列，軟件比對(duì)分析所有甲型流感病毒M基因序列的一致性，選擇相對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針；將豬源H1N1、新甲型H1N1和季節(jié)性甲型流感病毒H1N1所有NP基因和HA基因序列放在一起比對(duì)，選擇相對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針。引物和探針設(shè)計(jì)中允許同一變異位點(diǎn)允許2個(gè)及2個(gè)以下簡(jiǎn)并堿基。將所提取的備選引物滿(mǎn)足以下要求進(jìn)行篩選①探針長(zhǎng)度L在1928bp之間；②Tm值在4259'C之間；③GCM在2575%之間；④polyN《4bp;⑤Hairpin《4bp;覆蓋率>90%;⑦進(jìn)行BLAST篩選，特異性分?jǐn)?shù)〉LX0.4。最佳Tm值設(shè)定在47'C，最佳探針長(zhǎng)度為20-25bp。實(shí)施例二本發(fā)明檢測(cè)未知病毒的應(yīng)用舉例1.病毒RNA的提取取病毒采樣液200uL，加入500uL裂解液，按RNeasyMiniKit(Qiagen公司，catalogtt74104)說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA50uL。2.rRT-PCR反應(yīng)1)體系配置使用QIAGENQuantiTectTMProberRT-PCRKit(catalog#20443)反應(yīng)液組分體(Hi)積2xQuantiTectProbeRT-PCRMasterMix上游引物(40uM)下游引物(40uM)Probe(10pM)QuantiTectRTMix病毒核酸/RNARNaseFreeH2012.50.50.50.50.255.0Upto252)rRT-PCR:將加好上述反應(yīng)體系的反應(yīng)管放于PCR儀進(jìn)行rRT-PCR，反應(yīng)程序如下6(TC作用5分鐘；5(TC作用30分鐘；95。C作用15分鐘；9fC變性15秒；50。C退火30秒；72。C延伸30秒；回到第5步，45個(gè)循環(huán)。3.結(jié)果判斷陰陽(yáng)對(duì)照結(jié)果成立的情況下判斷結(jié)果，及陰性參照沒(méi)有Ct值，而陽(yáng)性參照有Ct值。一般情況的下Ct小于38的可以判斷為陽(yáng)性。本發(fā)明提供了4套用于甄別甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒的特異性寡核苷酸引物及探針序列；并提供了rRT-PCR的檢測(cè)體系及其在流感病毒快速檢測(cè)中的應(yīng)用。檢測(cè)評(píng)價(jià)特異性評(píng)價(jià)共選取國(guó)內(nèi)近三年流行季節(jié)性流感病毒H1N1亞型20株進(jìn)行檢測(cè)，qFluA均能檢出，而qSW-m-1、qSW-Hl-2和qS麗P均不能檢出；選取10株豬流感病毒H1N1亞型、2株新甲型流感病毒H1N1亞型進(jìn)行檢測(cè)，四對(duì)引物和探針均能檢出；選取甲型流感病毒H3N2進(jìn)行檢測(cè)，除qFluA檢測(cè)為陽(yáng)性外，其余三對(duì)檢測(cè)均為陰性；選取B型流感病毒進(jìn)行檢測(cè)，四對(duì)引物檢測(cè)均為陰性。靈敏性評(píng)價(jià)用來(lái)自美國(guó)血凝單位為32HA/50WL的H1N1毒株(A/California/09/2009)200uL提取RNA50uL，10倍梯度稀釋顯示靈敏性達(dá)到10—5-10—7稀釋度。本發(fā)明可以將rRT-PCR技術(shù)應(yīng)用于新甲型H1N1流感病毒(豬流感)的甄別、檢測(cè)體系中。為新甲型H1N1流感病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了有效的檢測(cè)技術(shù)，為新甲型H1N1流感病毒的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防和早治療以及公共衛(wèi)生策略的制定提供技術(shù)手段和檢測(cè)依據(jù)。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。〈110〉中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所<120〉流感病毒RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)流感病毒的方法〈160〉12〈210〉1<211〉22<212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉甲型流感病毒特異性引物〈400〉1gaccratcctgtcacctctgac〈210>2〈211〉25〈212〉■〈213>人工序列〈220〉〈223〉甲型流感病毒特異性引物〈400〉2gggcattytggacaaakcgtctacg<210〉3〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220>〈223〉甲型流感病毒特異性探針〈400〉3tgcagtcctcgctcactgggcacg〈210〉4〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物<400>4acattcgaagcaactggaaa〈210〉5<211>20〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物〈400〉5gtrttrcaatcgtggactgg〈210〉6〈211〉23<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性探針<400〉6tccattgcgaakgcata/tctcgg<210>7<211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物〈400>7gggt333rctgg33tCr3C33<210>8<211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220><223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物<400〉8ccagggagactamcagtacca〈210>9<211>24<212〉麗A<213〉人工序列<220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性探針〈400〉9ttggcgatctaytcaactgycgcc〈210〉10<211〉21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223>新甲型流感病毒特異性引物〈400〉10tcmgacatgcgaacrgaagtt〈210〉11〈211〉19<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉新甲型流感病毒特異性引物<400>11gggytcgttgccttttcgt〈210〉12〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型流感病毒特異性探針<400〉12ccagaagatttgtccttcca09-05-22關(guān)閉窗權(quán)利要求1、一種流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針，其特征在于，包括以下一種或多種引物和探針甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性引物和探針；所述甲型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)甲型流感病毒M基因相對(duì)保守區(qū)；所述兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針針對(duì)新甲型H1N1流感病毒HA基因相對(duì)保守區(qū)；所述新甲型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)新甲型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒RT-PCR檢測(cè)引物，其特征在于，所述引物和探針包括長(zhǎng)度為1928bp的寡核苷酸片段；其中，針對(duì)M基因和HA基因的探針與目的基因負(fù)鏈的堿基序列一致，針對(duì)NP基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針，其特征在于所述甲型流感病毒特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3，；5，-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMARA3，；第一組所述新甲型HlNl流感病毒m特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-ACATTCGAAGCAACTGGAAA-3，；5，-GTRTTRCAATCGTGGACTGG-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TCCATTGCGAAKGCATATCTCGG-BHQ1-3，；第二組所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5，-GGGTAAARCTGGAATCRACAA-3，；5，-CCAGGGAGACTAMCAGTACCA-3，；探針序列5，F(xiàn)AM-TTGGCGATCTAYTCAACTGYCGCC—BHQ1-3，；所述新甲型流感病毒特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列引物序列5'-TCMGACATGCGAACRGAAGTT-3，；5，-GGGYTCGTTGCCTTTTCGT-3';探針序列5，HEX-CCAGAAGATTTGTCCTTCCA—BHQl-3，。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針，其特征在于，所述探針序列兩端的標(biāo)記FAM、TAMARA、BHQ1、HEX為熒光素標(biāo)記。5、一種應(yīng)用權(quán)利要求l至4任一項(xiàng)所述的流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針檢測(cè)流感病毒的方法，其特征在于，包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測(cè)樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法rRT-PCR試劑盒加入所述引物和探針進(jìn)行核酸擴(kuò)增；之后，根據(jù)Ct值判斷rRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽(yáng)性。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一種或多種病毒甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針及檢測(cè)流感病毒的方法，包括甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性引物和探針等，4種共12條寡核苷酸引物和探針序列，同時(shí)公開(kāi)了待檢樣本的處理、rRT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件、結(jié)果分析。能快速有效的甄別甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、新甲型流感病毒。操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用方便，為臨床診斷、檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域的流感疫情早期預(yù)警機(jī)制提供了可行的技術(shù)支持。文檔編號(hào)C12R1/93GK101560574SQ20091008547公開(kāi)日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年5月22日優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日發(fā)明者李德新,李曉丹,溫樂(lè)英,偉王,王大燕,舒躍龍,高榮保申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所