專利名稱：戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(H印atitis E virus, HEV)引起的一種急性、自 限性病毒性肝炎，主要經(jīng)糞-口途徑傳播。臨床表現(xiàn)類似甲型肝炎，但黃疸較為常 見，孕婦感染后病情通常較重，死亡率達(dá)20%。我國是戊型肝炎的高發(fā)區(qū)，自1982 年起發(fā)現(xiàn)戊型肝炎病例，至今先后已有10余次戊肝暴發(fā)流行的報(bào)道。對(duì)我國13個(gè) 省市、自治區(qū)的63個(gè)疾病監(jiān)測(cè)點(diǎn)的31， 120名1 59歲研究對(duì)象進(jìn)行的血清流行病 學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，HEV抗體陽性率為17%。 HEV帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為不可忽 視的公共衛(wèi)生問題。
HEV是一種RNA病毒，只有一個(gè)血清型，各地毒株間差異很大，可分為4個(gè)基 因型。不同基因型致病性、地域分布等存在很大差異。很多學(xué)者證實(shí)HE是一種新 發(fā)現(xiàn)的人獸共患傳染病，豬是本病重要的貯存宿主。日本等國家已發(fā)現(xiàn)多起因食用 半生豬肝而發(fā)生感染的報(bào)道。我們的研究表明，屠宰場(chǎng)、市售豬肝中均能檢測(cè)出HEV。
目前還沒有研制出有效疫苗，細(xì)胞培養(yǎng)也非常困難，加之病毒粒子很不穩(wěn)定， 嚴(yán)重制約了對(duì)HEV的研究。目前已有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法抗體檢測(cè)試劑 盒投入市場(chǎng)，可用于血清流行病學(xué)調(diào)査。但對(duì)病毒的檢測(cè)，只能采用巢氏PCR法檢 測(cè)?，F(xiàn)有的PCR檢測(cè)法不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且面臨假陽性等問題，亟待對(duì)本法進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn)化，將其研發(fā)為試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒含有4條引物，所述4條引物 的核苷酸序列為序列表中序列1至序列4所示。
其中，所述試劑盒還含有2條陽性對(duì)照引物，所述陽性對(duì)照引物的核苷酸序列 如序列表中序列5和序列6所示。
當(dāng)然，本發(fā)明的試劑盒還含有PCR擴(kuò)增所需要的其他試劑，如dNTP、PCR buffer、 Taq酶等。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)戊型肝炎病毒的方法，是以待測(cè)樣品的
cDNA為模板，以序列表中序列1和序列表中序列2所示的DNA分子為引物進(jìn)行第一 輪PCR擴(kuò)增，獲得第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；以所述第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以序 列表中序列3和序列表中序列4所示的DNA分子為引物進(jìn)行第二論P(yáng)CR擴(kuò)增，獲得 第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所述第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，100-150bp 之間有條帶為戊型肝炎病毒陽性。
所述方法中還包括以序列表中序列5和序列6的DNA分子為引物，以待測(cè)樣品 的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，150-200bp 之間有條帶。
本發(fā)明的戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒中含有的引物是根據(jù)HEV保守區(qū)域設(shè) 計(jì)簡(jiǎn)并引物能檢測(cè)出所有已報(bào)道的毒株。特異性、靈敏度均高于其它方法，同時(shí)擴(kuò) 增片段僅130bp左右，減少了擴(kuò)增時(shí)間。以擴(kuò)增甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基 因作為陽性對(duì)照，防止擴(kuò)增失敗和假陽性的出現(xiàn)。本發(fā)明的檢測(cè)戊型肝炎病毒的方 法實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝臟中病毒的快速檢測(cè)，6小時(shí)左右即可獲得結(jié)果進(jìn)一步結(jié)合測(cè)序，可 對(duì)HEV基因型、亞型進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒可用于臨 床診斷、監(jiān)測(cè)，科研及大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)査。


圖1為PCR鑒定戊型肝炎病毒結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑 獲得。
本發(fā)明通過對(duì)Genebank中登錄HEV序進(jìn)行比對(duì)，從保守區(qū)設(shè)計(jì)2對(duì)簡(jiǎn)并引物，建 立RT巢氏PCR方法；以豬肝臟為樣品，Trizol法提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA， 以戊型肝炎病毒特異引物進(jìn)行PC財(cái)廣增；以持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá) 產(chǎn)物為檢測(cè)對(duì)象設(shè)陽性對(duì)照，另設(shè)陰性對(duì)照。
實(shí)施例1、戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)戊型肝炎病毒 新鮮的肝臟樣品加入液氮研磨，用1. 5ml離心管分裝后-8(TC凍存。取1管研 磨的肝組織，加入lmlTrizol，輕輕混勻，裂解5rain。加入0. 2ml的氯仿，蓋上離 心管蓋，劇烈混勻10秒，靜止5min，4。C， 12000rpm離心10min。 將水相轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管，加入0. 5ral異丙醇，室溫放置5min， 4°C， 12000rpm離心10min 沉淀RNA。棄去上清，加入lml 75%的乙醇搖勻，4°C， 1000rpm離心5min。傾去 乙醇，室溫放置15min揮發(fā)乙醇，加30ulDEPC處理水溶解，得到總RNA。
取O. 2mlPCR管，依次加入下列試劑DEPC處理水 5.5 y 1、 5XPCR buffer 5ul、 lOraM dNTP 2wl、腿LV lul、 RNA抑制劑lul、 Oligo (16T) 0, 5ul、總 RNA10ul，混勻后，置PCR儀中，42°C 30min, 99°C 5min， 4°C 5min，獲得cDNA。
第一輪PCR擴(kuò)增
待檢樣品取0.2ml PCR管，依次加入下列試劑
ddH20 17 ul
HEV164F1 0. 5nl
HEV164R1 0.5ul
dNTP 0. 5 u 1
10XPCR buffer 2. 5 u 1
Taq酶(2u/ix 1) 1 ii 1
c薩 4 u 1
HE164F1: 5， -CCR GCR GTG GTT TCT GGG GTG -3， (序列表中序列1); HE164R1: 5' -TGG GMY TGG TCD CGC CAA G-3， (序列表中序列2)。 陰性對(duì)照以滅菌水為模板，引物同待檢樣品。 陽性對(duì)照以GAPDH-F和GAPDH-R為擴(kuò)增引物，模板同待檢樣品。 GAPDH-F: 5， -GTC CAC TGG TGT CTT CAC GA-3， (序列表中序列5); GAPDH-R: 5， -GCT GAC GAT CTT GAG GGT-3， (序列表中序列6)。
PCR擴(kuò)增程序94°C 2min; [94°C 30s、 58°C 30S、 72°C 30 S; 30個(gè)循環(huán)]; 72°C 7min。
第二輪PCR擴(kuò)增
取2 u 1待檢樣品和陰性對(duì)照的第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，以HEV137F2、 HEV137R2為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序同第一輪PCR擴(kuò)增。
HE137F2: 5， -GGG YTG ATT CTC AGC CCT TCG-3， (序列表中序列3);
HE137R2: 5， -GMY TGG TCD CGC CAA GHG G_3， (序列表中序列4)。
配制2%瓊脂糖凝膠，取5u 1待檢樣品和陰性對(duì)照的第二輪產(chǎn)物，取5wl陽性 對(duì)照的第一輪產(chǎn)物，與lul上樣緩沖液混合后加樣，100-120V，電泳20-30min，紫外燈下觀察結(jié)果。
PCR結(jié)果如圖1所示，陰性對(duì)照無產(chǎn)物條帶、陽性對(duì)照出現(xiàn)150bp的目標(biāo)片段，
待檢樣品中有130bp左右的條帶，說明待檢樣品為HEV陽性。
圖1中1，2泳道為陽性對(duì)照，150bp;3，4泳道為待檢樣品；M:DNAmarker DL2000。 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的核苷酸序列與GenBank號(hào)
AJ272108至5'末端第5315-5451位的同源性應(yīng)在74%-100%，根據(jù)同源性的高低可
鑒定其基因型為l， 2， 3或4型。其中一個(gè)PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列7。序列表
<110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
<160> 6
<210> 1
〈211〉 21
<212〉 DNA <213>人工序列
<220> 〈223〉
<220〉
〈221〉 misc—feature
<223〉 r=A或G
<400〉 1
ccrgcrgtgg tttctggggt g 21
<210〉 2
<211〉 19
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220> <223〉<220>
<221> misc—feature
<223> Y《或T; M二A或C
<400> 2
tgggraytggt cdcgccaag 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220> <223>
<220>
<221> misc—feature
〈223> Y=C或T
<400〉 3
gggytgattc tcagcccttc g 21
〈210> 4
<211> 19
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220> <223><220〉
<221> misc—feature
<223〉 ]^A或C; Y《或T; H4或C或T; D二A或G或T
<■〉 4
gmytggtcdc gccaaghgg 19
<210〉 5
<211〉 20
<212> DNA <213〉人工序列
<220> 〈223〉
<400> 5
gtccactggt gtcttcacga 20
<210〉 6
〈211〉 18
<212> DNA 〈213>人工序列
<220〉 <223〉
〈400〉 6
gctgacgatc ttgagggt 18
<210〉 7 <211> 137<212〉 DNA <213>人工序列
〈220> <223〉
<400> 7
gggttgattc tcagcccttc gccctcccct atattcatcc aaccaacccc ttcgcatctg 60
acattccagc cgccgccggg actggagctc gccctcggca gccaatccgt ccactcggct 120
ccgcttggcg tgaccag 13權(quán)利要求
1、戊型肝炎病毒的檢測(cè)試劑盒，含有4條引物，所述4條引物的核苷酸序列為序列表中序列1至序列4所示。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒還含有2條陽 性對(duì)照引物，所述陽性對(duì)照引物的核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示。
3、 一種檢測(cè)戊型肝炎病毒的方法，是以待測(cè)樣品的cDNA為模板，以序列表中序 列1和序列表中序列2所示的DNA分子為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，獲得第一輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；以所述第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以序列表中序列3和序列表中序列4 所示的DNA分子為引物進(jìn)行第二論P(yáng)CR擴(kuò)增，獲得第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)所述第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，100-150bp之間有條帶的為戊型肝炎病毒陽性。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中還包括以序列表中序 列5和序列6的DNA分子為引物，以待測(cè)樣品的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
5、 權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)戊型肝炎病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明的戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒含有4條引物，所述4條引物的核苷酸序列為序列表中序列1至序列4所示。所述試劑盒還含有2條陽性對(duì)照引物，所述陽性對(duì)照引物的核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示。本發(fā)明的戊型肝炎病毒的快速檢測(cè)試劑盒可用于臨床診斷、監(jiān)測(cè)，科研及大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101603097SQ20091008616
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月15日
發(fā)明者佘銳萍, 泉 孫, 君 尹, 張艷梅, 李文貴, 李睿文 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)