專利名稱：一種抗人α1酸性糖蛋白的單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫化學、蛋白質(zhì)化學和細胞生物學領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種 可以產(chǎn)生特異針對人α 1酸性糖蛋白(AGP，Seruma 1-acidglycoprotein)的單克隆抗體的 雜交瘤細胞系及其制備方法。該雜交瘤制備的單克隆抗體可以應(yīng)用于疾病的診斷或者相關(guān) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的翻譯后修飾狀態(tài)與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)，其中糖蛋白發(fā)揮了多種重要的 生物功用，如細胞膜上的糖蛋白參與胚胎發(fā)育、細胞移動、免疫反應(yīng)以及細胞分裂等過程。 另外，大部分血漿蛋白都具有不同程度的糖基化修飾。值得注意的是，現(xiàn)在已知的作為各種 疾病檢測標記物的蛋白質(zhì)都是糖蛋白，如PSA，AFP，CA125，CA153和HER-2等。多年來，關(guān)于 對血漿中的生物標記物的檢測的研究取得了一定的進展。其中最重要的方法就是生產(chǎn)針對 這些蛋白的抗體，通過ELISA的方法實現(xiàn)對這些蛋白的檢測和定量。該方法的關(guān)鍵即是獲 得特異性好、靈敏度高的抗體。目前，傳統(tǒng)的生產(chǎn)抗體的方法已經(jīng)相當成熟且在大多數(shù)情況 下非常有效，但是對于血漿中的這些糖蛋白抗體的生產(chǎn)，傳統(tǒng)的方法往往存在一定的不足， 這是由于具有天然糖基化修飾的蛋白難以獲得，而且糖蛋白的抗原性往往不強。原核表達 的蛋白，由于不具有糖基化修飾，籍此產(chǎn)生的抗體往往不能很好地識別人血液中的糖蛋白。 糖蛋白抗體的生產(chǎn)通?？梢酝ㄟ^富集和純化生物體內(nèi)的天然糖蛋白作為抗原，采用傳統(tǒng)的 抗體生產(chǎn)方法進行抗體制備。但是這種方法對于那些在生物體內(nèi)含量較低，或者難于純化 的糖蛋白并不合適。而且更重要的是，在一系列體外操作過程中，對糖蛋白的各種性質(zhì)是否 造成不同程度的影響，也是不得而知的。因此為了克服以上困難，一些科學家已經(jīng)研發(fā)出新 的抗體制備方法以獲得特異針對糖蛋白的抗體。McKenzie采用小鼠腹腔注射在其細胞膜 上穩(wěn)定表達外源糖蛋白Neu的腫瘤細胞作為免疫抗原的方法，刺激機體產(chǎn)生并篩選出針對 該蛋白的單克隆抗體。在該方法中，將Neu基因?qū)氲絆TH3T3細胞中，使其在細胞膜上穩(wěn) 定表達。細胞通過腹腔注射入小鼠后，該蛋白的細胞外部分即可作為抗原刺激機體產(chǎn)生抗 體。該方法克服了膜上糖蛋白難于富集純化的困難，而且實驗結(jié)果也表明，這種方法生產(chǎn)的 抗體比依靠合成Neu蛋白上的肽段作為抗原生產(chǎn)出的抗體具有更好的特異性，可以區(qū)分與 其相似性極高的蛋白。Atabai也通過類似的方法將穩(wěn)定表達MFGE8蛋白的人的腫瘤細胞注 射到兔子體內(nèi)，通過篩選獲得特異性單克隆抗體。Suzuki等將h印arin的糖鏈連接到載體 蛋白KLH上作為抗原，采用傳統(tǒng)方法注射到小鼠體內(nèi)，篩選出可特異識別該糖鏈的單克隆 抗體。但是上述研究并沒有能夠提供一種應(yīng)用性廣泛的方法，而且實驗操作比較復雜。本發(fā)明人以人AGP為例，試圖建立一套可生產(chǎn)特異識別糖基化蛋白的抗體的方 案，由此生產(chǎn)的單克隆抗體可基本上克服糖蛋白抗原性低下和糖蛋白抗體特異性差的缺 陷。將外源的糖蛋白基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入到小鼠黑色素瘤細胞B16中，經(jīng)過篩選 獲得穩(wěn)定表達株。該表達株可以持續(xù)地將外源糖蛋白分泌到細胞外。將穩(wěn)定細胞株和佐劑 混合后經(jīng)皮下注射到C57BL/6J小鼠體內(nèi)，隨著細胞的不斷增殖和生長，外源糖蛋白被持續(xù)分泌到小鼠體內(nèi)作為抗原刺激機體產(chǎn)生抗體。將血清呈陽性反應(yīng)的小鼠脾細胞與骨髓瘤細 胞進行融合后，通過多次篩選，可以得到可特異識別外源糖蛋白的單克隆抗體。該方法與傳 統(tǒng)的生產(chǎn)糖蛋白單克隆抗體的方法相比具有明顯的優(yōu)勢在此過程中，細胞表達分泌的蛋 白具有正確的糖基化修飾，不需對它們進行富集，而且這些抗原是持續(xù)性的分泌到小鼠體 內(nèi)，不斷刺激機體的免疫系統(tǒng)，這樣既解決了糖蛋白富集的難題，又解決了糖蛋白抗原性低 的問題。我們采用該方法成功地生產(chǎn)了 AGP的單克隆抗體，這些抗體可以特異性的識別糖 基化修飾的AGP，而對非糖基化的AGP幾乎不具有識別能力。

發(fā)明內(nèi)容
一)本發(fā)明涉及一種能夠特異性識別血漿糖蛋白AGP的鼠源單克隆抗體BPI-AGP， 以及該單克隆抗體在疾病檢測中的應(yīng)用。該單克隆抗體BPI-AGP的亞類為IgGl型，而且可 以特異性的識別糖基化修飾的AGP，而對非糖基化的AGP幾乎不具有識別能力。二)本發(fā)明涉及一種能夠分泌特異性識別AGP單克隆抗體的雜交瘤細胞系。該雜 交瘤細胞系產(chǎn)生的抗AGP單克隆抗體BPI-AGP用于對血液中糖蛋白的表達水平的檢測。如 用于檢測疾病狀態(tài)下患者血液中AGP的豐度改變。三)本發(fā)明涉及制備該雜交瘤細胞系的方法，其中包括1)將含有帶有RFP標簽 的外源基因AGP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞，收集病毒后感染B16細胞，并通過藥 物處理進行穩(wěn)定株的篩選，通過RFP抗體檢測穩(wěn)定株對這些糖蛋白的分泌；2)將所得的穩(wěn) 定株與弗氏完全佐劑混合后，經(jīng)皮下注射到C57BL/6J小鼠脾臟側(cè)的腰窩處；3)使用弗氏完 全佐劑進行腹部皮下注射以增強免疫反應(yīng)；4)使用人血漿蛋白和原核表達的AGP對單克隆 抗體同時進行篩選，以獲得特異針對糖基化修飾蛋白的單克隆抗體；5)對這些單克隆抗體 的檢測和評估。四)本發(fā)明選擇了分泌蛋白作為抗原，該抗原可以分泌到細胞外，直接入血，刺激 機體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。與傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法不同，該抗原是隨著細胞的生長而不斷持 續(xù)被分泌到細胞外的。因此，引起的刺激也是連續(xù)性的。在細胞和宿主選擇方面，黑色素瘤 細胞B16即是宿主C57BL/J6小鼠來源的，因此，注射了穩(wěn)定株細胞的小鼠只對外源性的分 泌糖蛋白有免疫反應(yīng)，而不會對B16細胞自身來源的其他任何蛋白有免疫反應(yīng)。這一策略 保證了生產(chǎn)出的抗體的單一性和優(yōu)越性。而B16細胞是一種易轉(zhuǎn)染、對外源基因可以穩(wěn)定 高效表達的細胞。五)本發(fā)明對標簽蛋白紅色熒光蛋白RFP的引入同時考慮到了三方面的因素1) 由于RFP基因是融合在外源糖蛋白的C端，因此，它不會對蛋白的分泌產(chǎn)生影響，而在整個 轉(zhuǎn)染、感染和篩選的過程中，紅色熒光可以表明轉(zhuǎn)染、感染效率以及外源蛋白在細胞內(nèi)的表 達狀況；2)在對篩選到的穩(wěn)定株進行檢測時，RFP抗體可以作為一個有效的工具，對外源糖 蛋白的分泌進行測定；3)作為一種載體蛋白，RFP可以增加肌體對糖蛋白的免疫反應(yīng)。該原 理類似于在使用多肽作為免疫原時采用KLH作為載體蛋白增強免疫反應(yīng)。這是由于糖蛋白 上的糖鏈作為一種半抗原降低了糖蛋白的抗原性，因此使用分子量較大的RFP(28Kd)，而不 是通常用的HIS-Tag等作為融合蛋白。六)本發(fā)明傾向于選擇采用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體將外源基因?qū)氲紹16細胞中。 這是因為對一些基因長度比較大的糖蛋白來說，在與RFP基因融合后的基因長度過大不利于采用傳統(tǒng)的直接轉(zhuǎn)染的方法進行穩(wěn)定株的篩選。而逆轉(zhuǎn)錄病毒卻可以包裝比較大的基因 片斷，而且它的感染效率往往很高，可以大大縮短篩選穩(wěn)定株所需的時間。但本發(fā)明同樣也 涉及其他轉(zhuǎn)染方法在該抗體生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。七)本發(fā)明采用脾臟側(cè)腰窩處的皮下注射免疫。這主要是考慮到以下幾個方面 1)首先機體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要器官即是脾臟；2)在眾多的免疫方式中，抗原的直接脾 臟免疫方式已經(jīng)被證明是一種更加有效的選擇。但是，這種注射方法對于機體的影響顯著， 很可能造成動物的死亡。在本發(fā)明中，由于B16是一種惡性程度高、易轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞，很 易導致小鼠的死亡。如果將B16細胞直接注射小鼠脾臟內(nèi)，則在很短時間內(nèi)就可能導致小 鼠的死亡，而此時有效抗體還沒有大量產(chǎn)生。八)本發(fā)明首創(chuàng)佐劑與細胞混合注射。佐劑的使用在抗原呈遞過程中起到關(guān)鍵的 作用，可以大大提高抗體的產(chǎn)生。在本發(fā)明中，佐劑與細胞混合注射后，雖然會殺死部分細 胞，但是存活的細胞一旦分泌出糖蛋白后，其周圍的佐劑就會及時對這些抗原進行呈遞，增 加抗體的產(chǎn)生。我們的實驗亦表明佐劑的混合注射會明顯提高抗體的產(chǎn)出。而在細胞注射 后，單獨的佐劑腹下注射也是為了增強肌體的免疫反應(yīng)。九)本發(fā)明所涉及的生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)可適用于生產(chǎn)針對跨膜及膜外蛋白 (如細胞基質(zhì)類蛋白)的抗體。這是由于將這些基因轉(zhuǎn)入B16細胞后，這些位于細胞外的蛋 白或蛋白中的一部分可以作為抗原持續(xù)性的刺激機體產(chǎn)生抗體。該方法產(chǎn)生的抗體往往僅 識別跨膜蛋白的胞外區(qū)域，具有較強的特異性。而且這些跨膜及膜外蛋白往往也具有一定 的糖基化修飾，因此，使用該方法可以生產(chǎn)出可特異性識別這些糖基化修飾的抗體。使用該 方法也可以生產(chǎn)特異針對蛋白質(zhì)其它修飾形式的抗體，包括磷酸化、硝基化等。只要在天然 狀態(tài)下會發(fā)生修飾的蛋白，通過該方法都能生產(chǎn)出能特異識別該修飾形式蛋白的抗體。


圖1 表示穩(wěn)定株分泌蛋白的免疫印跡檢測結(jié)果，結(jié)果顯示帶有RFP融合標簽的糖 蛋白被順利地分泌到細胞外，且從目標蛋白的分子量變化上也表明AGP發(fā)生了明顯的糖基 化修飾。圖2 表示B16-RFP-AGP穩(wěn)定株的熒光鏡檢測結(jié)果，具體而言，B16-RFP-AGP的熒光 顯微照片表明紅色熒光僅分布在胞質(zhì)區(qū)域，這也證實了 AGP糖蛋白的分泌性質(zhì)。圖3 注射免疫B16-RFP-AGP穩(wěn)定株細胞的小鼠抗血清的免疫印跡檢測結(jié)果，具體 可見，免疫了 B16-RFP-AGP穩(wěn)定細胞系的小鼠抗血清中已經(jīng)包含了對蛋白糖基化修飾有特 異性的識別傾向的多克隆抗體。圖4 表示BPI-AGP單克隆抗體和Sigma-AGP單克隆抗體對不同修飾狀態(tài)AGP抗原 的免疫印跡差異識別的實驗結(jié)果，具體而言，BPI-AGP單克隆抗體對糖基化蛋白特異識別， 而對原核表達的無糖基化修飾的AGP沒有識別，對脫糖后AGP蛋白的識別也明顯的減弱。而 Sigma-AGP單克隆抗體對這兩種不同修飾形式的蛋白的識別沒有偏向性。圖5 表示BPI-AGP單克隆抗體和Sigma-AGP單克隆抗體對不同修飾狀態(tài)AGP抗 原的ELISA檢測結(jié)果的差異的實驗結(jié)果，具體而言，BPI-AGP單克隆抗體只對糖基化AGP有 特異的結(jié)合，而對原核表達的非糖基化AGP幾乎無結(jié)合。而Sigma-AGP單克隆抗體對兩者 的結(jié)合均沒有明顯的差異。
圖6 表示BPI-AGP單克隆抗體和Sigma-AGP單克隆抗體的免疫組化實驗結(jié)果， 該結(jié)果表明=BPI-AGP單克隆抗體對人肝臟組織中的糖基化AGP的識別的特異性高于 Sigma-AGP單克隆抗體對人肝臟組織中的糖基化AGP的識別。
具體實施例方式實施例1糖蛋白的基因克隆本發(fā)明人根據(jù)已公布的人AGP的基因序列(SEQ ID NO. 1)設(shè)計PCR引物AGP 5’正向引物5，-GCCAAGCTTATGGCGCTGTCCTGGGTTCT-3，(SEQ ID ON. 2)AGP 3’反向引物5，-GGCGGATCCTAGGATTCCCCCTCCTC-3，(SEQ ID ON. 3)以人肝cDNA文庫為模板，PCR擴增出全長AGP基因，(PCR參數(shù)95 °C 5分鐘； 940C 30s 54°C 30s 72°C 1 分鐘，共 40 個循環(huán)；72°C后延伸 10 分鐘)經(jīng) Hind III 和 BamH I 雙酶切后與PLNCX2-RFP質(zhì)粒連接(RFP基因來自于pDsRed2質(zhì)粒，從該質(zhì)粒上用Hind III 和Not I內(nèi)切酶將RFP基因切下后，連接到經(jīng)同樣雙酶切的PLNCX2質(zhì)粒上)，化學轉(zhuǎn)化感受 態(tài)細胞E. coli DH5 α，挑單克隆提取質(zhì)粒進行測序，驗證序列無誤。實施例2穩(wěn)定表達并分 泌外源糖蛋白的細胞株的構(gòu)建、篩選和驗證從Ε. coli DH5 α中提取構(gòu)建好的pLNCX2_RFP_AGP質(zhì)粒和編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋 白的質(zhì)粒 pVSV-G，按照 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000 (11668-019，Invitrogen)的量 為1 5的比例進行兩種質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染。在氯奎的幫助下，將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝 細胞GP2-293中。8小時后進行換液以清除氯奎對細胞的毒性作用。撤除氯奎后的48小時 后，收集GP2-293的培養(yǎng)基上清，此時的培養(yǎng)基中被釋放出的含有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒 顆粒最多。通過長時間的高速離心(4°C，50，000g，90分鐘)富集沉淀下來的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆 粒。將這些病毒進行復性后，加入到目標細胞B16的培養(yǎng)基中，在P0lybrene(H9268，Sigma) 試劑的幫助下，這些病毒即可感染B16細胞，同時將外源基因?qū)氲侥繕思毎?。感染后?細胞，在G418的篩選作用下，經(jīng)過大約2周的時間，即可獲得單克隆穩(wěn)定株細胞。采用免 疫印跡的方法對篩選得到的穩(wěn)定株進行驗證。方法如下將穩(wěn)定株細胞的完全培養(yǎng)基吸出 后，用生理鹽水洗細胞3次，然后換成無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時。收集這些無血清培 養(yǎng)基,通過截留分子量為30kD的Amicon Filter (UFC803008, Millipore)進行培養(yǎng)基中蛋 白質(zhì)的濃縮。濃縮40倍后的培養(yǎng)基即可直接用于免疫印跡檢測。圖1顯示了穩(wěn)定株分泌 到細胞外的糖蛋白的免疫印跡檢測結(jié)果以及圖2顯示的穩(wěn)定株(B16-RFP-AGP)的熒光顯微 照片。從圖1中可以看出帶有RFP融合標簽的糖蛋白被順利的分泌到細胞外，且從目標蛋 白的分子量變化上也表明AGP發(fā)生了明顯的糖基化修飾。從圖2中可以看出，B16-RFP-AGP 的熒光顯微照片表明紅色熒光僅分布在胞質(zhì)區(qū)域，這也證實了 AGP糖蛋白的分泌性質(zhì)。實施例3AGP重組抗原的制備根據(jù)已公布的人AGP的基因序列設(shè)計PCR引物AGP 5，正向引物5，-GCCGGATCCATGGCGCTGTCCTGGGTTCT-3，(SEQ ID 0N. 4)AGP 3’反向引物
5，-GGCAAGCTTCTAGGATTCCCCCTCCTC-3，(SEQ ID ON. 5)以人肝cDNA文庫為模板，PCR擴增出全長AGP基因，經(jīng)膠回收后進行BamH I和 Hind III雙酶切，回收后，與同樣雙酶切的pET28a載體進行連接，化學轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 E. coli DH5 α，經(jīng)過雙酶切驗證以及質(zhì)粒測序選取陽性克隆菌株。將選取的陽性克隆的質(zhì) ?；瘜W轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21 (DE3)。接種可表達AGP的BL21菌株，當菌液的OD值達到0. 6 左右時，加入lmmol/L IPTG誘導4小時。誘導以后的菌株經(jīng)超聲后離心，上清和沉淀分別 進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示表達的產(chǎn)物為包涵體蛋白。大量培養(yǎng)細菌，IPTG誘導4小時 后進行收菌，超聲破碎、離心、棄上清，在沉淀中加入含8M尿素的提取液溶解表達的包涵體 蛋白。再次離心后，上清即可用于純化。使用Ni-NAT親和層析柱對表達的AGP蛋白進行純 化，柱子經(jīng)平衡、上樣、淋洗后，使用10、20、50mM咪唑進行分段洗脫，去除其中的雜蛋白，最 后采用IOOmM咪唑洗脫目的蛋白。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，檢測AGP蛋白的純化效 果。其他所用的重組蛋白的制備，如RFP也經(jīng)歷了相同的表達和純化過程。實施例4抗人AGP單克隆抗體雜交瘤(BPI-AGP，保藏日2009年1月14日，保藏號 為CGMCC 2868，包藏地中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC)的制備穩(wěn)定分泌表達RFP-AGP的B16細胞經(jīng)胰酶消化并終止后，離心收集細胞。這些細胞 經(jīng)PBS洗滌三次后，用無血清的培養(yǎng)基重懸，進行細胞計數(shù)。按照等體積(IOOyL IOOyL) 的比例將5-10萬個細胞與弗氏完全佐劑反復吹打幾次，混勻?；靹蚝蟮幕旌衔锝?jīng)注射器注 射到小鼠脾臟側(cè)腰窩處的皮下。以后，每隔7天在小鼠腹部皮下注射弗氏完全佐劑進行免 疫加強。一個月后，通過眼眶取血，對血液中的抗血清進行免疫印跡檢測。選擇原核細胞 表達的AGP，人血中的糖基化修飾的AGP(G9885，Sigma)，B16穩(wěn)定表達株分泌的糖基化的 RFP-AGP蛋白以及原核細胞表達的RFP和RFP-AGP作為抗原檢測注射腫瘤細胞后的小鼠抗 血清的效價。每種蛋白上樣約200ng，進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后立即進 行電轉(zhuǎn)移，過程如下將PVDF膜置于5mL甲醇中，處理5分鐘；加入4倍體積(20mL)水，慢 加快搖，將甲醇逐級稀釋到20%，倒去液體；再用轉(zhuǎn)膜緩沖液(20%甲醇，25mM Tris-base, 192mM Glycine)平衡15分鐘。將凝膠浸泡于含有0. 01% SDS的轉(zhuǎn)膜緩沖液中，10分鐘。 按照黑板_海綿-濾紙_凝膠-PVDF膜一濾紙-海綿-白板的順序，做好三明治夾，放入 裝有 0. 01% SDS 轉(zhuǎn)膜緩沖液的 Trans-Blot Cell 轉(zhuǎn)膜儀中(Bio-Rad, Hercules, U. S. Α.)， 350mA，轉(zhuǎn)膜2小時。PVDF膜的進一步處理過程如下膜以PBST浸濕，加PBST配制5%脫脂 奶粉封閉，室溫搖床上搖2小時，4°C過夜，PBST洗膜后加入1 2000稀釋的小鼠抗血清，室 溫下孵育2小時，洗膜后加入1 4000的羊抗鼠IgG的二抗(用HRP標記)，孵育1小時， 再次PBST洗膜，使用ECL增強型免疫印跡檢測試劑盒(RPN2132，GE Healthcare)發(fā)光，X 片曝光。圖3是注射了穩(wěn)定株細胞后的小鼠血清的免疫印跡檢測結(jié)果。免疫印跡實驗結(jié)果 (圖3)顯示在注射免疫了穩(wěn)定株細胞的小鼠血清中已經(jīng)產(chǎn)生了可識別標簽蛋白RFP以及 RFP-AGP原核表達的融合蛋白的抗體，同時，該多克隆抗體還可特異識別糖基化修飾蛋白， 包括B16-RFP-AGP分泌到胞外的發(fā)生了糖基化修飾的AGP以及人血中天然存在的發(fā)生了糖 基化修飾的AGP。而該抗體卻對原核表達的無糖基化修飾的AGP沒有識別。這表明該多克 隆抗體具有了對糖基化修飾的蛋白有特異性的識別傾向。用Western blot的方法檢測小鼠多抗血清的效價，如在1 2000稀釋或稀釋比例更高的情況下可以檢測0.5 μ L人血漿中的AGP即可用于進一步融合實驗。取免疫效價達到 要求的C57BL/6J小鼠的脾臟，放在細胞篩上碾碎，按5 1的比例與SP2/0細胞經(jīng)PEG1500 進行融合。既融合后的細胞用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)HAT進行篩選，挑出500個 單克隆細胞在96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。使用原核表達純化的RFP以及去除了白蛋白和免疫球 蛋白的人血清蛋白(Albumin/IgG Removal Kit,Cat. 122642，CALBIOCHEM)分別作為抗原包 板，對這些單克隆細胞的培養(yǎng)基上清進行ELISA篩選出分別識別不同抗原的抗體。得到的 陽性克隆細胞先注射小鼠生產(chǎn)腹水，然后進行凍存。實施例5單克隆抗體的純化從-80°C冰箱或液氮罐中迅速取出凍存管；迅速放入水浴鍋中快速攪動，使凍存 液在2分鐘內(nèi)全部融化成液體。用75%酒精擦拭凍存管。往15mL離心管中加入3mL血清 培養(yǎng)基，將凍存液吸入離心管，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。棄上清，用完全培養(yǎng)基懸起細 胞，培養(yǎng)于6孔板或瓶中。6孔板中培養(yǎng)基為3mL，第二天換液，再補足3mL ；培養(yǎng)瓶培養(yǎng)基 為5mL。對數(shù)生長期細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起；計數(shù)大約5 X 105，ImL0懸浮的細胞腹 腔注射小鼠。一般7-10天后便可開始收集腹水，每隔2、3天可重復取，最終可收集I-IOmL/ 只。每次取出的腹水4000轉(zhuǎn)，10分鐘離心，中間為腹水。小心吸出腹水收集于離心管中， 4°C保存。將腹水在4°C條件下，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去除脂類物質(zhì)。離心后吸取上清， 并用偶聯(lián)緩沖液以1 3(腹水，偶連液比)稀釋，過0.22μπι膜，用HiTrap Protein A FF(17-5079-01，GE Healthcare)純化單克隆抗體。用5-10柱體積的偶聯(lián)緩沖液平衡柱子 后上樣。再用5倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱。在收集管中加入60-200 μ L中和液，利于維 持抗體的生物活性，避免抗體失活。用5倍柱體積洗脫緩沖液洗脫抗體，并收集在步驟6的 收集管中?？梢缘玫郊兓^高的單克隆抗體。這些抗體被命名為BPI-AGP抗體。實施例6單克隆抗體親和常數(shù)的測定包被免疫用人血清中純化出的糖基化AGP(G9885，Sigma)以及原核表達純化的 AGP，包被濃度為2 μ g/mL，100 μ L/孔，4°C包被過夜，IXPBST洗3次。每孔加200 μ L封 閉液37°C封閉2小時，IXPBST洗3次。抗AGP單克隆抗體(BPI-AGP)以及商品單克隆抗 體(A5566，Sigma)，從1 200開始2倍梯度稀釋，最后1孔留空白對照，37°C孵育1小時， IXPBST洗3次。HRP標記的羊抗鼠二抗1 20000稀釋，每孔100 μ L，37°C孵育1小時， IXPBST洗3次。顯色液100 μ L/孔顯色10分鐘，50 μ L/孔終止液終止反應(yīng)。用酶標儀測 定吸光值。親和常數(shù)《抗臺二度(A為Bmax/2時的抗體稀釋倍數(shù))150000為單個IgG抗體平均分子量值，抗體原始濃度單位為mg/mL。結(jié)果顯示，商 品單克隆抗體(A5566，Sigma)對糖基化AGP (G9885，Sigma)和原核表達的非糖基化AGP的 親和常數(shù)分別為3X109和2. 3X 109，而BPI-AGP單克隆抗體對糖基化AGP和原核表達的非 糖基化AGP的親和常數(shù)分別為9X108和1X104。實施例7單克隆抗體亞類測定用IOOmM PBS (ρΗ7· 4)稀釋包被羊抗鼠 IgG 至 0. 5 μ g/mL,每孔加 100 μ L，4°C，過 夜。傾空液體，用含0.05%吐溫的PBS洗3次，每孔加入200yL封閉液，37°C孵育1小時。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加入0. ImL雜交瘤上清，37°C孵育1小時。傾空液體用 PBS-T清洗3次。用封閉液1 1000稀釋HRP標記的羊抗鼠(κ，λ )抗體或1 2000稀 釋HRP標記的羊抗鼠(IgM, IgGl, IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗體0. ImL每孔，分別加入適當 的孔中，37°C用孵育1小時。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加50 μ L底物溶液，10-20 分鐘內(nèi)測405nm波長下的OD值。實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體為IgGl型鼠源單克隆抗體。實施例8本發(fā)明單 克隆抗體用途的驗證_免疫印跡選擇原核細胞表達的AGP，人血中的糖基化修飾的AGP (G9885，Sigma)以及脫糖后 的AGP作為抗原可以分別檢測本發(fā)明單克隆抗體和商品的抗體(A5566，Sigma)在對不同抗 原識別的特異性。脫糖過程如下將50 μ g的人血AGP蛋白溶解到45 μ L的20mM pH 8. 0的碳酸氫 銨緩沖液中。然后加入5yL 0.2% SDS和IOOmM β-巰基乙醇的變性溶液。100°C加熱 10分鐘將糖蛋白變性。冷卻到室溫后，加入5μ L 15%的TRITON X-100，混勻。最后加入 5 μ LPNGase F混勻后，37°C溫育3小時。100°C加熱5分鐘終止反應(yīng)。免疫印跡實驗過程如下每種蛋白上樣約200ng，進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳， 電泳結(jié)束后立即進行電轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移過程同實施例4。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，冰浴中 350mA恒流轉(zhuǎn)移2小時。雜交過程如下膜以PBST浸濕，加PBST配制5%脫脂奶粉封閉，室 溫搖床上搖2小時，4°C過夜，PBST洗膜后加入1 2000BPI-AGP單克隆抗體或1 10，000 商品單克隆抗體(A5566，Sigma)，室溫下孵育2小時，洗膜后加入1 4000的羊抗鼠IgG 的二抗(用HRP標記)，孵育1小時，再次PBST洗膜，使用ECL增強型免疫印跡檢測試劑盒 (RPN2132，GE Healthcare)發(fā)光，X片曝光。圖4顯示的是兩種單克隆抗體的免疫印記的結(jié) 果，從圖4中可以看出，BPI-AGP單克隆抗體對糖基化蛋白有特異的識別，如，B16-RFP-AGP 分泌到胞外的發(fā)生了糖基化修飾的AGP以及人血中天然存在的發(fā)生了糖基化修飾的AGP。 而該抗體卻對原核表達的無糖基化修飾的AGP沒有識別，對脫糖后AGP蛋白的識別也明顯 的減弱。而商品的單克隆抗體對這兩種不同修飾形式的蛋白的識別沒有偏向性，如對人血 中天然存在的發(fā)生了糖基化修飾的AGP和原核表達的無糖基化修飾的AGP以及脫糖后AGP 蛋白的識別都沒有明顯的差異。實施例9本發(fā)明單克隆抗體用途的驗證-ELISA實驗從原核表達產(chǎn)物中純化出的AGP和從Sigma購買的從人血中純化出的糖基化 AGP(G9885，Sigma)分別作為抗原用來檢測BPI-AGP抗體和商品AGP抗體的差異。每孔 200ng的抗原，4°C過夜包被。PBST溶液洗2次，2% BSA溶液37°C封閉2小時。PBST溶液 洗 2 次，PBS 不同稀釋梯度的一抗(1 200,1 400,1 800，. . . 1 256000) 37°C孵育 1小時。PBST溶液洗3次，1 20000稀釋的HRP標記的抗鼠二抗37°C孵育1小時。PBST 溶液洗3次，加入顯色底物TMB進行顯色，2M H2SO4終止反應(yīng)。450nm讀取的光吸收值如圖 5。從圖5中可以明顯看出BPI-AGP單克隆抗體只對糖基化AGP有特異的識別，其對糖基化 AGP(200ng)的效價為1 50，000，對原核表達的非糖基化AGP幾乎無識別。而商品AGP抗 體對兩者的識別沒有明顯的差異，效價都在1 100，000左右。實施例10本發(fā)明單克隆抗 體用途的驗證_免疫組化實驗組織切片的蠟片經(jīng)二甲苯脫蠟后，再經(jīng)100 %，95 %，85 %，75 %乙醇進行水化。0. 3% H2O2室溫10分鐘，去除組織內(nèi)的辣根過氧化物酶活性，PBS洗3次X 5分鐘。5%脫 脂奶粉，37°C封閉2小時。滴加一抗(BPI-AGP抗體以及商品單克隆抗體)(1 500)，濕盒 4°C過夜，PBS洗3次X 5分鐘，滴加羊抗鼠二抗，室溫孵育60分鐘，PBS洗3次X 5分鐘， DAB-H2O2顯色，鏡下控制3-5分鐘，PBS漂洗，終止顯色，蘇木素復染45秒，鹽酸酒精分 色，溫熱的自來水沖洗反藍，75 %，85 %，95 %和100 %乙醇脫水各15分鐘，二甲苯透明，中 性樹膠封片。如圖6所示，圖6顯示BPI-AGP抗體與商品AGP抗體對人肝臟組織中的糖基 化AGP的識別差異不大，但是BPI-AGP抗體的特異性更好。序列表<110>北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司<120> 一種抗人α 1酸性糖蛋白單克隆抗體及其制備方法<130><160>5<170>PatentIn version 3. 5<210>1
<211>606<212>DNA<213>human<400>1atggcgctgtccattgtgtgggcaagtggtgagatccaagagagagtacccgggaaaatgatcctcaggggggctgtctggaagctctcggataagtgtgtcctag<210>2<211>29<212>DNA<213>primer<400>2gccaagctta tggcgctgtc ctgggttct29<210>3<211>26<212>DNA<213>primer
cctgggttcttacagtcctgagcctcctacctctgctggaagcccagatc60ccaacctagtaccggtgcccatcaccaacgccaccctggaccggatcact120tttatatcgcatcggcctttcgaaacgaggagtacaataagtcggttcag180caaccttcttttacttcacccccaacaagacagaggacacgatctttctc240agacccgacaggaccagtgcatctataacaccacctacctgaatgtccag300ggaccatctccagatacgtgggaggccaagagcatttcgctcacttgctg360acaccaagacctacatgcttgcttttgacgtgaacgatgagaagaactgg420tctatgctgacaagccagagacgaccaaggagcaactgggagagttctac480actgcttgcgcattcccaagtcagatgtcgtgtacaccgattggaaaaag540agccactggagaagcagcacgagaaggagaggaaacaggaggagggggaa600 606
<400>3ggcggatcct aggattcccc ctcctc26<210>4<211>29<212>DNA<213>primer<400>4gccggatcca tggcgctgtc ctgggt tct 29<210>5<211>27<212>DNA<213>primer<400>5ggcaagcttc taggattccc cctcctc2權(quán)利要求
一種單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體是由保藏日為2009年1月14日、保藏號為CGMCC 2868的小鼠雜交瘤細胞系BPI AGP產(chǎn)生的。
2.含有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的免疫組化試劑，其用于檢測人肝癌組織和正常 組織中AGP的表達差異。
3.含有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的免疫印跡試劑，其用于檢測人血液中AGP的表達。
4.含有權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附試劑，其用于檢測人血液總AGP 的表達。
5.權(quán)利要求1所述單克隆抗體的用途，其用于制備檢測人肝癌組織和正常組織中AGP 的表達差異的免疫組化試劑的用途。
6.權(quán)利要求1所述單克隆抗體的用途，其用于制備檢測人血液中AGP的表達的免疫印 跡試劑的用途。
7.權(quán)利要求1所述單克隆龍抗體的用途，其用于制備檢測人血液中AGP的表達的酶聯(lián) 免疫吸附試劑的用途。
8.權(quán)利要求1所述單克隆抗體進行檢測的方法，其包括使用權(quán)利要求1的單克隆抗體 與生物樣品接觸。
9.一種由注射免疫帶有外源基因agp的細胞株B16制備單克隆抗體的方法，其特征在 于所述單克隆抗體制備方法是將所得的穩(wěn)定細胞株B16與弗氏完全佐劑混合后，經(jīng)皮下注 射到C57BL/6J小鼠脾臟側(cè)的腰窩處。
10.權(quán)利要求9所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所使用的注射免疫用細胞 株是近親動物來源的腫瘤細胞。
11.權(quán)利要求9所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述外源基因agp帶有RFP標簽。
12.權(quán)利要求9所述單克隆抗體的制備方法，其包括那些位于細胞質(zhì)膜上，雖然不能被 分泌到胞外，但有部分序列伸出到胞外的蛋白。
13.權(quán)利要求9所述單克隆抗體的制備方法中，其包括除糖基化蛋白質(zhì)之外的其他翻 譯后修飾形式蛋白質(zhì)的特異性單克隆抗體的生產(chǎn)。
14.權(quán)利要求9所述單克隆抗體的制備方法中，其包括使用該思路通過除C57BL/6J小 鼠之外的其他動物生產(chǎn)特異性抗體的方法。
15.一種小鼠雜交瘤細胞系BPI-AGP，保藏號為CGMCC 2868，其特征在于所述小鼠雜交 瘤細胞株穩(wěn)定地分泌權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明旨在制備針對α1酸性糖蛋白(AGP，Serum α1-acidglycoprotein)的特異性單克隆抗體，并建立與之相應(yīng)的實驗方法。具體地說，該單克隆抗體可以選擇性地識別糖基化修飾的天然AGP蛋白，但與原核表達的非糖基化修飾的AGP蛋白的親和性很低。該單克隆抗體的亞型為IgG1，親和常數(shù)為9×108。本發(fā)明提供了分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞系BPI-AGP，保藏號為CGMCC 2868；它能夠穩(wěn)定分泌高效價的抗AGP天然蛋白的單克隆抗體。BPI-AGP可用于對血液中AGP蛋白質(zhì)的檢驗。同時，本發(fā)明還提供了一套制備針對糖基化修飾蛋白質(zhì)的單克隆抗體雜交瘤的方法。
文檔編號C12N5/20GK101921336SQ20091008635
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者任艷, 劉國振, 劉斯奇, 劉玲, 吳 琳, 徐寧志, 潘秦, 韋漢福 申請人:北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司