專利名稱：一種制備?；?l-肉堿和/或l-肉堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備酰基-L-肉堿和/或L-肉堿的方法。
背景技術(shù)：
L-肉堿被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和飼料工業(yè)。目前，生產(chǎn)L-肉堿的方法 主要有提取法、化學(xué)合成法和生物催化法。其中，具有商業(yè)化價(jià)值的是化學(xué)合成法和生物催 化法。生物催化法較化學(xué)合成法具有環(huán)境友好、低成本、產(chǎn)品安全性高等特點(diǎn)，發(fā)展前景較 好。巴豆甜菜堿在肉堿脫水酶催化下合成L-肉堿是制備L-肉堿的重要途徑之一， 也是目前采用生物催化法生產(chǎn)L-肉堿的主要方法。但是以巴豆甜菜堿為前體制備L-肉 堿的方法存在以下問(wèn)題(1)前體轉(zhuǎn)化率低。為了提高前體轉(zhuǎn)化率，許多研究正在進(jìn)行， 包括高密度細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)、固定化細(xì)胞技術(shù)、基因育種技術(shù)以及上述技術(shù)的集成。但目 前轉(zhuǎn)化率僅達(dá)到 42% 的野生菌(Ccinovas M, Bernal V, Gonzalez Μ. Factors affecting the biotransformation of trimethylammonium compounds into1-carnitine by Escherichia coli [J]. Biochemical Engineering Journal，2005，26 :145—154.)禾口轉(zhuǎn)化率 達(dá)至1」70%的重組菌(〇已8{611已獷 MR, Obon JM,Mariη Α. L(-) -carnitine production using a recombinant Escherichia coli strain[J]. Enzyme and Microbial Technology,2001, 28:785-791.)，嚴(yán)重影響了其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，為此國(guó)內(nèi)相關(guān)企業(yè)被迫停產(chǎn)。(2)產(chǎn)物和前體難 以分離。以巴豆甜菜堿為前體的L-肉堿制備方法中，產(chǎn)物分離和純化的關(guān)鍵技術(shù)是如何分 離物化性質(zhì)極其接近的未轉(zhuǎn)化的巴豆甜菜堿和產(chǎn)物L(fēng)-肉堿。孫志浩等(孫志浩.生物催化 工藝學(xué)[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005 =503-532.)采用亞硫酸鹽和巴豆甜菜堿發(fā)生加成 反應(yīng)的方法實(shí)現(xiàn)了巴豆甜菜堿和L-肉堿的分離，但存在巴豆甜菜堿不能回收利用的問(wèn)題。 此外，從我國(guó)肉堿工業(yè)的發(fā)展?fàn)顩r來(lái)看，還存在?；?L-肉堿產(chǎn)品種類較少的問(wèn)題。目前，我國(guó)在L-肉堿的制備方面進(jìn)行了一些工作如1996年，孫志浩等通過(guò)UV和 60Co誘變得到E. coli CGMCC0276，采用分批轉(zhuǎn)化培養(yǎng)E. coli CGMCC0276可以使L-肉堿的 產(chǎn)量達(dá)到15g/l以上，最高達(dá)到21. 5g/l，且巴豆甜菜堿的轉(zhuǎn)化率達(dá)到40%，最高達(dá)到42%; 該方法還采用亞硫酸鹽法將未轉(zhuǎn)化的巴豆甜菜堿和L-肉堿相分離(孫志浩.生物催化工 藝學(xué)[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005 :503-532.)。2000年，王玉萍等通過(guò)溴化乙錠誘變， 得到一株大腸桿菌突變株，該突變株轉(zhuǎn)化巴豆甜菜堿的最高轉(zhuǎn)化率為40% (王玉萍，譚訓(xùn) 剛，陳師勇等.肉堿脫水酶突變株的獲得及其休止細(xì)胞反應(yīng)條件的優(yōu)化[J].生物技術(shù)通 訊，2000(4) :261-263. )。2001年，呂忠等篩選出菌株E. coli K74，該菌株在最適條件轉(zhuǎn)化 巴豆甜菜堿的最大轉(zhuǎn)化率達(dá)20. 3% (呂忠，王玉萍，李翔太等.產(chǎn)L-肉堿的菌種篩選及發(fā) 酵條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)雜志，2001(1) :4-6·)。2002年，范立強(qiáng)等分別構(gòu)建caiB基因和 caiE基因的表達(dá)質(zhì)粒pET28caiB和pET22caiE，利用雙抗生素篩選法，獲得能穩(wěn)定遺傳的雙 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，這兩個(gè)基因可以在大腸桿菌中共表達(dá)，其表達(dá)量分別占菌體總 蛋白的39%和20% ；共轉(zhuǎn)化菌中，肉堿脫水酶的酶活力比pET28caiB單轉(zhuǎn)化菌提高了 2.3倍(范立強(qiáng)，袁勤生，吳祥甫.大腸桿菌caiE基因的克隆與高效表達(dá)[J].華東理工大學(xué)學(xué) 報(bào)，2002，28 (2) 149-152.)。在?；?L-肉堿的酶催化合成方面，中山大學(xué)和中山尤利卡天 然藥物有限公司于2007年以乙腈和無(wú)溶劑體系作為反應(yīng)介質(zhì)合成了共軛亞油酰-L-肉堿， 其制備工藝已獲得國(guó)家發(fā)明專利。 國(guó)外在L-肉堿的制備方面也進(jìn)行了一些工作如1997年，Jose Maria Obon 等提出將L-肉堿和未轉(zhuǎn)化的巴豆甜菜堿相分離的若干個(gè)方法(0b0n JM, Maiquez JR, Canovas Μ.L (-)-Carnitine production with immobilized Escherichiu coli cells in continuous reactors [J].Enzyme and Microbial Technology,1997, 21 :531-536.)。1999年，Obon等為提高生產(chǎn)率發(fā)展了野生菌Ε. coli 044K74的高 密度培養(yǎng)連續(xù)生產(chǎn) L-肉堿的方法(0b0n JM, Maiquez JR, Canovas Μ. High-density Escherichia coli cultures forcontinuous L-carnitine production[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1999，51 :760_764)。2001 年，M. R. Castellar 研究 了利用重組菌Ε. coli K38pT7-5KE32生產(chǎn)L-肉堿的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率(Castellar MR, Obon JM, Marin A. L(-)-carnitine production using a recombinant Escherichia coli strain[J], Enzyme and Microbial Technology，2001，28 :785_791·)。 2003 $， Mariateresa Giul iano研究了在L-肉堿生產(chǎn)中用聚乙烯醇冷凍凝膠對(duì)奇異變形桿 菌(Proteus mirabilis)進(jìn)行固定化，對(duì)轉(zhuǎn)化率、生產(chǎn)率和產(chǎn)量的影響(Giuliano M， Schiraldi C, Maresca C. Immobilized Proteus mirabilis in poly (vinyl alcohol) cryogels for L (-)-carnitine production[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003,32 :507-512.)。2005 年，Μ. Canovas 研究了 重組菌 Ε· coliK38pT7_5KE32 和野 生菌Ε. coli 044K74在不同工藝條件下的轉(zhuǎn)化率(Ccinovas Μ, Bernal V, Gonzalez Μ. Factors affecting the biotranstormation of trimethylammonium compounds into l-carnitine by Escherichia coli[J]. Biochemical Engineering Journal,2005,26 145-154.)。2005年，Angel Sevilla提出了肉堿合成中的中心碳代謝改變方向形成產(chǎn) 物的路徑，并做了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，第一次把肉堿代謝和糖酵解反應(yīng)、磷酸戊糖途徑以及其他代 謝途徑的中間物質(zhì)在ATP水平上連接在一起(Sevilla A, Schmid Jff, Mauch K. Model of central and trimethylammonium metabolism for optimizingL-carnitine production by E. coli [J], Metabolic Engineering,2005，7 :401_425.)。Angel Sevilla 的研究 對(duì)L-肉堿在大腸桿菌中的代謝優(yōu)化(使之朝著L-肉堿產(chǎn)量增加的方向進(jìn)行)起著指 導(dǎo)作用。2006年，M. Canovas通過(guò)對(duì)高細(xì)胞密度反應(yīng)穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)行脈沖處理，同時(shí)監(jiān)測(cè) 相關(guān)酶活性的演變，提供了在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中乙醛酸循環(huán)起著重要作用以及為維持代謝 物的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)化需要高水平ATP的實(shí)驗(yàn)性證據(jù)(Canovas M，Sevilla A, Bernal V. Role of energetic coenzyme pools in the production of L-carnitine by Escherichia coli [J], Metabolic Engineering, 2006,8 (6) :603_618.)。M. Canovas 的研究從細(xì)胞生 理學(xué)和生物化學(xué)的水平提供了用以優(yōu)化、控制L-肉堿生產(chǎn)模式及過(guò)程的信息。2006年， Manuel Canovas采用流式細(xì)胞技術(shù)，研究了在分批式轉(zhuǎn)化和高細(xì)胞密度連續(xù)式膜反應(yīng) 器中，利用生長(zhǎng)的和休止的大腸桿菌細(xì)胞將巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-肉堿過(guò)程中的細(xì)胞狀 態(tài)(Canovas M，Garcia V，Bernal V. Analysis of Escherichia coli cell state by flow cytometry during whole cell catalyzed biotransformation for L-carnitineproduction [J]. Process Biochemistry, 2007,42 (1) :25_33· )。Manuel Canovas 的石if究描 繪了生物反應(yīng)器環(huán)境中大腸桿菌的特征，為優(yōu)化L-肉堿的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程提供了指導(dǎo)。2006 年，Daniel V. Guebel等通過(guò)對(duì)以大腸桿菌為菌種的L-肉堿生產(chǎn)工藝的模式進(jìn)行分析，得 出延胡索酸、甘油、蛋白胨或酪蛋白水解物等對(duì)菌體生長(zhǎng)和肉堿代謝的影響，并闡明了它們 的代謝途徑和代謝特征(Guebel DV, Torres NV, Canovas Μ. Modeling analysis of the L(-)-carnitine production process by Escherichia coli[J].Process Biochemistry, 2006，41 =281-288.)。Daniel V. Guebel的研究為L(zhǎng)-肉堿生產(chǎn)過(guò)程的優(yōu)化提供了指導(dǎo)。綜上所述，目前以提高巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化率、L-肉堿生產(chǎn)率和產(chǎn)量(尤其是轉(zhuǎn)化 率)為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)菌種選育、工藝優(yōu)化以及代謝途徑的優(yōu)化幾個(gè)方面進(jìn)行了大量研究。近 年來(lái)趨向于在細(xì)胞生理學(xué)和生物化學(xué)的水平上研究菌種(主要是大腸桿菌)的生理狀態(tài) 和L-肉堿的代謝途徑及代謝特征，從而提供用以優(yōu)化、控制L-肉堿生產(chǎn)模式及過(guò)程的信 息。在?；?L-肉堿的酶催化合成方面，Lozano等(2003年)以脂肪酶Novozyme 435 作為催化劑研究了丁酰-L-肉堿在不同反應(yīng)介質(zhì)中的合成，篩選出適于?；?L-肉堿酶 催化合成的反應(yīng)介質(zhì)為乙腈(Lozano P, Daz Μ, de Diego Τ, et al. Ester synthesis from trimethylammonium alcohols in dry organic media catalyzed by immobilized Candida antarctica lipase B[J]. Biotechnology and Bioengineering,2003,82 352-358.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備?；?L-肉堿和/或L-肉堿的方法。本發(fā)明所提供的制備?；?L-肉堿的方法，包括以下步驟1)將巴豆甜菜堿和肉堿脫水酶加入到含有^!!！加化&離子液體的水溶液中， 30-45°C條件下反應(yīng)2-12h ；2)除去步驟1)反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶和水分；3)在步驟2)的反應(yīng)體系中加入脂肪酶和?；w，30-80°C條件下反應(yīng)2_24h，得 到含有?；?L-肉堿的反應(yīng)體系。上述方法還包括用萃取劑將步驟3)反應(yīng)體系中的?；?L-肉堿萃取出來(lái)的步驟 和除去步驟3)反應(yīng)體系中的脂肪酶的步驟。上述方法還包括以下步驟a)將含有肉堿脫水酶的緩沖液加入到上述反應(yīng)體系中，30-45 °C條件下反應(yīng) 2-12h ；b)除去步驟a)反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶和水分；c)在步驟b)的反應(yīng)體系中加入脂肪酶和?；w，30-80°C條件下反應(yīng)2_24h，得 到?；?L-肉堿。上述將?；?L-肉堿從反應(yīng)體系中萃取出來(lái)的步驟、除去反應(yīng)體系中脂肪酶的步 驟和上述a)-c)的步驟至少重復(fù)一次。上述方法中，所述含有[Bmim]PF6離子液體的水溶液中，[Bmim]PF6離子液體的體 積百分含量大于0，小于等于98% ；具體可為90% -95%。上述方法中，所述步驟1)和步驟a)中還包括加入電子接受體的步驟，所述電子接
5受體為硝酸鉀、富馬酸或富馬酸鹽，具體可為硝酸鉀。上述方法中，所述步驟1)和步驟a)的反應(yīng)條件為在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40°C、 120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3h ；所述步驟2)和步驟b)中，采用離心的方法除去肉堿脫水酶，所述離心的條件為 500-10000rmp 離心 0. 5_30min，具體可為 4200rpm 離心 Imin ；所述步驟2)和步驟b)中，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40-100°C、0-300rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng) 10-300min除去反應(yīng)體系中的水分，具體可為60°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12min ；所述步驟3)和步驟c)的反應(yīng)條件為在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上60°C、120rpm轉(zhuǎn)速下 反應(yīng)2. 5h。上述方法中，所述步驟3)和步驟C)中，所述酰基供體為脂肪酸酯，如脂肪酸甲酯、 脂肪酸乙酯、脂肪酸乙烯酯或脂肪酸丙烯酯等，具體可為棕櫚酸乙烯酯、棕櫚酸甲酯或豆蔻 酸乙酯。上述方法中，所述萃取劑為醇類物質(zhì)，如叔戊醇、叔丁醇或丁醇等，具體可為叔戊醇。上述方法中，采用離心的方法除去脂肪酶，所述離心的條件為100-10000rpm離 心 0. 5-60min,具體可為 500rpm 離心 0. 5min。將采用上述方法制備的酰基-L-肉堿進(jìn)行水解，得到L-肉堿。本發(fā)明的制備?；?L-肉堿的方法可以同時(shí)解決我國(guó)L-肉堿生產(chǎn)中存在的以 下3個(gè)問(wèn)題(1)解決了以巴豆甜菜堿為前體合成L-肉堿的轉(zhuǎn)化率低的難題。將產(chǎn)物酰 基-L-肉堿從反應(yīng)體系中移除是可逆反應(yīng)中提高轉(zhuǎn)化率的一個(gè)行之有效的方法。(2)解決 了以巴豆甜菜堿為前體合成L-肉堿的產(chǎn)物分離和純化的關(guān)鍵技術(shù)。將L-肉堿酰基化，利用 萃取或?qū)游黾夹g(shù)很容易將?；?L-肉堿和巴豆甜菜堿相分離，并實(shí)現(xiàn)未反應(yīng)巴豆甜菜堿的 回收。(3)制備出了?；?L-肉堿。?；?L-肉堿可以作為終產(chǎn)品，也可以水解得到L-肉 堿。


圖1為本發(fā)明的制備?；?L-肉堿的反應(yīng)路線圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。棕櫚酰-L-肉堿制備過(guò)程的反應(yīng)路線圖如圖1所示。實(shí)施例1、制備棕櫚酰-L-肉堿1)將20ml [BmimjPF6離子液體(購(gòu)自河南利華制藥有限公司)、1. 5mmol巴豆甜菜 堿(范立強(qiáng)，袁勤生.微生物轉(zhuǎn)換法-DL-肉堿解旋的新思路[J].藥物化學(xué)，1999，34 (5) 335-337) UOOmg KN03、200mg肉堿脫水酶和Iml pH6. 5的磷酸緩沖溶液置于125ml圓底燒 瓶中，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3h，得到L-肉堿。此階段反應(yīng)為肉堿脫水酶催化的巴豆甜菜堿生成L-肉堿的水合反應(yīng)。2)將上述步驟1)的反應(yīng)液4200rpm離心lmin，除去反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶，將分離得到的肉堿脫水酶置于Iml pH 6. 5的磷酸緩沖溶液，用于下一個(gè)循環(huán)的水合反應(yīng)；然 后將反應(yīng)體系在60°C、82kPa真空度、120rpm轉(zhuǎn)速下保持12min，以除去反應(yīng)體系中的水分。3)在上述步驟2)的反應(yīng)體系中添加600mg脂肪酶、2mmol棕櫚酸乙烯酯，然后將 反應(yīng)體系在60°C、IOkPa真空度、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)2. 5h，得到棕櫚酰-L-肉堿。此階段反應(yīng)為脂肪酶催化合成棕櫚酰-L-肉堿的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。4)用叔戊醇將棕櫚酰-L-肉堿從上述步驟3)的反應(yīng)體系中萃取出來(lái)，然后將反應(yīng) 體系500rpm離心0. 5min，分離出脂肪酶；再在反應(yīng)體系中加入上述步驟2)獲得的含有肉 堿脫水酶的緩沖溶液，將反應(yīng)體系在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3h，繼續(xù) 進(jìn)行肉堿脫水酶催化的水合反應(yīng)。重復(fù)上述步驟2-4的過(guò)程共4次，但每次重復(fù)過(guò)程中，棕櫚酸乙烯酯的添加量遞減 50%。采用DTNB法對(duì)上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。即將反應(yīng)產(chǎn)物(棕櫚酰-L-肉堿)進(jìn)行 水解，得到L-肉堿，L-肉堿在肉堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下，乙酰輔酶A中的乙酰基團(tuán)被轉(zhuǎn) 移到L-肉堿上，釋放的游離輔酶A(CoASH)與5，5/-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)發(fā)生不 可逆反應(yīng)，產(chǎn)物之一的5-硫-2-硝基苯甲酸鹽(TNB-)在412nm處有光吸收。如果采用上 述方法得到的反應(yīng)產(chǎn)物中含有L-肉堿，則在412nm處有光吸收，否則沒(méi)有光吸收。而且，光 吸收值與L-肉堿的量正相關(guān)，具體的檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)孫志浩.生物催化工藝學(xué)[M]. 北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005 503-532 ；ModerM, Kie β ling A,Loster H. Current methods for determination of L-carnitine and acylcarnitines[J]. Monatshefte f￡ur Chemie 2005，136，1279-1291。以上的檢測(cè)結(jié)果表明，采用上述方法得到的產(chǎn)物為棕櫚酰-L-肉堿。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，以上方法實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物棕櫚酰-L-肉堿的間歇萃取，從 而使棕櫚酰-L-肉堿的產(chǎn)率得到提高，通過(guò)5次間歇萃取，棕櫚酰-L-肉堿的摩爾產(chǎn)率達(dá)到 87士4. 98%。將上述制備得到的棕櫚酰-L-肉堿進(jìn)行水解，得到L-肉堿。實(shí)施例2、制備棕櫚酰-L-肉堿(步驟2-4的過(guò)程不重復(fù))1)將20ml [BmimjPF6離子液體(購(gòu)自河南利華制藥有限公司)、1. 5mmol巴豆甜菜 堿(范立強(qiáng)，袁勤生.微生物轉(zhuǎn)換法-DL-肉堿解旋的新思路[J].藥物化學(xué)，1999，34 (5) 335-337) UOOmg KN03、200mg肉堿脫水酶和Iml pH6. 5的磷酸緩沖溶液置于125ml圓底燒 瓶中，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上30°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12h，得到L-肉堿。此階段反應(yīng)為肉堿脫水酶催化的巴豆甜菜堿生成L-肉堿的水合反應(yīng)。2)將上述步驟1)的反應(yīng)液500rpm離心30min，除去反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶，將 分離得到的肉堿脫水酶置于Iml pH 6. 5的磷酸緩沖溶液，用于下一個(gè)循環(huán)的水合反應(yīng)；然 后將反應(yīng)體系在40°C、IOOkPa真空度下保持300min，以除去反應(yīng)體系中的水分。3)在上述步驟2)的反應(yīng)體系中添加600mg脂肪酶、2mmol棕櫚酸乙烯酯，然后將 反應(yīng)體系在30°C、IOkPa真空度、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)24h，得到棕櫚酰-L-肉堿。此階段反應(yīng)為脂肪酶催化合成棕櫚酰-L-肉堿的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。4)用叔戊醇將棕櫚酰-L-肉堿從上述步驟3)的反應(yīng)體系中萃取出來(lái)，然后將反應(yīng) 體系IOOrpm離心60min，分離出脂肪酶；再在反應(yīng)體系中加入上述步驟2)獲得的含有肉堿 脫水酶的緩沖溶液，將反應(yīng)體系在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上30°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12h，繼續(xù)進(jìn)行肉堿脫水酶催化的水合反應(yīng)。采用DTNB法對(duì)上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，具體的檢測(cè)方法同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果表 明，采用上述方法得到的產(chǎn)物為棕櫚酰-L-肉堿。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，棕櫚酰-L-肉堿的摩爾產(chǎn)率達(dá)到63. 4士2. 17%。將上 述制備得到的棕櫚酰-L-肉堿進(jìn)行水解，得到L-肉堿。實(shí)施例3、制備棕櫚酰-L-肉堿(步驟2-4的過(guò)程重復(fù)1次)1)將20ml [BmimjPF6離子液體(購(gòu)自河南利華制藥有限公司)、1. 5mmol巴豆甜菜 堿(范立強(qiáng)，袁勤生.微生物轉(zhuǎn)換法-DL-肉堿解旋的新思路[J].藥物化學(xué)，1999，34 (5) 335-337)、50mg富馬酸、200mg肉堿脫水酶和Iml pH6. 5的磷酸緩沖溶液置于125ml圓底燒 瓶中，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上45°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)2h，得到L-肉堿。此階段反應(yīng)為肉堿脫水酶催化的巴豆甜菜堿生成L-肉堿的水合反應(yīng)。2)將上述步驟1)的反應(yīng)液IOOOOrpm離心0. 5min,除去反應(yīng)體系中的肉堿脫水 酶，將分離得到的肉堿脫水酶置于Iml pH 6.5的磷酸緩沖溶液，用于下一個(gè)循環(huán)的水合反 應(yīng)；然后將反應(yīng)體系在90°C、60kPa真空度、300rpm轉(zhuǎn)速下保持lOmin，以除去反應(yīng)體系中的 水分。3)在上述步驟2)的反應(yīng)體系中添加600mg脂肪酶、2mmol棕櫚酸乙烯酯，然后將 反應(yīng)體系在80°C、IOkPa真空度、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)2h，得到棕櫚酰-L-肉堿。此階段反應(yīng)為脂肪酶催化合成棕櫚酰-L-肉堿的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。4)用叔戊醇將棕櫚酰-L-肉堿從上述步驟3)的反應(yīng)體系中萃取出來(lái)，然后將反應(yīng) 體系IOOOOrpm離心0. 5min，分離出脂肪酶；再在反應(yīng)體系中加入上述步驟2)獲得的含有 肉堿脫水酶的緩沖溶液，將反應(yīng)體系在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上45°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)2h，繼 續(xù)進(jìn)行肉堿脫水酶催化的水合反應(yīng)。重復(fù)上述步驟2-4的過(guò)程共1次，但每次重復(fù)過(guò)程中，棕櫚酸乙烯酯的添加量遞減 50%。采用DTNB法對(duì)上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，具體的檢測(cè)方法同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果表 明，采用上述方法得到的產(chǎn)物為棕櫚酰-L-肉堿。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，以上方法實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物棕櫚酰-L-肉堿的間歇萃取，從 而使棕櫚酰-L-肉堿的產(chǎn)率得到提高，通過(guò)2次間歇萃取，棕櫚酰-L-肉堿的摩爾產(chǎn)率達(dá)到 74. 8士3. 07%。將上述制備得到的棕櫚酰-L-肉堿進(jìn)行水解，得到L-肉堿。實(shí)施例4、制備棕櫚酰-L-肉堿(步驟2-4的過(guò)程重復(fù)2次)1)將20ml [BmimjPF6離子液體(購(gòu)自河南利華制藥有限公司)、1. 5mmol巴豆甜菜 堿(范立強(qiáng)，袁勤生.微生物轉(zhuǎn)換法-DL-肉堿解旋的新思路[J].藥物化學(xué)，1999，34 (5) 335-337)、80mg富馬酸鈉、200mg肉堿脫水酶和Iml pH6. 5的磷酸緩沖溶液置于125ml圓底 燒瓶中，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3h，得到L-肉堿。此階段反應(yīng)為肉堿脫水酶催化的巴豆甜菜堿生成L-肉堿的水合反應(yīng)。2)將上述步驟1)的反應(yīng)液4200rpm離心lmin，除去反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶，將 分離得到的肉堿脫水酶置于Iml pH 6. 5的磷酸緩沖溶液，用于下一個(gè)循環(huán)的水合反應(yīng)；然 后將反應(yīng)體系在60°C、82kPa真空度、120rpm轉(zhuǎn)速下保持12min，以除去反應(yīng)體系中的水分。3)在上述步驟2)的反應(yīng)體系中添加600mg脂肪酶、2mmol棕櫚酸甲酯，然后將反應(yīng)體系在60°C、IOkPa真空度、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)2. 5h，得到棕櫚酰-L-肉堿。此階段反應(yīng)為脂肪酶催化合成棕櫚酰-L-肉堿的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。4)用叔丁醇將棕櫚酰-L-肉堿從上述步驟3)的反應(yīng)體系中萃取出來(lái)，然后將反應(yīng) 體系500rpm離心0. 5min，分離出脂肪酶；再在反應(yīng)體系中加入上述步驟2)獲得的含有肉 堿脫水酶的緩沖溶液，將反應(yīng)體系在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3h，繼續(xù) 進(jìn)行肉堿脫水酶催化的水合反應(yīng)。重復(fù)上述步驟2-4的過(guò)程共2次，但每次重復(fù)過(guò)程中，棕櫚酸甲酯的添加量遞減 50%。采用DTNB法對(duì)上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，具體的檢測(cè)方法同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果表 明，采用上述方法得到的產(chǎn)物為棕櫚酰-L-肉堿。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，以上方法實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物棕櫚酰-L-肉堿的間歇萃取，從 而使棕櫚酰-L-肉堿的產(chǎn)率得到提高，通過(guò)3次間歇萃取，棕櫚酰-L-肉堿的摩爾產(chǎn)率達(dá)到 80. 9士4. 11%。將上述制備得到的棕櫚酰-L-肉堿進(jìn)行水解，得到L-肉堿。實(shí)施例5、制備豆蔻酰-L-肉堿(步驟2-4的過(guò)程重復(fù)3次)1)將20ml [BmimjPF6離子液體(購(gòu)自河南利華制藥有限公司)、1. 5mmol巴豆甜菜 堿(范立強(qiáng)，袁勤生.微生物轉(zhuǎn)換法-DL-肉堿解旋的新思路[J].藥物化學(xué)，1999，34 (5) 335-337) UOOmg KN03、200mg肉堿脫水酶和Iml pH6. 5的磷酸緩沖溶液置于125ml圓底燒 瓶中，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3h，得到L-肉堿。此階段反應(yīng)為肉堿脫水酶催化的巴豆甜菜堿生成L-肉堿的水合反應(yīng)。2)將上述步驟1)的反應(yīng)液4200rpm離心lmin，除去反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶，將 分離得到的肉堿脫水酶置于Iml pH 6. 5的磷酸緩沖溶液，用于下一個(gè)循環(huán)的水合反應(yīng)；然 后將反應(yīng)體系在60°C、82kPa真空度、120rpm轉(zhuǎn)速下保持12min，以除去反應(yīng)體系中的水分。3)在上述步驟2)的反應(yīng)體系中添加600mg脂肪酶、2mmol豆蔻酸乙酯，然后將反 應(yīng)體系在60°C、IOkPa真空度、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)2. 5h，得到豆蔻酰-L-肉堿。此階段反應(yīng)為脂肪酶催化合成豆蔻酰-L-肉堿的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。4)用丁醇將豆蔻酰-L-肉堿從上述步驟3)的反應(yīng)體系中萃取出來(lái)，然后將反應(yīng)體 系500rpm離心0. 5min,分離出脂肪酶；再在反應(yīng)體系中加入上述步驟2)獲得的含有肉堿 脫水酶的緩沖溶液，將反應(yīng)體系在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3h，繼續(xù)進(jìn) 行肉堿脫水酶催化的水合反應(yīng)。重復(fù)上述步驟2-4的過(guò)程共3次，但每次重復(fù)過(guò)程中，豆蔻酰乙酯的添加量遞減 50%。采用DTNB法對(duì)上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，具體的檢測(cè)方法同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果表 明，采用上述方法得到的產(chǎn)物為豆蔻酰-L-肉堿。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，以上方法實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物豆蔻酰-L-肉堿的間歇萃取，從 而使豆蔻酰-L-肉堿的產(chǎn)率得到提高，通過(guò)4次間歇萃取，豆蔻酰-L-肉堿的摩爾產(chǎn)率達(dá)到 84. 9士4. 74%。將上述制備得到的豆蔻酰-L-肉堿進(jìn)行水解，得到L-肉堿。上述方法中，如果繼續(xù)重復(fù)上述步驟2-4的過(guò)程，則?；?L-肉堿的摩爾產(chǎn)率會(huì)有 所增加，但重復(fù)次數(shù)超過(guò)4次以后，?；?L-肉堿的摩爾產(chǎn)率不會(huì)有顯著性增加。
權(quán)利要求
一種制備?；?L 肉堿的方法，包括以下步驟1)將巴豆甜菜堿和肉堿脫水酶加入到含有[Bmim]PF6離子液體的水溶液中，30 45℃條件下反應(yīng)2 12h；2)除去步驟1)反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶和水分；3)在步驟2)的反應(yīng)體系中加入脂肪酶和?；w，30 80℃條件下反應(yīng)2 24h，得到含有?；?L 肉堿的反應(yīng)體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括用萃取劑將權(quán)利要求1 步驟3)反應(yīng)體系中的?；?L-肉堿萃取出來(lái)和除去權(quán)利要求1步驟3)反應(yīng)體系中的脂肪 酶的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法還包括以下步驟a)將含有肉堿脫水酶的緩沖液加入到權(quán)利要求2所述的反應(yīng)體系中，30-45°C條件下 反應(yīng)2-12h ；b)除去步驟a)反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶和水分；c)在步驟b)的反應(yīng)體系中加入脂肪酶和酰基供體，30-80°C條件下反應(yīng)2-24h，得到酰 基-L-肉堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2和3的步驟至少重復(fù)一次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述含有[Bmim]PF6離子液體的 水溶液中，[Bmim]PF6離子液體的體積百分含量大于0，小于等于98% ；優(yōu)選為90% -95%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求1的步驟1)和權(quán) 利要求3的步驟a)中還包括加入電子接受體的步驟，所述電子接受體為硝酸鉀、富馬酸和 富馬酸鹽，優(yōu)選為硝酸鉀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求1的步驟1)和權(quán) 利要求3的步驟a)的反應(yīng)條件為在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3h ；所述權(quán)利要求1的步驟2)和權(quán)利要求3的步驟b)中，采用離心的方法除去肉堿脫水 酶，所述離心的條件為500-10000rmp離心0. 5_30min，優(yōu)選為4200rpm離心Imin ；所述權(quán)利要求1的步驟2)和權(quán)利要求3的步驟b)中，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40-100°C、 0-300rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)10-300min除去反應(yīng)體系中的水分，優(yōu)選為60°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng) 12min ；所述權(quán)利要求1的步驟3)和權(quán)利要求3的步驟c)的反應(yīng)條件為在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上60°C、120rpm轉(zhuǎn)速下反應(yīng)2. 5h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求1的步驟3)和權(quán) 利要求3的步驟c)中，所述?；w為脂肪酸酯，優(yōu)選為脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸 乙烯酯或脂肪酸丙烯酯，更優(yōu)選為棕櫚酸乙烯酯、棕櫚酸甲酯或豆蔻酸乙酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于采用離心的方法除去脂肪酶，所述離心的 條件為100-10000rpm 離心 0. 5_60min，優(yōu)選為 500rpm 離心 0. 5min ；所述萃取劑為醇類物質(zhì)，優(yōu)選為叔戊醇、叔丁醇或丁醇。
10.一種制備L-肉堿的方法，是將按照權(quán)利要求1-9中任一所述的方法制備的酰 基-L-肉堿進(jìn)行水解，得到L-肉堿。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備?；?L-肉堿和/或L-肉堿的方法。該方法包括以下步驟1)將巴豆甜菜堿和肉堿脫水酶加入到含有[Bmim]PF6離子液體的水溶液中，30-45℃條件下反應(yīng)2-12h；2)除去步驟1)反應(yīng)體系中的肉堿脫水酶和水分；3)在步驟2)的反應(yīng)體系中加入脂肪酶和?；w，30-80℃條件下反應(yīng)2-24h，得到含有?；?L-肉堿的反應(yīng)體系。本發(fā)明的制備酰基-L-肉堿的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)解決了以巴豆甜菜堿為前體合成L-肉堿的轉(zhuǎn)化率低的難題。(2)解決了以巴豆甜菜堿為前體合成L-肉堿的產(chǎn)物分離和純化的關(guān)鍵技術(shù)。(3)制備出了?；?L-肉堿。?；?L-肉堿可以作為終產(chǎn)品，也可以水解得到L-肉堿。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101921814SQ20091008661
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者張鐘元, 王強(qiáng), 田金強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所