專利名稱：一株煙曲霉及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株煙曲霉及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鬼臼毒素(podophyllotoxin)主要存在于小檗科鬼臼屬及其近緣植物中，是一 類具有廣泛生物學活性的天然化合物，有擬雌激素樣、抗雌激素樣、抗癌、抗病毒、
抗真菌、鎮(zhèn)靜、抑制植物生長和抗氧化等作用。特別是其具有較強的抗癌活性，其 作用機制是抑制微管蛋白的解聚作用以阻止細胞分裂以及抑制DNA拓撲異構(gòu)酶的 活性。鬼臼毒素的糖苷衍生物etoposide和teniposide的毒性較低，對小細胞肺癌、 淋巴癌等多種腫瘤疾病均具有很好的療效而成為臨床應(yīng)用的廣譜抗腫瘤藥物。
目前，鬼臼毒素主要是從野生鬼臼類植物的根莖中提取得到，而這類植物在全 世界僅有4屬15種，我國有3屬12種，主要生長在秦嶺、西藏等高海拔地區(qū)，其 生長緩慢，且鬼臼毒素類物質(zhì)的含量較低。由于鬼臼毒素類物質(zhì)在醫(yī)學和農(nóng)林防治 等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，因而其需求量日益增加；對野生鬼臼類植物資源的大
量采集，已使其資源遭到嚴重破壞，造成生物多樣性和生態(tài)環(huán)境的不可逆的損失， 因此解決鬼臼毒素類物質(zhì)的來源問題具有重要意義。
由于植物生長環(huán)境復雜，難以模擬，且其生長周期長，很難進行大規(guī)模的人工 栽培，而組織培養(yǎng)技術(shù)對于鬼臼類植物也不適用；加之，鬼臼毒素類物質(zhì)化學結(jié)構(gòu) 復雜，化學合成雖可進行，但成本太高，而通過基因工程學手段構(gòu)建工程菌也由于 參與形成該類物質(zhì)的酶數(shù)量過多而無法進行。所以利用內(nèi)生菌具有產(chǎn)生和宿主相同 或相似的生物活性物質(zhì)的性質(zhì)，來解決鬼臼毒素的來源問題，可能是唯一也是最有 效的方法。
近年來，已有學者利用內(nèi)生菌具有產(chǎn)生和宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)的性 質(zhì)，對我國特有的一些鬼臼類植物的內(nèi)生菌進行了研究，已有從川八角蓮、中華山 荷葉中分離到青霉屬的內(nèi)生菌，其培養(yǎng)物經(jīng)層析分析具有與鬼臼毒素相同的Rf值 的報道(中華山荷葉內(nèi)生真菌的分離及其發(fā)酵產(chǎn)生藥用成分的初步研究，劉仕平、 曾松茸、郭仕平、楊春艷、張玲琪，中國藥物與臨床，2003.3 (3) : 227—228;川 八角蓮內(nèi)生真菌產(chǎn)鬼臼毒素類似物的初步研究，郭仕平、蔣斌、蘇瑩珍、劉仕平、張玲琪，生物技術(shù)，2004.14 (2) : 55-56.)。
此外，由于鬼臼類植物中還含有多種黃酮類化合物，因而其內(nèi)生菌也可能產(chǎn)生 黃酮類化合物。許多研究證實，黃酮類化合物在人體中具有多種生物活性，包括抗 氧化、抗癌、防癌、清除自由基、抗病毒、消炎和促進血管舒張等。此外，異黃酮 (如染料木黃酮和羥基異黃酮)還具有雌激素特性。黃酮類化合物的多種生理作用， 使其在醫(yī)藥、食品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株煙曲霉。
本發(fā)明所提供的煙曲霉是從甘肅省漳縣大草灘(海拔2700m)采集的植物桃兒 七(&'w; ocfo/ /zj;〃wm/zexflm/ram (7 o;;/e) J7"g)的根及根狀莖中分離、篩選、純化得 到的，根據(jù)其形態(tài)特征等證實屬于半知菌綱、叢梗孢目、叢梗孢科、曲霉屬，將其 命名為煙曲霄(T4s/ erg7'〃w^/^m/g"/2Ay) TEQA。煙曲霧(J5^erg///z^yi//wi^afus) TEQA 已于2009年6月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡 稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登 記號為CGMCCWe3115。
煙曲霉"^^gZ〃z^/wm/g^^) TEQA CGMCC処3115在PDA瓊脂培養(yǎng)上生 長迅速、菌落中心稍凸起、無輻射狀皺紋；菌落質(zhì)地絲絨狀到絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu) 大量，中部多、邊緣少，近于帶灰的橄欖綠或海貍灰；無滲出液；輕霉味；菌落反 面黃褐色或帶綠的淡黃色。
分生孢子頭幼時球形或半球形，成熟時呈致密的圓柱狀，150-350微米或更長； 分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，少量發(fā)生于氣生菌絲，通常前者的孢梗莖較長，后者的較 短，上部帶不同程度的綠色并逐漸膨大形成頂囊，壁平滑；頂囊燒瓶狀，直徑20-30 微米，但少數(shù)小頂囊的直徑僅有6.5-15微米，約1/2至lj3/4的表面可育，呈不同程 度的綠色或淺灰綠色；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，瓶梗5-8X2-2.5微米，近于平行；分生孢子 球形或近球形，直徑2.5-3微米或稍大，壁稍粗糙。
綜合上述特征，依據(jù)《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》等資料，上述分離得 到的菌株具有煙曲霉的基本特征，將其鑒定為煙曲霉(A^^7/^/謂^to)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和 /或黃芪苷的方法。
本發(fā)明所提供的制備鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃芪苷的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)上述煙曲霉(A;^g/〃船/wm^ ftw) TEQACGMCCWs3115，得到 鬼臼毒素(podophyllotoxin)禾n/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷(L-picropodophillotpxin 7'-0-( 0 -D-glucopyranosyl-(l—6)- P -D-glucopyranoside)禾口/或黃度苷(Astragalin)。
鬼臼毒素的結(jié)構(gòu)式如式i所示，表鬼臼毒素雙葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)式如式n所示， 黃芪苷的結(jié)構(gòu)式如式m所示
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上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。
所述培養(yǎng)條件為26-30°C 、 100-150rpm振蕩培養(yǎng)5-9天，具體可為28°C 、 120rpm 振蕩培養(yǎng)7天。
煙曲霉(A/^g/〃ws/Mm/gaft^) TEQA CGMCC ]^3115在制備鬼臼毒素和/或 表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃芪苷中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的煙曲霉"werg/〃M/wm/ga^s) TEQA CGMCC JYs 3115具有產(chǎn)生與桃 兒七相同的鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷以及黃酮類物質(zhì)黃芪苷的生理特性， 可用于鬼臼毒素類物質(zhì)及黃度苷的制備；本發(fā)明的制備鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素 雙葡萄糖苷和/或黃芪苷的方法，發(fā)酵條件簡單、菌種易培養(yǎng)、生產(chǎn)周期短，具有工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用潛力；對鬼臼毒素類物質(zhì)的資源開發(fā)提供了新途徑，對保護
植物生態(tài)多樣性具有重要意義。


圖1為煙曲霉(^perg/Z/ws/wm^m^) TEQACGMCC W2 3115的菌落形態(tài) 圖2為煙曲霉(^perg/〃ws/mm'gafws) TEQA CGMCC JVs 3115分生孢子頭形態(tài) 圖3為鬼臼毒素標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40) 圖4為表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60:
40)
圖5為黃芪苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40) 圖6為煙曲霉(v4^erg/〃^7W^"^y) TEQA CGMCC W 3115發(fā)酵液的氯仿提 取物的HPLC譜圖
圖7為表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=50:
50)
圖8為煙曲霉C^perg/〃w/Mm/gato) TEQA CGMCC Ws 3115發(fā)酵液的正丁醇 提取物的HPLC譜圖
具體實施例方式
下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物 材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1、煙曲霉(^^rg/〃M>y>m/gfl<to) TEQA CGMCC3115的分離及鑒
定
將采集自甘肅省漳縣大草灘(海拔2700m)的植物桃兒七(&力o;w^^/z;/〃Mm /2ex朋Aww f7 o;;/^ 7z力g)的根及根狀莖分別用自來水洗凈，在超凈工作臺中用75% 體積百分含量的乙醇處理5min，然后無菌水沖洗3-5次；而后再用2.5%質(zhì)量百分含 量的次氯酸鈉處理10min，再無菌水沖洗3-5次。用滅菌的鑷子和刀片將桃兒七的根 的外皮剝?nèi)?，再切?.5cmX0.5cm大小的小片種植于PDA固體培養(yǎng)基上，28"C培養(yǎng) 3-7天。同時將同樣滅菌處理過的桃兒七的根不做剝皮及切割，將桃兒七的根在PDA 培養(yǎng)基上滾動一周后，同條件培養(yǎng)作為對照觀察。
培養(yǎng)幾天后發(fā)現(xiàn)在桃兒七的根的切口處有菌絲長出，取切口處新長出的菌絲， 轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色的差異 及菌落長出時間的不同，分別挑取培養(yǎng)基邊緣的菌絲接種于新的PDA培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，直至篩選出單一的菌落，挑取單菌落作進一步研究。
將上述分離得到的單菌落接種至PDA培養(yǎng)基上，當細胞生長至對數(shù)生長后期， 菌落大小穩(wěn)定后，進行單菌落平均狀態(tài)的描述。結(jié)果表明，上述分離得到的菌株 TEQA在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落中心稍凸起，無輻射狀皺紋；菌落質(zhì)地絲 絨狀到絮狀，具體的菌落形態(tài)如圖1所示。
分生孢子結(jié)構(gòu)大量，中部多、邊緣少，近于帶灰的橄欖綠或海貍灰；無滲出液; 輕霉味；菌落反面黃褐色或帶綠的淡黃色。分生孢子頭幼時球形或半球形，成熟時 呈致密的圓柱狀，150-350微米或更長；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，少量發(fā)生于氣生
菌絲，通常前者的孢梗莖較長，后者的較短，上部帶不同程度的綠色并逐漸膨大形
成頂囊，壁平滑；頂囊燒瓶狀，直徑20-30微米，但少數(shù)小頂囊的直徑僅有6.5-15 微米，約l/2到3/4的表面可育，呈不同程度的綠色或淺灰綠色；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層， 瓶梗5-8X2-2.5微米，近于平行；分生孢子球形或近球形，直徑2.5-3微米，或稍 大，壁稍粗糙。上述篩選得到的菌株的分生孢子頭形態(tài)如圖2所示。其中，A為10x40 倍放大倍數(shù)下的分生孢子頭形態(tài)，B為10x100倍放大倍數(shù)下的分生孢子頭形態(tài)。
綜合上述特征，依據(jù)《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》等資料，上述分離得 到的菌株具有煙曲霉的基本特征，將其鑒定為煙曲霉(^t7e/^K廳扭to)，其 分類屬于半知菌綱、叢梗孢目、叢梗孢科、曲霉屬。煙曲霉(A^e^7/w/wmZg"to) TEQA已于2009年6月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)， 保藏登記號為CGMCCW2 3115。
實施例2、利用煙曲霉(^perg/〃附/wm/ga^;y) TEQA CGMCC W 3115制備鬼 臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和黃喪苷
馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的組成為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，加水定容 至1000mL。
配制方法如下將馬鈴薯去皮，切成約2ci^的小塊，放入燒杯中煮沸30min， 然后用雙層紗布過濾，取濾液加入葡萄糖，再補足水，pH自然。
將100ml制備好的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，滅菌備用。 挑取上述實施例1篩選得到的煙曲霉(A^erg/〃^/Mm/g加w)TEQA CGMCC Ws 3115 的單菌落接種于上述滅菌好的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28°C、 120r/min搖床培 養(yǎng)7天。用抽濾器將上述發(fā)酵液抽濾兩次，分別收集菌絲體與發(fā)酵液。將發(fā)酵液先后用 等體積的氯仿和正丁醇萃取，隨時取萃取液于紫外吸收檢測器下檢測，直至萃取液 在紫外吸收檢測器下無熒光，合并萃取液，減壓蒸餾回收，分別得到發(fā)酵液的氯仿 提取物和正丁醇提取物。
將上述獲得的發(fā)酵液的氯仿提取物和正丁醇提取物分別采用高效液相色譜法
(HPLC)進行檢測。同時以鬼臼毒素標準品(購自中國藥品生物制品檢定所)、 表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品(Changqi ZHAO, Akito NAGATSU, Keiichiro HATANO， Naohiro SHIRAI, Setsuko KATO, and Yukio OGIHARA ， New Lignan Glycosides from Chinese Medicinal Plant: Sinopodophillum emodi ， CT em. /Vwrm. 51 (3):55-261(2003))和黃芪苷標準品(購自中國藥品生物制品檢定所)作為對照， 具體的檢測方法如下-
高效液相色譜儀AglientllOO型；
色譜柱Aglient 1100 Eclipse XDB-C18 (5|im， 4.6x150mm); 檢測器紫外檢測器；檢測波長254nm;
色譜條件流動相甲醇水=60: 40 (用于發(fā)酵液氯仿提取物的HPLC分析)；
甲醇水=50: 50(用于發(fā)酵液正丁醇提取物的HPLC分析)；
流速0.5ml/min; 進樣量5^1; 柱溫室溫；
標準品鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷、黃底苷。 檢測前，將鬼臼毒素標準品、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品和黃芪苷標準品以 及上述煙曲霉(Aperg///w/i^/gflft ) TEQACGMCC地3115發(fā)酵液的氯仿提取物 和正丁醇提取物分別用甲醇充分溶解，0.45pm微孔濾膜過濾，采用外標法對上述發(fā) 酵液進行HPLC分析，每個樣品至少重復三次。實驗設(shè)三次重復，結(jié)果如圖3-8所 示。其中，圖3為鬼臼毒素標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40)， 圖4為表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40)， 圖5為黃芪苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40)，圖6為煙曲霉 /w仿/g"加力TEQA CGMCC W 3115發(fā)酵液的氯仿提取物的HPLC譜圖， 圖7為表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=50: 50)， 圖8為煙曲霉(v4^e/^〃站/wm/g"加)TEQA CGMCC Ws 3115發(fā)酵液的正丁醇提取物的HPLC譜圖。
將煙曲霉(A;^g/〃^/Mm/gfl^y) TEQACGMCC W 3115發(fā)酵液的氯仿提取物和 正丁醇提取物的HPLC譜圖分別與鬼臼毒素標準品、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品 和黃芪苷標準品的HPLC譜圖進行比對。
結(jié)果表明，在保留時間為8.276分鐘時，發(fā)酵液的氯仿提取物具有吸收峰，而鬼 臼毒素標準品在8.336分鐘時具有吸收峰，說明發(fā)酵液的氯仿提取物中含有鬼臼毒 素；在保留時間為3.402分鐘時，發(fā)酵液的氯仿提取物具有吸收峰，而表鬼臼毒素 雙葡萄糖苷標準品在3.400分鐘時具有吸收峰，說明發(fā)酵液的氯仿提取物中含有表 鬼臼毒素雙葡萄糖苷；在保留時間為4.879分鐘時，發(fā)酵液的氯仿提取物具有吸收 峰，而黃芪苷標準品在4.965分鐘時具有吸收峰，說明發(fā)酵液的氯仿提取物中含有 黃芪苷。而且，在保留時間為4.962分鐘時，發(fā)酵液的正丁醇提取物具有吸收峰， 而表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品在4.854分鐘時具有吸收峰，說明發(fā)酵液經(jīng)氯仿萃 取后再經(jīng)正丁醇萃取，提取物中含有表鬼臼毒素雙葡萄糖苷。以上結(jié)果表明，發(fā)酵 液的氯仿提取物中含有鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和黃芪苷這三種化合物； 而發(fā)酵液經(jīng)氯仿萃取后再經(jīng)正丁醇萃取，提取物中只含有表鬼臼毒素雙葡萄糖苷。
權(quán)利要求
1、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA，其保藏登記號為CGMCC № 3115。
2、 煙曲霉C4^er^7/us/wm/gflft^) TEQA CGMCC Ws 3115在制備鬼臼毒素和/ 或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃芪苷中的應(yīng)用。
3、 一種制備鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃度苷的方法，是發(fā) 酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述煙曲霉C4werg/〃us/wm/g^^) TEQA CGMCC 3115 ，得 到鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃芪苷。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為馬鈴 薯葡萄糖培養(yǎng)基。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為 26-30。C、 100-150rpm振蕩培養(yǎng)5-9天。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為28°C、 120rpm振蕩培養(yǎng)7天。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將發(fā) 酵液進行萃取的步驟。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述萃取的萃取劑為氯仿或正 丁醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可產(chǎn)生鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和黃芪苷的煙曲霉及其應(yīng)用。本發(fā)明的煙曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC № 3115具有產(chǎn)生與桃兒七相同的鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷以及黃酮類物質(zhì)黃芪苷的生理特性，可用于鬼臼毒素類物質(zhì)及黃芪苷的制備；本發(fā)明的制備鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和黃芪苷的方法，發(fā)酵條件簡單、菌種易培養(yǎng)、生產(chǎn)周期短，具有工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用潛力；對鬼臼毒素類物質(zhì)的資源開發(fā)提供了新途徑，對保護植物生態(tài)多樣性具有重要意義。
文檔編號C12P19/00GK101575576SQ200910086919
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者朱妍妍, 嫦 艾, 栗 賈, 趙長琦 申請人:北京師范大學