專利名稱：一株克雷伯氏菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株克雷伯氏菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抑郁癥被喻為“心理疾病中的感冒”，隨生活節(jié)奏的日益緊張、社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日益增 強(qiáng)等諸多應(yīng)激因素的加劇，抑郁癥的發(fā)病呈逐年上升的趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)目 前全球約有抑郁癥患者3. 4億，抑郁癥終生患病率6. 1 % -9. 5%，而更年期人群中抑郁癥發(fā) 病率可高達(dá)29. 2-38. 2%。WHO已將抗抑郁藥物列為21世紀(jì)最迫切需要研發(fā)的藥物之一。激素替代療法(hormone replacement therapy, HRT)已被用于更年期婦女抑郁癥 的治療，并顯示積極的作用。但長(zhǎng)期使用雌激素帶來(lái)的副作用(如患子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和 卵巢癌的機(jī)率增加等)使植物雌激素(具有雌激素和抗雌激素雙重活性，也稱作雌激素受 體部分激動(dòng)劑)類藥物的開(kāi)發(fā)研究引起了國(guó)際社會(huì)的關(guān)注。腸二醇(enterdiol，END)和腸內(nèi)酯(enterolactone，ENL)(見(jiàn)圖1)為國(guó)際公 認(rèn)的活性最強(qiáng)的植物雌激素類成分，因其只存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，故又被稱為哺乳動(dòng)物 木脂素。植物中的多種木脂素類成分均可在人體腸道細(xì)菌的作用下被轉(zhuǎn)化成為END， 并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為ENL，如開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚(secoisolariciresinol，SEC0)及其苷 SDG(secoisolariciresinol diglucoside)(見(jiàn)圖 1)，均為 END 和 ENL 的重要前體物質(zhì)。亞麻子(亞麻籽，flaxseed，linseed)為亞麻科植物亞麻(Linum usitatissimum) 的干燥成熟種子。亞麻子含有豐富的油脂(α-linolenic acid含量為57% )，為重要的油 料作物。脫脂后的植物殘?jiān)鼇喡樽悠芍蠸DG(以SDG-3-羥基-3-甲基戊二酸低聚體形式而 存在)含量最高(達(dá) 4%)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株克雷伯氏菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)，分離自中國(guó)人的人體腸道內(nèi)容物， 菌株名稱為Strain Si，已于2009年6月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3085。本發(fā)明還保護(hù)克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085在制備開(kāi) 環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚(SECO))中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種制備開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚的方法，是通過(guò)發(fā)酵克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085，得到開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚。所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp. ) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培養(yǎng)基 可為在無(wú)碳源培養(yǎng)基中加入底物得到的培養(yǎng)基；所述底物為亞麻子、海藻、芝麻子粕、黑麥 麩、油菜籽粕、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子中的至少一種。所述無(wú)碳源培養(yǎng)基可為如下培養(yǎng)基pH 7-8 ；每升含有NaCl 2_4g，L_半胱氨酸鹽 酸鹽 0. 2-0. 4g，硫代硫酸鈉 0. 2-0. 4g，NH4Cl 0. 5-1. 5g，KH2PO4 2_3g，K2HP041_2. 5g，其余為
3水。所述無(wú)碳源培養(yǎng)基具體可為如下培養(yǎng)基PH7. 5 ；每升含有NaC13g，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0. 3g，硫代硫酸鈉 0.3g，NH4Cl lg, KH2PO4 2. 6g，K2HPO4L 85g，其余為水。所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp. ) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培養(yǎng)基 還可為在庖肉培養(yǎng)基中加入底物得到的培養(yǎng)基；所述底物為亞麻子、海藻、芝麻子粕、黑麥 麩、油菜籽粕、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子中的至少一種。所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp. ) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培養(yǎng)基 中，所述底物的濃度具體可為5-60mg/mL。所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085可在有氧條件 下進(jìn)行。所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085也可在缺氧條 件下進(jìn)行。所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085具體可在氧 分壓3. 03975-10. 1325kPa的條件下進(jìn)行。本發(fā)明提供的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085可用于生 產(chǎn)開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚，而現(xiàn)有技術(shù)中，并沒(méi)有任何克雷伯氏菌生產(chǎn)開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚 的報(bào)道，本發(fā)明為生產(chǎn)開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚提供了一種新途徑，并且豐富了克雷伯氏菌的 菌株資源，具有重大意義。


圖1為END、ENL、SECO和SDG的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2為不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)液的HPLC色譜圖。圖3為不同時(shí)間點(diǎn)(l-9d)原代培養(yǎng)液中END峰面積變化曲線。圖4為不同時(shí)間點(diǎn)(I-Ild)第1代和第49代培養(yǎng)液中END峰面積變化曲線。圖5為“Strain-49”的10_5稀釋菌液在LB平板上菌落生長(zhǎng)情況。圖6為從“Strain-49”中挑選得到的32個(gè)單菌的脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜；圖中共顯 示33個(gè)泳道，其中第16泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，其余為分離的32個(gè)單菌。通過(guò)觀察電泳條帶 的差異，32個(gè)單菌可以歸屬為9類(I-IX)具有不同基因型的菌種。圖7為不同培養(yǎng)時(shí)間Strain Sl培養(yǎng)液的HPLC圖譜。圖8為與Strain Sl相似度較高的腸道菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)；Klebsiel Ia pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 為對(duì)照菌。圖9為Strain Sl培養(yǎng)液中SECO含量隨時(shí)間變化曲線。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)施例均設(shè)三次重復(fù)試驗(yàn)，定量結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中所用的無(wú)碳源培養(yǎng)基的配制方法如下磷酸緩沖液(PhosphateBuffered Saline, PBS, PH 7.4)制備方法稱取 KH2PO4 5. 2g和K2HPO4 3. 7g溶于200mL蒸餾水中，121 °C高壓滅菌15分鐘，保存于4°C冰箱。還原劑的配制方法稱取L-半胱氨酸鹽酸鹽30mg和硫代硫酸鈉30mg，溶于ImLPBS中，121°C高壓滅菌15分鐘，保存于4°C冰箱。無(wú)碳源培養(yǎng)基的的配制方法稱取NaCl 3g、NH4Cl lg、磷酸緩沖液100mL、還原劑 IOmL,混合，水定容至1升；調(diào)pH為7. 5。實(shí)施例1、克雷伯氏菌(Strain Si)的獲得以亞麻子粕為底物，END為目標(biāo)產(chǎn)物，采用傳統(tǒng)的傳代培養(yǎng)的方法從人體腸道菌群 中篩選具有生物轉(zhuǎn)化活性的單菌或組合菌。一、傳代培養(yǎng)1、傳代培養(yǎng)方法(1)增菌配制IOmL庖肉培養(yǎng)基(LB)，加入0. ImL還原劑和石蠟油，121°C高壓滅菌15分鐘。 另取凍存的人體腸道菌樣本ImL(該樣本分離自中國(guó)人的人體腸道內(nèi)容物)，接種于庖肉培 養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌24小時(shí)。(2)接種配制IOmL無(wú)碳源培養(yǎng)基，加入亞麻子粕50mg作為底物，用石蠟油覆蓋，121°C高壓 滅菌15分鐘。接種增菌后的菌液ImL于無(wú)碳源培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)。(3)樣本檢測(cè)每隔24h取200 μ L培養(yǎng)液，加入400 μ L水飽和正丁醇萃取，4800rpm/min離心10 分鐘，取上清液300 μ L于離心管中，氮?dú)獯蹈?，加?00 μ L色譜甲醇，12500rpm/min離心3 分鐘，取上清液20 μ L，HPLC檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示培養(yǎng)液在24h即可轉(zhuǎn)化產(chǎn)生END，并且其 含量在9天內(nèi)基本保持穩(wěn)定，培養(yǎng)至第6天時(shí)培養(yǎng)液中END含量相對(duì)較高(圖2和圖3)。因此，采用每間隔6天進(jìn)行1次傳代的培養(yǎng)方式進(jìn)行活性菌種篩選，具體方法如 下吸取培養(yǎng)6天的培養(yǎng)液lmL，接種于IOmL含有亞麻子粕(50mg)的無(wú)碳源培養(yǎng)基中， 石蠟油封存，37°C培養(yǎng)6天；繼續(xù)同法傳代培養(yǎng)，菌種于-80°C保存，將第一代菌液命名為 “ Strain-I ”，依此類推，分別命名為 “ Strain-2 ”，“ Strain-3 ”.......2、傳代培養(yǎng)結(jié)果隨著傳代次數(shù)的增加，培養(yǎng)液中產(chǎn)生END的轉(zhuǎn)化時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)液中 的END含量也逐漸降低。當(dāng)傳代培養(yǎng)至第49代時(shí)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生END的時(shí)間已經(jīng)延遲到第3天， 培養(yǎng)液中END含量最高的時(shí)間也延遲到第9天(圖4)。由此推斷活性菌的范圍(數(shù)目和種類)在第49代菌液中已經(jīng)被相對(duì)縮小，將其命 名為“Strain-49”?；钚跃鷮摹癝train-49”菌群中篩選。二、活性菌的篩選1、“ Strain-49 ” 劃板挑單菌采用劃板方法從“Strain-49”中挑選單菌。具體方法如下(1)增菌配制IOmL庖肉培養(yǎng)基，加入0. ImL還原劑和石蠟油，121°C高壓滅菌15分鐘。另 取“Strain-49”菌液lmL，接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌24小時(shí)。(2)挑選單克隆菌落以無(wú)碳源培養(yǎng)基對(duì)增菌后的“Strain-49”菌液進(jìn)行稀釋得10_2_10_5稀釋菌液，分 別接種于LB平板，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)果表明接種10_5稀釋菌液的LB平板上菌落生長(zhǎng)較好，可分清單個(gè)菌落，菌落表面觀白色，光滑，圓形，濕潤(rùn)，邊緣整齊，明顯可見(jiàn)大小菌 落(圖5)。從該菌液LB平板上隨機(jī)挑選32個(gè)單菌落，分別接種于IOmL庖肉培養(yǎng)基中，厭 氧條件下37°C增菌24小時(shí)，增菌后菌液于-80°C保存。2、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是用稀有位點(diǎn)的限 制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌的染色體DNA進(jìn)行酶切，得到較大的片段，然后在交變脈沖電場(chǎng)的作用 下進(jìn)行電泳分析，可將不同大小DNA片段分開(kāi)，穩(wěn)定性好，分辨力高。由于使用細(xì)菌的原位 酶切，可反映的是整個(gè)細(xì)菌的基因情況，而不是個(gè)別的小片段，因而可以顯示基因組的微小 變化，所以采用PFGE法對(duì)從“Strain-49”中分離得到的32個(gè)單菌進(jìn)行分析。(1)菌液培養(yǎng)配制IOmL庖肉培養(yǎng)基32份，分別加入0. ImL還原劑和石蠟油，121 °C高壓滅菌15 分鐘。另取凍存的32個(gè)單菌樣本各lmL，分別接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌 24小時(shí)。(2)細(xì)胞裂解和基因組DNA分離參照文獻(xiàn)進(jìn)行(參照文獻(xiàn)方法王月丹.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程.北 京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008)。(3)酶切與脈沖場(chǎng)電泳參照文獻(xiàn)進(jìn)行(參照文獻(xiàn)方法LiuS L，Hessel A, Sanderson K Ε. The XbaI-BlnI-CeuL genomic cleavage map of Salmonella enteritidis shows an inversion relative to Salmonella typhimurium LT2. Mol. Microbiol.,1993,10 (3) 655-664)。采用限制性內(nèi)切酶SpeI消化所獲得的電泳條帶的數(shù)目和大小比較適中、清晰，容 易辨認(rèn)，不同類型的菌株間差異顯著。通過(guò)將基因組被消化后片段的多少、位置與分子量 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，可以確定該32個(gè)單菌來(lái)源于9類(I-IX)細(xì)菌。如圖6所示。編號(hào)為1、2、 4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、21、22、23、29 的共 18 個(gè)單菌歸為同一類細(xì)菌(I 類細(xì) 菌)，因?yàn)檎紗尉昕倲?shù)的9/16，推測(cè)該類細(xì)菌為活性菌群中的優(yōu)勢(shì)菌種，該類細(xì)菌的基因 組在SpeI消化下均被分為9個(gè)片段；編號(hào)為3、20、26、28的共4個(gè)單菌歸為第II類細(xì)菌， 該類細(xì)菌的基因組在SpeI消化下均被分為11個(gè)片段；其余各類細(xì)菌分別包括1-3個(gè)單菌， 也根據(jù)其基因組被消化片段的不同而得以區(qū)分。3、1#活性菌株(Strain Si)的獲得以亞麻子粕為底物，對(duì)已挑選的32個(gè)單菌落的轉(zhuǎn)化活性分別進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn) 單個(gè)菌落的培養(yǎng)液中均未檢測(cè)到END，但1#菌株(Strain Si)的培養(yǎng)液在第3天時(shí)檢測(cè)到 了 SEC0，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中SECO含量逐漸增加，培養(yǎng)至9天后含量保持穩(wěn)定 (圖 7)。4、Strain Sl菌的菌種鑒定(1)形態(tài)鑒定在37°C、氧分壓3. 03975-10. 1325kPa的缺氧條件下，Strain Sl在LB培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)良好，呈灰白色菌落，鏡檢為格蘭陰性菌，無(wú)芽胞，無(wú)鞭毛，有較厚的莢膜，部分菌成雙排 列。
(2)生化鑒定Strain Sl可以發(fā)酵乳糖和麥芽糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。(3) rRNA測(cè)序分析將Strain Sl進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析，與Strain Sl相似度較高的腸道菌的系 統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)如圖8所示。與所測(cè)菌株Strain Sl的16S rRNA基因匹配程度最好的兩株 菌分另 1J為Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 (與 Strain Sl 匹配度 99. 5% )和 Klebsiella pneumoniae 342 (與 Strain Sl 匹配度 99.2%)。因此，StrainSl 被推測(cè)為來(lái)自克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的菌株。(4)克雷伯氏菌屬已知菌種轉(zhuǎn)化亞麻子粕產(chǎn)生SECO的活性為證明Strain Sl是否為該屬的新菌種，比較Strain Sl與克雷伯氏菌屬11株已 知菌種(表1)轉(zhuǎn)化亞麻子粕產(chǎn)生SECO的活性。表1. 11株已知克雷伯氏菌屬細(xì)菌的編號(hào)及菌種名稱
菌種編號(hào)菌種名稱PlKlebsiella pneumoniae W70P2Klebsiella pneumoniae ozaenae ATCCl 1296P3Klebsiella pneumoniae ATCC13883P4Klebsiella pneumoniae rhinoscleromatis ATCC13 884P5Klebsiella pneumoniae MGH78578P6Klebsiella oxytoca ATCC13182P7Klebsiella terrigone MZ0201
P8Klebsiella planticola MZ0202P9Klebsiella planticola MZ0203PlOKlebsiella pneumoniae M25PllKlebsiella oxytoca M5al①增菌配制IOmL體系的庖肉培養(yǎng)基12份，分別加入0. ImL還原劑和石蠟油，121°C高壓 滅菌15分鐘。取Strain Sl和Pl-Pll共12株菌的凍存樣本分別接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭 氧條件下37°C增菌24小時(shí)。②培養(yǎng)配制IOmL無(wú)碳源培養(yǎng)基12份，同時(shí)加入亞麻子粕50mg作為底物，石蠟油覆蓋， 121°C高壓滅菌15分鐘。分別接種增菌后的菌液各ImL于無(wú)碳源培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)。③檢測(cè)每隔24h取樣一次，采用HPLC法監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量的動(dòng)態(tài)變化。
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④結(jié)論經(jīng)過(guò)20天的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，同樣的培養(yǎng)條件下，只有Strain Sl的培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化產(chǎn)生 了 SEC0，其余11株已知克雷伯菌屬細(xì)菌均沒(méi)有任何轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。而與Strain Sl基因匹配度 最好且親緣關(guān)系最近的Klebsiella pneumoniae MGH78578 (P5)，雖然在16S rRNA序列上與 Strain Sl有極大的相似度，但是轉(zhuǎn)化亞麻子粕的活性卻不同。Strain Sl與本屬其他菌種 相比，應(yīng)該存在某種(或幾種)特定的功能基因的不同，從而具有轉(zhuǎn)化亞麻子粕產(chǎn)生SECO 的能力。通過(guò)以上鑒定結(jié)果，確認(rèn)Strain Sl為來(lái)自于克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)的 新菌，將其命名為Strain Si，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏號(hào)為 CGMCC No. 3085。實(shí)施例2、不同氧氣條件Strain Sl對(duì)亞麻子粕的轉(zhuǎn)化作用一、實(shí)驗(yàn)方法(1)增菌配制500mL體系的庖肉培養(yǎng)基，加入5mL還原劑和石蠟油，121°C高壓滅菌15分 鐘。取凍存的Strain Sl樣本5mL，接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌36小時(shí)。(2)接種共分為有氧培養(yǎng)①和缺氧培養(yǎng)②兩組，分別加入含有亞麻子粕(60mg/mL)的無(wú)碳 源培養(yǎng)基(2L)中。其中有氧培養(yǎng)組①的培養(yǎng)基不加石蠟油，直接121°C高壓滅菌15分鐘； 缺氧培養(yǎng)組②的培養(yǎng)基用石蠟油覆蓋，121°C高壓滅菌15分鐘。以體積比1 10分別接種 增菌后的Strain Sl菌液，37°C培養(yǎng)。(3)檢測(cè) 每隔24h取200 μ L培養(yǎng)液，加入400 μ L水飽和正丁醇萃取，4800rpm/min離心10 分鐘，取上清液300 μ L于離心管中，氮?dú)獯蹈?，加?00 μ L色譜甲醇，12500rpm/min離心3 分鐘，取上清液20 μ L，HPLC檢測(cè)。二、檢測(cè)結(jié)果有氧或缺氧條件下的第Id培養(yǎng)液中均可檢測(cè)到SECO。第3天SECO的含量達(dá)到峰值。實(shí)施例3、不同培養(yǎng)基中Strain Sl對(duì)亞麻子粕的轉(zhuǎn)化作用一、實(shí)驗(yàn)方法(1)增菌配制500mL體系的庖肉培養(yǎng)基，加入5mL還原劑和石蠟油，121°C高壓滅菌15分 鐘。取凍存的Strain Sl樣本5mL，接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌36小時(shí)。(2)接種共分為無(wú)碳源培養(yǎng)基①和LB培養(yǎng)基②兩組，在培養(yǎng)基(2L)中分別加入亞麻子粕 (40mg/mL)，用石蠟油覆蓋，121°C高壓滅菌15分鐘；以體積比1 10分別接種增菌后的 Strain Sl 菌液，37 °C 培養(yǎng)。(3)檢測(cè) 每隔24h取200 μ L培養(yǎng)液，加入400 μ L水飽和正丁醇萃取，4800rpm/min離心10 分鐘，取上清液300 μ L于離心管中，氮?dú)獯蹈?，加?00 μ L色譜甲醇，12500rpm/min離心3分鐘，取上清液20 μ L，HPLC檢測(cè)。二、檢測(cè)結(jié)果無(wú)碳源培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基的l-7d培養(yǎng)液中均可檢測(cè)到SEC0。實(shí)施例4、Strain Sl對(duì)不同底物的轉(zhuǎn)化作用一、實(shí)驗(yàn)方法(1)增菌配制500mL體系的庖肉培養(yǎng)基，加入5mL還原劑和石蠟油，121°C高壓滅菌15分 鐘。取凍存的Strain Sl樣本5mL，接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌36小時(shí)。(2)接種在無(wú)碳源培養(yǎng)基(2L)中分別加入不同的底物(lOmg/mL)，用石蠟油覆蓋，121°C高 壓滅菌15分鐘；以體積比1 10分別接種增菌后的Strain Sl菌液，37°C培養(yǎng)。(3)檢測(cè)每隔24h取200 μ L培養(yǎng)液，加入400 μ L水飽和正丁醇萃取，4800rpm/min離心10 分鐘，取上清液300 μ L于離心管中，氮?dú)獯蹈桑尤?00 μ L色譜甲醇，12500rpm/min離心3 分鐘，取上清液20 μ L，HPLC檢測(cè)。二、檢測(cè)結(jié)果不同底物的l-7d培養(yǎng)液中均可檢測(cè)到SECO(見(jiàn)表2)。表2不同時(shí)間點(diǎn)不同底物培養(yǎng)液中SECO的HPLC峰面積
底物SECO峰面積 (第3天)SECO峰面積 (第7天)海藻20051975芝麻子粕19931863黑麥鼓18641790油菜籽粕19001832小麥麩16211549大麥麩15791406玉米麩14871308燕麥麩15031421牛蒡子19351829實(shí)施例5、Strain Sl培養(yǎng)液中SECO的含量測(cè)定一、制作SECO標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱定SECO對(duì)照品0. 35lmg，加入2mL容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，配成 175. 5 μ g/mL對(duì)照品母液。將對(duì)照品母液逐級(jí)稀釋1倍，得到濃度為175. 5-2. 74 μ g/mL的 對(duì)照品溶液。吸取上述溶液分別進(jìn)樣20 μ L，進(jìn)行HPLC分析。以SECO峰面積(Y)對(duì)SECO 濃度(X，μ g/mL)進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程
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Y= 12. 59X-1. 403 (R2 = 0. 9998)；線性范圍為 175. 5-2. 74 μ g/mL ；定量限(S/N = 10)為 1. 37 μ g/mL ；檢測(cè)限(S/N = 3)為 0. 69 μ g/mL。二、培養(yǎng)條件(1)增菌配制200mL庖肉培養(yǎng)基，加入2mL還原劑和石蠟油，121°C高壓滅菌15分鐘。另取 凍存Strain Sl樣本2mL，接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌36小時(shí)。(2)接種配制無(wú)碳源培養(yǎng)基2L，加入60g亞麻子粕作為底物，用石蠟油覆蓋，121°C高壓滅 菌15分鐘。以體積比1 10接種增菌后的Strain Sl菌液200mL于無(wú)碳源培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)。(3)檢測(cè)每隔24h取200 μ L培養(yǎng)液，加入400 μ L水飽和正丁醇萃取，4800rpm/min離心10 分鐘，取上清液300 μ L于離心管中，氮?dú)獯蹈?，加?00 μ L色譜甲醇，12500rpm/min離心3 分鐘，取上清液20 μ L，HPLC檢測(cè)。三、培養(yǎng)結(jié)果如圖9所示，經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，培養(yǎng)液中即轉(zhuǎn)化產(chǎn)生SEC0，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， SECO含量逐漸增加，6天后達(dá)到較高值(65mg/L)。
權(quán)利要求
克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)Strain S1 CGMCC No.3085。
2.克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)Strain Sl CGMCC No. 3085在制備開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂 酚中的應(yīng)用。
3.一種制備開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚的方法，是通過(guò)發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085，得到開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiellasp.) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培養(yǎng)基是在無(wú)碳源培養(yǎng)基中加入底物得到的；所述底物 為亞麻子、海藻、芝麻子粕、黑麥麩、油菜籽粕、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子中 的至少一種。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述無(wú)碳源培養(yǎng)基為如下培養(yǎng)基pH7-8； 每升含有NaCl 2-4g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0. 2-0. 4g，硫代硫酸鈉0. 2-0. 4g, NH4ClO. 5-1. 5g， KH2PO4 2-3g、K2HPO4 l_2.5g，其余為水。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiellasp.) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培養(yǎng)基是在庖肉培養(yǎng)基中加入底物得到的；所述底物為 亞麻子、海藻、芝麻子粕、黑麥麩、油菜籽粕、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子中的 至少一種。
7.如權(quán)利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培養(yǎng)基中，所述底物的濃度為5_60mg/mLo
8.如權(quán)利要求3至7中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085 是在有氧條件下進(jìn)行的。
9.如權(quán)利要求3至7中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085 是在缺氧條件下進(jìn)行的。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵克雷伯氏菌(Klebsiellasp.) Strain Sl CGMCC No. 3085 是在氧分壓 3. 03975-10. 1325kPa 的條件下進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株克雷伯氏菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的克雷伯氏菌為克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)Strain S1 CGMCC No.3085?？死撞暇?Klebsiella sp.)Strain S1CGMCC No.3085可應(yīng)用于制備開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚。現(xiàn)有技術(shù)中，并沒(méi)有任何克雷伯氏菌生產(chǎn)開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚的報(bào)道，本發(fā)明為生產(chǎn)開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚提供了一種新途徑，并且豐富了克雷伯氏菌的菌株資源，具有重大意義。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101955892SQ20091008971
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日
發(fā)明者劉樹(shù)林, 庫(kù)寶善, 楊東輝 申請(qǐng)人:北京大學(xué)