專利名稱：：一種制備l-乳酸的方法及其專用菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制備L-乳酸的方法及其專用菌劑。
背景技術(shù)：
：隨著石油資源的不斷減少以及不可再生資源價(jià)格的節(jié)節(jié)攀升，開(kāi)發(fā)利用對(duì)環(huán)境更友好的生物基產(chǎn)品已成為轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)方式、保障生態(tài)鏈良性循環(huán)和實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。乳酸是一種重要的、多用途的生物基平臺(tái)化合物，有兩種異構(gòu)體，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。作為一種重要的生物化工材料，L-乳酸被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、日用化工和有機(jī)化工等領(lǐng)域，涵蓋大量產(chǎn)品。其中最重要、最廣泛的工業(yè)應(yīng)用是用于生產(chǎn)可降解聚合物-聚乳酸(PLA)。聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性以及優(yōu)良的機(jī)械性能和物理性能，因而被產(chǎn)業(yè)界認(rèn)為是新世紀(jì)最有發(fā)展前途的新型可再生材料，是石油基產(chǎn)品的重要替代品之一。L-乳酸的生產(chǎn)成本和市場(chǎng)價(jià)格偏高是聚乳酸市場(chǎng)開(kāi)拓受阻的一個(gè)主要因素，根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和專利的報(bào)道，目前利用微生物生產(chǎn)乳酸的方法主要有兩種，即根霉發(fā)酵和乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。采用根霉發(fā)酵具有如下缺點(diǎn)(1)需要較高的空氣系統(tǒng)及攪拌動(dòng)力系統(tǒng)，對(duì)電、蒸汽等能源消耗較大，生產(chǎn)成本較高；(2)由于根霉發(fā)酵是乳酸的異型發(fā)酵，因此在發(fā)酵乳酸的過(guò)程中根霉同時(shí)進(jìn)行其它路徑的代謝，有大量的雜酸伴生，使發(fā)酸轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)品質(zhì)量低。因此，目前工廠更多地采用乳桿菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種制備L-乳酸的專用菌劑。本發(fā)明所提供的制備L-乳酸的專用菌劑，其活性成分為鼠李糖乳桿菌(Zacto6ac/〃iwAawwfwus)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(Aa"o6flc〃/wwz/hw7&)SMB-06CGMCCWs3123和副干酪乳桿菌(Xacto6a".〃usjraracasef)SMB-07CGMCC抬3124。上述菌劑在具體應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)需要在其中添加其他的輔料。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備L-乳酸的方法。本發(fā)明所提供的制備L-乳酸的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌0^c^^"7/MW^m"(w";y)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(丄acto6ac〃/M犯/Zvan'ws)SMB-06CGMCC3123和副干酪乳桿菌CLflcto6ac/〃tw/araca"/)SMB-07CGMCC3124，得到L-乳酸。上述方法中，所述鼠李糖乳桿菌(丄a"okzc77/wAamwoy船)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(ZactoZac/〃Mra/hw/w)SMB-06CGMCCWs3123和副干酪乳桿菌(丄acto6a"7/Mjp"racose/)SMB-07CGMCC3124的cfu比為(1-3):(1-2):1。上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌(丄a"o6ac/〃wWzam"(w^)SMB-05CGMCCJV23122、唾液乳桿菌(丄acto6ac〃/ws^//van'船)SMB-06CGMCCJVb3123禾口副干酪乳桿菌(丄acto6ac〃/usparacase/)SMB-07CGMCCWe3124的發(fā)酵培養(yǎng)基每升的組成為葡萄糖180~200g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04'7H200.58g/L、MnS04'4H200.25g/L、Tween-801ml/L、用于控制發(fā)酵液pH值的中和劑，其余為水。發(fā)酵過(guò)程中控制pH范圍在5.0-5.5。上述方法中，所述中和劑為CaC03或氨水。所述中和劑為CaC03，所述CaC03在發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為30g/L。上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃wAam"omy)SMB-05CGMCCWs3122、唾液乳桿菌(丄acto6ac/〃wsa"van&)SMB-06CGMCC3123禾口副干酪乳桿菌(丄acto^"7/uy;flracflje/)SMB-07CGMCCW3124的條件為35-42°C厭氧培養(yǎng)37-60小時(shí)，具體可為37°C厭氧培養(yǎng)37小時(shí)。所述發(fā)酵培養(yǎng)的方式為分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)后，每3小時(shí)補(bǔ)加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次。本發(fā)明所提供的鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃MAamwomy)SMB-05、唾液乳桿菌(Lacto6ac/〃us■sa/Zvan'MiOSMB—06禾口畐U干酷乳桿菌(Xacto6ac〖〃z^/aracase/)SMB—07均是從人的口腔唾液中篩選得到的，分別鑒定為鼠李糖乳桿菌(Z"ctoZ>""7/MAawwwws)、唾液乳桿菌(丄a"otec/〃ussa/hw/us)SMB-06和副干酪乳桿菌(丄a"o6a"7/"51paramse/)SMB-07。鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃wsW^m"(ww^)SMB-05、唾液乳桿菌(丄acto6a"7/w■sa/hw/M)SMB-06和副干酪乳桿菌CLacto6acf〃^paracaw/)SMB-07均已于2009年6月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，鼠李糖乳桿菌5(丄acto^c/〃wW^mwosM5)SMB-05的保藏登記號(hào)為CGMCCWs3122，唾液乳桿菌aacto6acz'〃Msa"wWus)SMB-06的保藏登記號(hào)為CGMCC3123，副干酪乳桿菌a""o6ac/〃^;araca^')SMB-07的保藏登記號(hào)為CGMCCNs3124。鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃wWzamwww)SMB-05CGMCC3122為革蘭氏陽(yáng)性菌、菌落乳白色、菌落的邊緣整齊、光滑；唾液乳桿菌aactok7"7/w犯/Zvfln'uy)SMB-06CGMCCW3123為革蘭氏陽(yáng)性菌、菌落淡乳白色、菌落邊緣整齊、光滑；副干酪乳桿菌aa"o6ac說(shuō)twparacaw/)SMB-07CGMCCW3124為革蘭氏陽(yáng)性菌、菌落淡乳白色、菌落較小、邊緣整齊光滑。本發(fā)明利用鼠李糖乳桿菌(Xactotoc/〃w^amwos^)SMB-05CGMCCW3122、唾液乳桿菌(ZactoZ)flc///^sfl/hw/w)SMB-06CGMCC3123和副干酪乳桿菌(丄flcto6ac說(shuō)usSMB-07CGMCCJY23124發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，結(jié)果表明，發(fā)酵37小時(shí)，發(fā)酵液中總?cè)樗岬牧繛?16-241g/L，L-乳酸的光學(xué)純度為98-99%，發(fā)酵產(chǎn)率為2.2-6.5g/L*h。本發(fā)明通過(guò)混合發(fā)酵技術(shù)提高了L-乳酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率，極大地降低了L-乳酸的成本，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得；所述百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例l、鼠李糖乳桿菌aacto6a"7/wsAammm^)SMB-05、唾液乳桿菌(Z^cto6a"7/wjsa/〖van'wj)SMB—06禾口畐U干酪孚L桿菌(Z^cto6ac〃/M/aracase/)SMB—07的分離、純化及鑒定1、菌種的分離和純化收集不同類型人的口腔唾液于無(wú)菌的生理鹽水中充分混勻，然后將上述稀釋后的口腔唾液加入到MRS液體培養(yǎng)基中，37t:厭氧富集培養(yǎng)48小時(shí)，獲得pH〈4.0的富集液；取上述富集液，10倍梯度稀釋后涂布于含4%(質(zhì)量百分含量)CaC03的MRS固體培養(yǎng)基上，37'C厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，挑取透明圈較大的單菌落分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，觀察是否產(chǎn)氣，篩選得到不產(chǎn)氣的菌株，即同型發(fā)酵乳酸菌；將上述篩選得到得同型發(fā)酵乳酸菌分別接種于復(fù)篩培養(yǎng)基上，37'C厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)總?cè)樗岬漠a(chǎn)量，獲得高產(chǎn)的乳酸菌;將上述獲得的乳酸菌通過(guò)乳酸檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自德國(guó)拜爾公司)檢測(cè)L-乳酸的光學(xué)構(gòu)型，最終得到三株L-乳酸光學(xué)純度為98。/。的菌株，即鼠李糖乳桿菌aa加k"7toAflmwosus)SMB-05、唾液乳桿菌(丄acto6ac/〃w^//va〃'ws)SMB-06和副干酪乳桿菌aacto^cz7/M/flracase/)SMB-07，經(jīng)多次傳代后發(fā)酵測(cè)試，總?cè)樗岙a(chǎn)量、L-乳酸的純度沒(méi)有明顯變化。MRS液體培養(yǎng)基的組成為葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，擰檬酸二銨2g/L，乙酸鈉2g/L，吐溫801mL/L，MgS04*7H200.58g/L，MnS04*4H200.25g/L。發(fā)酵過(guò)程中控制pH范圍在5.5~6.2。115'C條件下滅菌20分鐘。含4%質(zhì)量百分含量CaC03的MRS固體培養(yǎng)基的組成為葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，檸檬酸二銨2g/L，乙酸鈉2g/L，吐溫801mL/L，MgS04*7H200.58g/L，MnS04*4H200.25g/L，CaC0340g/L，瓊脂15g/L。發(fā)酵過(guò)程中控制pH范圍在5.56.2。115"C條件下滅菌20分鐘。復(fù)篩培養(yǎng)基的組成為葡萄糖120g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L,檸檬酸二銨2g/L，乙酸鈉2g/L，吐溫801mL/L，MgS04'7H200.58g/L，MnS04'4H200.25g/L，CaCO340g/L。發(fā)酵過(guò)程中控制pH范圍在5.5~6.2。115'C條件下滅菌20分鐘。2、菌株的鑒定將上述步驟1篩選得到的鼠李糖乳桿菌a"cto6ac〃/z^Wzam朋ms)SMB-05、唾液乳桿菌(Xfl"o6flc"/wra/hw/us)SMB-06和副干酪乳桿菌(Xfl"o6ac/〃us;aracase/)SMB-07分別進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)和16SrDNA序列鑒定，具體過(guò)程如下鼠李糖乳桿菌(Xacto6ac/〃wr/zam"ams)SMB-05CGMCCJVfs3122為革蘭氏陽(yáng)性菌、菌落乳白色、菌落的邊緣整齊、光滑；唾液乳桿菌aacto6ac///^加/hw/us)SMB-06CGMCCJSf23123為革蘭氏陽(yáng)性菌、菌落淡乳白色、菌落邊緣整齊、光滑；副干酪乳桿菌(￡a"oZ>fl"7/usparaawe/)SMB-07CGMCC3124為革蘭氏陽(yáng)性菌、菌落淡乳白色、菌落較小、邊緣整齊光滑。鼠李糖乳桿菌(丄actoZ)ac/〃船Wwwwoms)SMB-05、唾液乳桿菌(丄"cto6ac/〃w^//vaW船)SMB-06和副干酪乳桿菌(丄"cto6ac〃/附;araawe/)SMB-07的生理生化特征如表1-表3所示。表i鼠李糖乳桿菌(Z^cto6ac/〃wr/^m"ay^)SMB-05的生理生化特性檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果接觸酶-過(guò)氧化氫酶-明膠液化-耐6%NaCl+耐硝酸鹽+葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣L-半胱氨酸-L-精氨酸-15。C生長(zhǎng)45。C生長(zhǎng)G+C含量46.14%表2唾液乳桿菌aacto6ad//usa/Zvan'^)SMB-06的生理生化特性檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果接觸酶一過(guò)氧化氫酶-明膠液化一耐6%NaCl+耐硝酸鹽+葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣L-半胱氨酸—L-精氨酸-15°C生長(zhǎng)45°C不生長(zhǎng)G+C含量45.14%8表3副干酪乳桿菌aacto6acf//i犯"van'MS)SMB-07的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表l-表3中，"+"表示結(jié)果為陽(yáng)性，"-"表示結(jié)果為陰性。鼠李糖乳桿菌(丄a"o6ac"^Aam"ostw)SMB-05的16SrDNA的核苷酸序列如序列表中序列1示，唾液乳桿菌(￡flcto6ac/〃iSMB-06的16SrDNA的核苷酸序列如序列表中序列2示，副干酪乳桿菌(Xflcto6flc/〃^/7arac^e/)SMB-07的16SrDNA的核苷酸序列如序列表中序列3示。菌株SMB-05的16SrDNA與鼠李糖乳桿菌V3(GQ253959.1)的同源性最高，其同源性為95%;菌株SMB-06的16SrDNA與唾液乳桿菌RA2115(AY389803.1)的同源性最高，其同源性為93%;菌株SMB-07的16Sr咖A與副干酪乳桿菌L7(EU526815.1)的同源性最高，其同源性為96%。基于以上特征，將上述步驟1篩選得到的菌株SMB-05鑒定為鼠李糖乳桿菌CLflcto^c///^Aflwmw附)，將上述步驟1篩選得到的菌株SMB-06鑒定為唾液乳桿菌(丄a"o6fl"7/^^fl/h^n&)，將上述步驟1篩選得到的菌株SMB-07鑒定為副干酪乳桿菌(丄flcto^"7/w;^raawe/)。上述三株菌均于2009年6月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃ww/wmwoms)SMB-05的保藏登記號(hào)為CGMCC3122，唾液乳桿菌aactoZ^"7/w犯"vaWuy)SMB-06的保藏登記號(hào)為CGMCCW23123，副干酪乳桿菌aacto6ac/〃M;wacasd)SMB-07的保藏登記號(hào)為CGMCC3124。實(shí)施例2、利用鼠李糖乳桿菌(丄flcto6ac/〃wsAam"osw)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌aa"o6flc/〃w5犯/Zv『/z^)SMB-06CGMCC3123和副干酪乳桿菌(Za"oZ)ac///w5paracase/)SMB-07CGMCC3124發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸該實(shí)施例中所用培養(yǎng)基的組成如下MRS液體培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，擰檬酸二銨2g/L，乙酸鈉2g/L，吐溫801mL/L,MgS04'7H200.58g/L，MnSO4*4H2O0.25g/L。發(fā)酵過(guò)程中控制pH范圍在5.5~6.2。115。C條件下滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖190g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04.7H200.58g/L、MnS04.4H200.25g/L、Tween-801ml/L，CaC0330g/L。pH5.0~5.5。115。C條件下滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入CaC03的目的是作為中和劑以控制發(fā)酵液的pH值。將上述實(shí)施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌CLflcto6ac/〃MAamwoms)SMB-05CGMCCWe3122、唾液乳桿菌aacto6flc〃/wssa/Zvank)SMB—06CGMCC3123禾口副干酪乳桿菌(丄acto6ac/〃Mparacfl^/)SMB-07CGMCCWs3124分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37。C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到1091011cfu/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌aacto^"7/wrftammwMS)SMB一05CGMCCW3122、唾液乳桿菌(Xa"o^c/〃ws犯/zVan.w"SMB—06CGMCCJVb3123和副干酪乳桿菌aactoZ^c/〃wpflraca"/)SMB-07CGMCC3124的cfb比為1:1:1，得到種子液。將上述種子液以10%的接種量接種到裝有20LMRS液體培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐中，37'C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到1091011cfii/mLo在裝有120L上述發(fā)酵培養(yǎng)基的200L發(fā)酵罐中按照10%的體積比接入上述發(fā)酵種子液。發(fā)酵過(guò)程中，初始24小時(shí)通過(guò)氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH為6.0進(jìn)行發(fā)酵，然后通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳酸鈣調(diào)節(jié)pH為5.0-5.5。采用分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即在發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)后，每3小時(shí)補(bǔ)加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，35'C厭氧發(fā)酵60小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中總?cè)樗岬漠a(chǎn)量和葡萄糖的含量。具體的檢測(cè)條件如下采用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測(cè)定總?cè)樗岬暮?，有機(jī)酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300ram)，流動(dòng)相為0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，進(jìn)樣量20uL，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，操作溫度4(TC。L-乳酸的含量通過(guò)L-乳酸檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自德國(guó)拜爾公司)檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)乳酸樣品購(gòu)買自Sigma公司。按照下述公式計(jì)算出發(fā)酵液中總?cè)樗岬臐舛取-乳酸的光學(xué)純度和發(fā)酵產(chǎn)率?？?cè)樗岬臐舛?(總?cè)樗崴济娣e/標(biāo)準(zhǔn)樣品所占面積)X標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度;L-乳酸的光學(xué)純度=L-乳酸濃度/總?cè)樗釢舛?；發(fā)酵產(chǎn)率=總?cè)樗釢舛?發(fā)酵總時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，3次重復(fù)的平均值如表4所示。表4不同發(fā)酵時(shí)間下的總?cè)樗岙a(chǎn)量:和L-乳酸光學(xué)純度發(fā)酵時(shí)間(h)總?cè)樗岙a(chǎn)量(g/L)L-乳酸光學(xué)純度128499%2413899%3718998%6021698%結(jié)果表明，當(dāng)鼠李糖乳桿菌(丄acto^c/〃MAammwM)SMB-05CGMCCW3122、唾液乳桿菌(X""o6ac/〃wsa//vank)SMB-06CGMCCJV23123和副干酪乳桿菌(丄acto6flc"/^;aracase/)SMB-07CGMCC3124的cfu比為1:1:1時(shí)，在60小時(shí)內(nèi)總?cè)樗岬漠a(chǎn)量為216g/L，卜乳酸的光學(xué)純度為98%，發(fā)酵產(chǎn)率為2.2g/L，h。實(shí)施例3、利用鼠李糖乳桿菌(丄a"o&c/〃w5Wzflm"oyz^)SMB-05CGMCCWs3122、唾液乳桿菌(丄actotec/〃w犯/zVan'^)SMB-06CGMCC3123和副干酪乳桿菌(丄flcto6ad〃M;aracaw/)SMB-07CGMCC3124發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸該實(shí)施例中所用培養(yǎng)基的組成同實(shí)施例2。將上述實(shí)施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌(Xa"o6ad〃wH/2fl/W7oms)SMB-05CGMCCWe3122、唾液乳桿菌(丄acto6flc/〃Mra/hw/w)SMB-06CGMCCJN"23123禾口副干酪乳桿菌(Z^"o^"7/wspflracwe/)SMB-07CGMCCW3124分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37t:厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到10tl0"cfii/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌aaCtoZ^C///ir/wwmo犯s)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(丄acto6ac〃/wSMB-06CGMCCJY23123和副干酪乳桿菌(Zacto6ac/〃wspflracase/)SMB-07CGMCCXb312411的cfU比為2:1:1，得到種子液。將上述種子液以10%的接種量接種到裝有20LMRS液體培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐中，37'C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到1091011cfu/mLc在裝有120L上述發(fā)酵培養(yǎng)基的200L發(fā)酵罐中按照10%的體積比接入上述發(fā)酵種子液。發(fā)酵過(guò)程中，初始24小時(shí)通過(guò)氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH為6.0進(jìn)行發(fā)酵，然后通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳酸鈣調(diào)節(jié)pH為5.0-5.5。采用分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即在發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)后，每3小時(shí)補(bǔ)加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，42"C厭氧發(fā)酵37小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中總?cè)樗岬漠a(chǎn)量和葡萄糖的含量。具體的檢測(cè)條件如下采用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測(cè)定總?cè)樗岬暮?，有機(jī)酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流動(dòng)相為0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，進(jìn)樣量20pL，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，操作溫度4(TC。L-乳酸的含量通過(guò)L-乳酸檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自德國(guó)拜爾公司)檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)乳酸樣品購(gòu)買自Sigma公司。按照下述公式計(jì)算出發(fā)酵液中總?cè)樗岬臐舛?、L-乳酸的光學(xué)純度和發(fā)酵產(chǎn)率?？?cè)樗岬臐舛?(總?cè)樗崴济娣e/標(biāo)準(zhǔn)樣品所占面積)X標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度；L-乳酸的光學(xué)純度二L-乳酸濃度/總?cè)樗釢舛?；發(fā)酵產(chǎn)率=總?cè)樗釢舛?發(fā)酵總時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，3次重復(fù)的平均值如表5所示。表5不同發(fā)酵時(shí)間下的總?cè)樗岙a(chǎn)量和L-乳酸光學(xué)純度發(fā)酵時(shí)間(h)總?cè)樗岙a(chǎn)量(g/L)L-乳酸光學(xué)純度1210199%2417898%3723799%結(jié)果表明，當(dāng)鼠李糖乳桿菌(丄a"o6ac/〃wAamwww)SMB-05CGMCCW3122、唾液乳桿菌CLfl"oZ^c/〃w^f"wzn'w5)SMB-06CGMCCWe3123和副干酪乳桿菌(Zacto6ad〃M;(3racwe/)SMB—07CGMCCWs3124的cfu比為2:1:1日寸，在37小時(shí)內(nèi)總?cè)樗岬漠a(chǎn)量為237g/L，卜乳酸的光學(xué)純度為99%，發(fā)酵產(chǎn)率為6.4g/L'h。實(shí)施例4、利用鼠李糖乳桿菌aactoZ^c〃/wr/zaw"oms)SMB-05CGMCCJV2123122、唾液乳桿菌(丄actoZ)ac/〃w^"va〃'z^)SMB-06CGMCC3123和副干酪乳桿菌afl"oZwc/〃M/aracwe/)SMB-07CGMCC3124發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸該實(shí)施例中所用培養(yǎng)基的組成同實(shí)施例2。將上述實(shí)施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌(丄actokc/〃MAawzomy)SMB-05CGMCCWe3122、唾液乳桿菌(Xacto6ac/〃wra//van*)SMB-06CGMCC3123禾口副干酪乳桿菌CLacto6ac!7/wSMB-07CGMCCW3124分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37。C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到1091011cfU/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌(丄actote"7/wr/wmwcw^)SMB-05CGMCCJV23122、唾液乳桿菌(丄a"o6a"'〃z^sa/ZwW^)SMB-06CGMCCWs3123和副干酪乳桿菌CLflcto6ac/〃M;7aram^/)SMB-07CGMCCW3124的cfli比為3:2:1，得到種子液。將上述種子液以10n/。的接種量接種到裝有20LMRS液體培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐中，37"C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到1091011cfU/mLo在裝有120L上述發(fā)酵培養(yǎng)基的200L發(fā)酵罐中按照10%的體積比接入上述發(fā)酵種子液。發(fā)酵過(guò)程中，初始24小時(shí)通過(guò)氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH為6.0進(jìn)行發(fā)酵，然后通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳酸鈣調(diào)節(jié)pH為5.0-5.5。采用分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即在發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)后，每3小時(shí)補(bǔ)加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，37"C厭氧發(fā)酵37小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中總?cè)樗岬漠a(chǎn)量和葡萄糖的含量。具體的檢測(cè)條件如下采用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測(cè)定總?cè)樗岬暮浚袡C(jī)酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流動(dòng)相為0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，進(jìn)樣量20ixL，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，操作溫度40'C。L-乳酸的含量通過(guò)L-乳酸檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自德國(guó)拜爾公司)檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)乳酸樣品購(gòu)買自Sigma公司。按照下述公式計(jì)算出發(fā)酵液中總?cè)樗岬臐舛取-乳酸的光學(xué)純度和發(fā)酵產(chǎn)率?？?cè)樗岬臐舛?(總?cè)樗崴济娣e/標(biāo)準(zhǔn)樣品所占面積)X標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度;L-乳酸的光學(xué)純度=卜乳酸濃度/總?cè)樗釢舛?；發(fā)酵產(chǎn)率=總?cè)樗釢舛?發(fā)酵總時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，3次重復(fù)的平均值如表6所示。表6不同發(fā)酵時(shí)間下的總?cè)樗岙a(chǎn)量和L-乳酸光學(xué)純度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)果表明，當(dāng)鼠李糖乳桿菌(丄flcto^a7/^Aflmwomy)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(Za"o^c/〃w^//vank)SMB-06CGMCCW3123和副干酪乳桿菌(丄""o6ac/〃w/flracaw/)SMB-07CGMCCW3124的cfu比為3:2:1時(shí)，在37小時(shí)內(nèi)總?cè)樗岬漠a(chǎn)量為240g/L，卜乳酸的光學(xué)純度為98%，發(fā)酵產(chǎn)率為6.5g/L'h。實(shí)施例5、利用鼠李糖乳桿菌aa"o6ac"/^W^w"omy)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(Z^ctoZac/〃^■ya/Zvank)SMB-06CGMCC3123和副干酪乳桿菌aa"o6ad〃wparaca"/)SMB-07CGMCCJV23124發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸該實(shí)施例中所用培養(yǎng)基的組成如下MRS液體培養(yǎng)基同實(shí)施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖200g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04.7H200.58g/L、MnS044H200.25g/L、Tween-801ml/L，CaC0330g/L。pH5.0~5.5，115"C條件下滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入CaC03的目的是作為中和劑以控制發(fā)酵液的pH值。將上述實(shí)施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌aflctok/c/〃t^Mflmwww)SMB-05CGMCCJV23122、唾液乳桿菌(丄acto6a"'〃wssa"va"'MS)SMB—06CGMCC3123禾口副干酪乳桿菌C^"o6ac/〃w/aracae/)SMB-07CGMCCJV23124分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37。C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到1091011cfu/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌CL""o6ac///^r/wmwayus)SMB—05CGMCC3122、唾液乳桿菌(丄a"o6ac〃/wssa/hw/us)SMB—06CGMCCJVf23123和副干酪乳桿菌CL"cto6ac/〃w;aracaye/)SMB-07CGMCCJVs3124的cfu比為3:2:1，得到種子液。將上述種子液以10。/。的接種量接種到裝有20LMRS液體培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐中，39'C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到10910"cfu/mL。在裝有120L上述發(fā)酵培養(yǎng)基的200L發(fā)酵罐中按照10%的體積比接入上述發(fā)酵種子液。發(fā)酵過(guò)程中，初始24小時(shí)通過(guò)氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH為6.0進(jìn)行發(fā)酵，然后通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳酸鈣調(diào)節(jié)pH為5.0-5.5。采用分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即在發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)后，每3小時(shí)補(bǔ)加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，37"C厭氧發(fā)酵37小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中總?cè)樗岬漠a(chǎn)量和葡萄糖的含量。具體的檢測(cè)條件如下:采用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測(cè)定總?cè)樗岬暮浚袡C(jī)酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流動(dòng)相為O.0005raol/L硫酸，流量0.5ml/rain，進(jìn)樣量20yL，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，操作溫度4(TC。L-乳酸的含量通過(guò)L-乳酸檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自德國(guó)拜爾公司)檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)乳酸樣品購(gòu)買自Sigma公司。按照下述公式計(jì)算出發(fā)酵液中總?cè)樗岬臐舛?、L-乳酸的光學(xué)純度和發(fā)酵產(chǎn)率。總?cè)樗岬臐舛?(總?cè)樗崴济娣e/標(biāo)準(zhǔn)樣品所占面積)X標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度；卜乳酸的光學(xué)純度=卜乳酸濃度/總?cè)樗釢舛?；發(fā)酵產(chǎn)率=總?cè)樗釢舛?發(fā)酵總時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，3次重復(fù)的平均值如表7所示。表7不同發(fā)酵時(shí)間下的總?cè)樗岙a(chǎn)量和L-乳酸光學(xué)純度發(fā)酵時(shí)間(h)總?cè)樗岙a(chǎn)量(g/L)L-乳酸光學(xué)純度129498%2417998%3723398%結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為210g/L時(shí)，37t:厭氧發(fā)酵37小時(shí)內(nèi)總?cè)樗岬漠a(chǎn)量為233g/L，L-乳酸的光學(xué)純度為98X，發(fā)酵產(chǎn)率為6.3g/L，h。實(shí)施例6、利用鼠李糖乳桿菌aa"o6ac/〃wSMB-05CGMCC她3122、唾液乳桿菌(Xactotoc/〃w■yaZ/vfln'M)SMB-06CGMCC処3123和副千酪乳桿菌(丄acto^d〃wsparacase/)SMB-07CGMCCJN"23124發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸該實(shí)施例中所用培養(yǎng)基的組成如下MRS液體培養(yǎng)基同實(shí)施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖180g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04'7H200.58g/L、MnS04'4H200.2515g/L、Tween-801ml/L，CaC0330g/L。pH5.0~5.5，115。C條件下滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入CaC03的目的是作為中和劑以控制發(fā)酵液的pH值。將上述實(shí)施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌CLa"o6a"7/wr/wm"o^^)SMB-05CGMCCJN"23122、唾液乳桿菌(丄a"o^"7/us犯"wn^)SMB-06CGMCC3123禾口副干酪乳桿菌(丄""okc/〃w;aracme/)SMB-07CGMCCW3124分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37。C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到1091011cfo/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌CLadoZ^a7/^Wzamwoyt^)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(丄fl"o6ac/〃Mra/zVa"'附)SMB-06CGMCCJV"23123和副干酪乳桿菌(丄fl"o6ac/〃w/aracaw/)SMB-07CGMCC3124的cfo比為3:2:1，得到種子液。將上述種子液以10%的接種量接種到裝有20LMRS液體培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐中，39C厭氧培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使菌液濃度達(dá)到109~10n在裝有120L上述發(fā)酵培養(yǎng)基的200L發(fā)酵罐中按照10%的體積比接入上述發(fā)酵種子液。發(fā)酵過(guò)程中，初始24小時(shí)通過(guò)氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH為6.0進(jìn)行發(fā)酵，然后通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳酸鈣調(diào)節(jié)pH為5.0-5.5。采用分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即在發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)后，每3小時(shí)補(bǔ)加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，37'C厭氧發(fā)酵37小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中總?cè)樗岬漠a(chǎn)量和葡萄糖的含量。具體的檢測(cè)條件如下釆用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測(cè)定總?cè)樗岬暮?，有機(jī)酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流動(dòng)相為0.0005mol/L硫酸，流量0.5ral/min，進(jìn)樣量20yL，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，操作溫度4(TC。L-乳酸的含量通過(guò)L-乳酸檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自德國(guó)拜爾公司)檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)乳酸樣品購(gòu)買自Sigma公司。按照下述公式計(jì)算出發(fā)酵液中總?cè)樗岬臐舛?、L-乳酸的光學(xué)純度和發(fā)酵產(chǎn)率。總?cè)樗岬臐舛?(總?cè)樗崴济娣e/標(biāo)準(zhǔn)樣品所占面積)X標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度;L-乳酸的光學(xué)純度=L-乳酸濃度/總?cè)樗釢舛?；發(fā)酵產(chǎn)率=總?cè)樗釢舛?發(fā)酵總時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，3次重復(fù)的平均值如表8所示。表8不同發(fā)酵時(shí)間下的總?cè)樗岙a(chǎn)量和L-乳酸光學(xué)純度發(fā)酵時(shí)間(h)總?cè)樗岙a(chǎn)量(g/L)L-乳酸光學(xué)純度129898%2418598%3724198%結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為180g/L時(shí)，37"C厭氧發(fā)酵37小時(shí)內(nèi)總?cè)樗岬漠a(chǎn)量為241g/L，卜乳酸的光學(xué)純度為98%，發(fā)酵產(chǎn)率為6.5g/L'h。17序列表〈110〉中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>—種制備L-乳酸的方法及其專用菌劑〈130>CGGNARZ92418<160〉3〈210〉1〈211>1440<212〉DNA<213〉鼠李糖學(xué)L桿菌(Z^ctoZ(3c〃/w51WzawmwMjO〈400>1cagca_gtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtga60agaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgt120tgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggt180aatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttt240tttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagtgcatcggaaactgggaaac300ttgagtgcagaagaggacagtggaactaaatgtgtagcggtg犯atgcgtagatatatgg360aagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcga犯gca420tgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggt480gttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggag540tacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcat600gtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacct660gagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagct720cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgcca780gcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga840cgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaa900cgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgta960ggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcgg1020cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgcca1080gcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga1140gcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga1200cgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtac犯1260cgagttgcgagaccgcgaggtxaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgta1320cgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgta1380ggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatc已gcacgccgcgg1440〈210〉2<211〉1440〈212>DNA〈213>唾液乳桿菌(i:a"oZ>^/〃wra//ran'z^)〈400〉2agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaat8catgc犯gtcg肌c60gaaactttcttacaccgaatgcttgcattcatcgtaagaagttgagtggcggacgggtga120gtaacacgtgggtaacctgcctaaaagaaggggataacacttggaaacaggtgctaatac180cgtatatctctaaggatcgcatgatccttagatgaaagatggttctgctatcgcttttag240atggacccgcggcgtattaactagttggtggggtaacggcctaccaaggtgatgatacgt300agccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgg360gaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtga420gtgaagaaggtcttcggatcgtaaaactctgttgttagagaagaacacgagtgagagtaa480ctgttcattcgatgacggtatctaaccagcaagtceicggctaactacgtgccagcagccg540cggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagggaacgcaggcg600gtcttttaagtctgatgtgaaagccttcggcttaaccggagtagtgcattggaaactgga660agacttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatat720atggaagaacaccagtggcgaaagcggctctctggtctgtaactgacgctgaggttcgaa780agcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgct840aggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcaataagcattccgcctgg900ggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtgga960gcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgacc1020gcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgacc1080atggaagaacaccagtggcgaaagcggctctctggtctgtaactgacgctgaggttcgaa1140agcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgct1200aggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcaataagcattccgcctgg1260ggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaagga已ttgacgggggcccgcacaagcggtgga1320gcatgtggtttaattcgaagcaacgcg已a(bǔ)gaaccttaccaggtcttgaca"tcctttgacc1380gcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgacc1440〈210〉3〈211〉1440〈212〉DNA〈213〉畐U干酷乳桿菌(丄acto6ac〃/ws;aracayeO<400〉3agagtttgatgcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaa60cgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgaacttcaacatggaacgagtggcggacg120ggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgct180aataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgc240ttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatg300atacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactc360ctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgcc420gcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggca480gagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccag540cagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcg600caggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaa660actgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgt720agatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgagg780ctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgta肌cgatg840aatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattcc900gcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactxaaaggaattgacgggggcccgcacaagc960ggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatctt1020ttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggtt1080ctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatg1140aatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattcc1200gcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggasLttgacgggggccgcacaagcg1260gtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttt1320tgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttt1380tgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggtta1440權(quán)利要求1、一種制備L-乳酸的專用菌劑，其活性成分為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05CGMCC№3122、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)SMB-06CGMCC№3123和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)SMB-07CGMCC№3124。2、一種制備L-乳酸的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌aacto^"7/wrtowwaswj)SMB—05CGMCCJVs3122、唾液乳桿菌(丄ac/otoc/〃w犯/hw/w)SMB-06CGMCC3123和副干酪乳桿菌a^cto6a"7/M;aracwe/)SMB-07CGMCC3124，得到L-乳酸。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述鼠李糖乳桿菌a""o^"7/^r/zamwas^)SMB-05CGMCC3122、所述唾液乳桿菌(丄fifcto6ac/〃Msa/zVa〃'wj)SMB-06CGMCCJV23123和所述副干酪乳桿菌C^ctoZ^c/〃wparaawe/)SMB-07CGMCC3124的cfu比為(l-3):(1-2):1。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基每升的組成為葡萄糖180~210g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04.7H200.58g/L、MnS04.4H200.25g/L、Tween-801ml/L、用于控制發(fā)酵液pH值的中和劑，其余為水。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述用于控制發(fā)酵液pH值的中和劑為CaCCb或氨水。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述用于控制發(fā)酵液pH值的中和劑為CaC03，所述CaC03在發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的終濃度為30g/L。7、根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基的pH為5.05.5。8、根據(jù)權(quán)利要求2-7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為35°C-42'C厭氧培養(yǎng)37-60小時(shí)，優(yōu)選為37'C厭氧培養(yǎng)37小時(shí)。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的方式為分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)；所述分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)為在發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)后，每3小時(shí)補(bǔ)加5.8L濃度為lkg/L的葡萄糖。10、鼠李糖乳桿菌(Iacto6ac/〃wAtwmoswdSMB-05,其保藏號(hào)為CGMCC3122;唾液乳桿菌(丄a"o^c/〃w■y>ya//vanw1s)SMB-06，其保藏號(hào)為CGMCCJM"23123;副干酪乳桿菌0^cto^"7/Mparac似e/)SMB-07，其保藏號(hào)為CGMCCW3124。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種制備L-乳酸的方法及其專用菌劑。該方法是發(fā)酵培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05CGMCC№3122、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)SMB-06CGMCC№3123和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)SMB-07CGMCC№3124，得到L-乳酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵37小時(shí)，發(fā)酵液中總?cè)樗岬牧繛?16-241g/L，L-乳酸的光學(xué)純度為98-99％，發(fā)酵產(chǎn)率為2.2-6.5g/L·h。本發(fā)明通過(guò)混合發(fā)酵技術(shù)提高了L-乳酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率，極大地降低了L-乳酸的成本，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N1/20GK101613667SQ20091008976公開(kāi)日2009年12月30日申請(qǐng)日期2009年7月23日優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日發(fā)明者張延平,徐洪濤,朱林江,寅李申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所