專(zhuān)利名稱(chēng)：流產(chǎn)布魯氏菌免疫標(biāo)記重組菌株與其在制備疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種流產(chǎn)布魯氏菌免疫標(biāo)記重組菌株與其在制備疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病是一種人畜共患的傳染病，也是大動(dòng)物傳染病中僅次于口蹄疫，具有重要的政治、經(jīng)濟(jì)影響力的疾病，在世界各國(guó)的流行形勢(shì)十分嚴(yán)峻。長(zhǎng)期以來(lái)全球防控布魯氏菌病的策略主要是檢疫-撲殺(發(fā)達(dá)國(guó)家)或免疫接種(發(fā)展中國(guó)家)，前者通過(guò)檢疫撲殺患病牛、羊、豬等動(dòng)物為措施，耗資巨大、操作困難；后者通過(guò)免疫接種并輔助撲殺措施，雖可阻止疾病在動(dòng)物群中的傳播，但免疫動(dòng)物和臨床患病動(dòng)物難以鑒別，使患病動(dòng)物在自然群體中長(zhǎng)期存在，嚴(yán)重威脅人類(lèi)和動(dòng)物群的健康，阻礙動(dòng)物布魯氏菌病的根除和凈化。
根據(jù)現(xiàn)在國(guó)際上及我國(guó)的使用來(lái)看，粗糙型疫苗株RB51和疫苗株S19都是弱毒活疫苗，但S19的毒力強(qiáng)，接種母畜易引起流產(chǎn)，利用血清學(xué)方法不能與野生菌株感染區(qū)分；而RB51的毒力相對(duì)較弱，雖然能夠進(jìn)行血清學(xué)的鑒別診斷，但RB51的免疫效力備受爭(zhēng)議，在我國(guó)也沒(méi)有使用。所以安全標(biāo)記疫苗菌株是現(xiàn)在世界各國(guó)對(duì)于布魯氏菌病防控的技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種流產(chǎn)布魯氏菌免疫標(biāo)記重組菌株與其在制備疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的流產(chǎn)布魯氏菌重組菌株，是將流產(chǎn)布魯氏菌("rY/cW^S力Or^^)中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因滅活得到的菌株。
所述流產(chǎn)布魯氏菌(5raceWa ^orz^s)可為現(xiàn)有的菌株，如野生株(包括標(biāo)準(zhǔn)株、強(qiáng)毒株和弱毒株)、疫苗株等，具體可為流產(chǎn)布魯氏菌("rwceWas/borfM)2308菌株。
所述糖基轉(zhuǎn)移酶可為任何來(lái)源于流產(chǎn)布魯氏菌(5raceWa ator ^s)的糖基轉(zhuǎn)移酶，具體可如序列表的序列1所示。
所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列可如序列表的序列2所示?？赏ㄟ^(guò)任何現(xiàn)有方法滅活所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因，如基因組中該序列缺失、外源或內(nèi)源序列插入、同源重組、RNA干擾等。
所述同源重組可通過(guò)將DNA片段KDA5導(dǎo)入所述流產(chǎn)布魯氏菌實(shí)現(xiàn)；所述DNA片段KDA5自上游至下游依次包括同源臂DA5-1和同源臂DA5-2;所述同源臂DA5-1和同源臂DA5-2能與所述流產(chǎn)布魯氏菌基因組中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列的上游和下游相同序列發(fā)生同源重組，滅活所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
所述DNA片段KDA5自上游至下游依次包括同源臂DA5-1、卡那霉素抗性基因片段(以下以kan抗性基因代替)和同源臂DA5-2;所述同源臂DA5-1和同源臂DA5-2的長(zhǎng)度均為400-600bp。
所述同源臂DA5-1具體可為以流產(chǎn)布魯氏菌("27/ce7h a力or"50的基因組DNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段
pWUM355 (上游弓I物)5' -GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA-3'(序列表的序列3 );
p醒356(下游引物)5， -AAGCTTCACGCCGAGCTTATTCATG-3，(序列表的序列4)。
所述同源臂DA5-2具體可為以流產(chǎn)布魯氏菌(5n/ce77a ^orz^s)的基因組DNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段
p麗357 (上游弓l物)5， -GGCGTGMGCTTCAGGTCGCCGCMATGA-3，(序列表的序列5);
pWUM358 (下游引物)5, -CGGGATCCGCGTGGCMGCGTMTG-3，(序列表的序列6)。
所述A朋片段具體可為以pKD4質(zhì)粒為模版，用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段
p醒77H (上游弓l物)5， HXCCMGCTTCACGTCTTGAGCGATTGTGTAG-3 (序列表的序列7);
pWU0178H (上游弓l物)5， "CCCCMGCTTGGAAMCGATTGCGMGCCC - 3，(序列表的序列8)。
所述DNA片段KDA5的核苷酸序列具體可如序列表的序列9所示。序列9中，自5，末端第1-587位核苷酸為DA5-1、第588-1895為核苷酸為kan抗性基因片段、第1896-24066bp位核苷酸為DA5-2。
實(shí)驗(yàn)證明，該重組菌株的毒力低于出發(fā)的母本菌株，免疫保護(hù)效力與現(xiàn)有疫苗株相當(dāng)，并且具有臨床檢疫、診斷用免疫標(biāo)記。因此，該重組菌株可用于制備布魯氏菌疫苗。
所述重組菌株可應(yīng)用于制備流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗。
本發(fā)明還保護(hù)一種流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗，它的活性成為所述的重組菌株。本發(fā)明通過(guò)對(duì)布魯氏菌基因組中的功能基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的滅活對(duì)布魯氏菌的毒力影響較大，同時(shí)可以改變菌株免疫動(dòng)物后動(dòng)物血清中的抗體組成。本發(fā)明通過(guò)將流產(chǎn)布魯氏菌的糖基轉(zhuǎn)移酶基因滅活，得到了新的菌z株，
與出發(fā)菌株相比，該新菌株的毒力較弱，無(wú)需滅活就可以作為疫苗免疫動(dòng)物，而且可使免疫接種動(dòng)物和臨床患病動(dòng)物通過(guò)血清學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒別。使用本發(fā)明的菌株免疫小鼠，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體與標(biāo)準(zhǔn)菌株、現(xiàn)有疫苗菌株不同，通過(guò)動(dòng)物血清的免疫學(xué)檢測(cè)能夠?qū)⒒疾?dòng)物從免疫動(dòng)物群體中鑒別出來(lái)。本發(fā)明可應(yīng)用于布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，應(yīng)用于開(kāi)發(fā)布魯氏菌病疫苗和配套的鑒別診斷試劑，對(duì)促進(jìn)全球動(dòng)物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。


圖1為重組菌株RBA5的構(gòu)建流程圖。
圖2為DA5-1和DA5-2的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖3為DA5的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖4為PCR擴(kuò)增得到的i^/7抗性基因片段的電泳圖。
圖5為pEASY-Tl-DA5轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后經(jīng)PCR擴(kuò)增的鑒定圖。
圖6為pEASY-T1-KM5轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后經(jīng)PCR擴(kuò)增的鑒定圖。
圖7為pBluescripts II KS-KDA5轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后經(jīng)PCR擴(kuò)增的鑒定圖。
圖8為pBluescripts II KS-KDA5轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后雙酶切鑒定圖。
圖9為重組菌RBA5的PCR鑒定圖。
圖10為重組菌RBA5接種后小鼠脾臟載菌量隨時(shí)間變化曲線。圖11為重組菌RBA5接種小鼠的初步免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。
以下實(shí)施例中所用的菌株和質(zhì)粒如下
流產(chǎn)布魯氏菌(5raceL a aiw7t〃s)菌株2308 (標(biāo)準(zhǔn)菌株)、流產(chǎn)布魯氏菌(5r"ce77s a力arz^s)菌株S19 (疫苗菌株)均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所菌種室；流產(chǎn)布魯氏菌(5raceL 3 ^ar"s)菌株RB51 (粗糙型疫苗菌株)來(lái)自美國(guó)產(chǎn)商業(yè)牛布魯氏菌粗糙型疫苗的分離菌株；pKD4質(zhì)粒(￡ coh'Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center) ; pEASY-Tl Simple載體購(gòu)自北京全式金公司；pBluescripts II KS購(gòu)自Stratagene公司。實(shí)施例1、滅活糖基轉(zhuǎn)移酶基因重組菌株的構(gòu)建
根據(jù)流產(chǎn)布魯氏菌基因組中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GenBank AccessionNumber:3787661)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，第一對(duì)引物用于擴(kuò)增同源臂DA5-1，第二對(duì)引物用于擴(kuò)增DA5-2。設(shè)計(jì)第三對(duì)引物，用于擴(kuò)增沐D4質(zhì)粒中的A朋抗性基因片段。同源臂DA5-1和同源臂M5-2連接后形成DNA片段DA5;將DA5插入pEASY-Tl Simple載體，得到重組載體pEASY-T1-DA5;將h"抗性基因片段插入pEASY-Tl-DA5中的DA5-1和DA5-2之間，得到重組載體pEASY-Tl-KDA5;將pEASY-Tl-KDA5酶切得到的KDA5片段插入pBluescripts II KS載體，最終得到重組載體pBluescripts IIKS-KDA5。重組載體pBluescripts II KS-KDA5與流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308發(fā)生同源重組即可得到滅活糖基轉(zhuǎn)移酶基因并含有Aa/7抗性基因的重組菌株。滅活糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組菌株(RBA5)的構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖l。
一、重組載體pBluescripts II KS-KDA5的構(gòu)建
1、 布魯氏菌基因組的提取
取15ul滅活的流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308，加入lml TNE (每升含有l(wèi). 21gTris，5.84g NaCl， 0. 37g EDTA)混勻，10000r/min離心，留沉淀?xiàng)壣锨?。之后加?35ul TNE重懸洗滌后的沉淀。再向其中加入135u 1含2% Triton X-IOO的TNE，混勻。加30ul新鮮配制的溶菌酶(5mg/ml)，輕彈試管混勻。37°。水浴孵育30!11化，之后加入15nl蛋白酶K (20mg/ml)，渦旋混勻。65。C水浴至少孵育2h。
加入RNAse (使RNAse濃度達(dá)到10ug/ml)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后將提取的基因組DNA于4'C保存?zhèn)溆谩?br> 2、 PCR擴(kuò)增糖基轉(zhuǎn)移酶基因的上游片段M5-1 (587bp)和下游片段DA5-2(511bp)
擴(kuò)增上游片段的引物如下
p麗355 (上游引物)5， - GGGGTACCMCCCMATGCTCACA -3，；pWUM356 (下游引物)5, -AAGCTTCACGCCGAGCTTATTCATG -3，。上游引物中加入Kpnl酶切位點(diǎn)，下游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增下游片段的引物如下
pWUM357 (上游引物)5， -GGCGTGAAGCTTCAGGTCGCCGCAAATGA -3，；pWUM358 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG -3，。上游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物中加入BamHI酶切位點(diǎn)。 以步驟1得到的基因組DNA為模板，分別使用上述兩個(gè)引物對(duì)進(jìn)行降落PCR，
參數(shù)是94。C預(yù)變性3 min; 94。C變性45 s ，退火溫度從65"C至5(TC每降rC運(yùn)
行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72'C延伸lmin;最后72'C終延伸10 min。
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2，圖2中，1:DA5-1的PCR
擴(kuò)增產(chǎn)物；2: DA5-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增
出了目的片段。
3、 DA5 DNA片段的獲得
通過(guò)重疊PCR的方法，將上游片段M5-l和下游片段DA5-2連接，得到片段即 為DA5片段(1098bp)。 PCR擴(kuò)增引物如下
p麵355 (上游引物)5, - GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA -3，； pWUM358 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTGGCMGCGTAATG -3，。 使用上述兩個(gè)引物進(jìn)行降落PCR，參數(shù)是94。C預(yù)變性3min; 94。C變性45 s ，
退火溫度從65。C至50。C每降rC運(yùn)行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72。C延伸lmin;最后72
。C終延伸10 min。
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3，圖3中，1: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，成功獲得了將DA5-1和DA5-2連接的DA5片段。
4、 h/2抗性基因片段(1308bp)的獲得
以pKD4質(zhì)粒為模板擴(kuò)增A朋抗性基因片段，PCR擴(kuò)增引物如下 p薩77H (上游引物)5, "CCCCMGCTTCACGTCTTGAGCGATTGTGTAG-3; p廳78H (上游引物)5， - CCCCAAGCTTGGAAMCGATTCCGMGCCC - 3，。 使用上述兩個(gè)引物進(jìn)行降落PCR，參數(shù)是94。C預(yù)變性3min; 94'C變性45 s ，
退火溫度從65'C至5(TC每降rC運(yùn)行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72'C延伸lmin;最后72
。C終延伸10 min。
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4，圖4中1: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，成功從質(zhì)粒中擴(kuò)增出卡那霉素(kan)抗性基因片 段。
5、 pEASY-Tl-DA5重組載體的構(gòu)建根據(jù)pEASY-Tl simple載體說(shuō)明書(shū)，建立pEASY-Tl simple載體與步驟3中 得到的DA5片段的克隆反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑 篩選；挑選陽(yáng)性白斑菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物如下
pWUM355 (上游引物):5， - GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA -3，;
pWUM358 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG -3，。
使用上述兩個(gè)引物進(jìn)行降落PCR,參數(shù)是94。C預(yù)變性3min; 94。C變性45 s ， 退火溫度從65r至50'C每降rC運(yùn)行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72"C延伸lmin;最后72 'C終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖5，圖5中1: 重組載體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，成功構(gòu)建出了目的載體， 將其命名為pEASY-Tl-DA5重組載體。
6、 pEASY-Tl-KDA5重組載體的構(gòu)建
將步驟5中得到的pEASY-Tl-DA5載體及步驟4中得到的A朋抗性基因片段分 別進(jìn)行HindIII酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞， 進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑選陽(yáng)性白斑菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物如下
p醒355 (上游引物)5， - GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA -3';
pWUM358 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG -3，。
使用上述兩個(gè)引物進(jìn)行降落PCR，參數(shù)是94。C預(yù)變性3min; 94。C變性45 s ， 退火溫度從65'C至5(TC每降rC運(yùn)行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72'C延伸lmin;最后72 。C終延伸10 min。
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖6，圖6中1: DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)；2:重組載體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(DNA片段KDA5)。
將重組載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，重組載體中含有DNA片段KDA5(如序列表的 序列9所示)，將其命名為pEASY-Tl-KDA5重組載體。
7、 pBluescripts II KS-KDA5重組載體的構(gòu)建
將步驟6中得到的重組載體pEASY-T1-KDA5與pBluescripts II KS (含有朋7/ 抗性基因)分別進(jìn)行BamHI和KpnI雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5d感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑和AMP抗性篩選；挑選陽(yáng)性白斑和AMP篩選陽(yáng)性 的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物如下
p麗355 (上游引物):5， - GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA -3，;
p麗358 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG -3，。使用上述兩個(gè)引物進(jìn)行降落PCR，參數(shù)是94。C預(yù)變性3min; 94。C變性45 s , 退火溫度從65'C至5(TC每降rC運(yùn)行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72r延伸lmin;最后72 。C終延伸10 min。
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖7，圖7中，1:重組載體PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(DNA片段KDA5) ; 2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
提取PCR陽(yáng)性重組載體進(jìn)行BamHI和Kpnl雙酶切鑒定。酶切鑒定的結(jié)果見(jiàn)圖 8，圖8中1:重組載體的酶切產(chǎn)物；大片段為載體骨架、小片段為KDA5片段；2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
將重組載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，重組載體中含有DNA片段KDA5(如序列表的 序列9所示)，將其命名為pBluescripts II KS-KDA5重組載體。將含有重組載體 的菌株增殖培養(yǎng)，保存在-8(TC備用。
二、流產(chǎn)布魯氏菌免疫標(biāo)記重組菌株的獲得
在含有20ml TSB培養(yǎng)基的離心管中接種50 ul流產(chǎn)布魯氏菌2308菌株，37°C 培養(yǎng)24小時(shí)后，離心菌體并用預(yù)冷的三蒸水懸浮并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1. 5ml離心管中， 繼續(xù)離心洗滌3-4次。然后，加入適量的冷三蒸水懸浮菌液，取87ul菌液和3ul 質(zhì)粒(pBluescripts II KS-KDA5)加入lmm的電極杯，將電極杯放入BIORAD電穿孔 儀中，調(diào)整儀器至Agr程序后，按Pulse鈕進(jìn)行電擊。查詢(xún)電擊參數(shù)為2. 22KV。 電擊后，向電極杯中加入lmlSOC培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，室溫下靜置10min， 置于37'C搖床復(fù)蘇12-18h。將轉(zhuǎn)化復(fù)蘇后的菌液涂布于TSB (含100ug / ul的氨芐 青霉素)。5-8天后長(zhǎng)出單個(gè)菌落。挑取單菌落至TSB液體培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)37 。C增殖48h，再將該菌液稀釋10-100倍后，取100ul涂布于含有5y。蔗糖的TSA平 板培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)3-5天后長(zhǎng)出單菌落，將陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定。
PCR鑒定用的引物如下
p訓(xùn)355 (上游引物)5， - GGGGTACCMCCCAAATGCTCACA -3，； p觀358 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG -3，。 PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖9，圖9中，1:重組菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物；2:流產(chǎn)布魯氏菌 2308的擴(kuò)增產(chǎn)物；3: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。其中，重組菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物(即KDA5) 為2406bp;流產(chǎn)布魯氏菌2308 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(即糖基轉(zhuǎn)移酶基因)為2590bp。
結(jié)果表明，通過(guò)雙交換獲得了滅活糖基轉(zhuǎn)移酶基因(并由A朋替代糖基轉(zhuǎn)移酶 編碼基因)的流產(chǎn)布魯氏菌菌株，將其命名為重組菌株RBA5。實(shí)施例2、滅活糖基轉(zhuǎn)移酶基因的流產(chǎn)布魯氏菌免疫標(biāo)記重組菌株RBA5鑒定 試驗(yàn)動(dòng)物4-6周齡SPF級(jí)Balb/C雌鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有 限公司，許可證編號(hào)為SCXK(京)2007-0001。
一、 毒力鑒定
將健康小鼠隨機(jī)分四組，每組20只。具體接種方案如下 第一組接種實(shí)施例1制備的重組菌株RBA5，每只小鼠腹腔接種劑量0. lml， 內(nèi)含107細(xì)菌。
第二組(對(duì)照組l):接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308，每只小鼠腹腔接種劑量 0. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第三組(對(duì)照組2):接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接種劑量0. lml， 內(nèi)含107細(xì)菌。
第四組(對(duì)照組3):接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51，每只小鼠腹腔接種劑量 0. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
分別于接種后第2、 5、 8和11周從每組小鼠中選5只，進(jìn)行脾臟大小、脾臟 載菌量和血清學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)。
脾臟載菌量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖10。圖10中，WT表示接種菌株2308不同時(shí)間 點(diǎn)載菌量，S19表示接種菌株S19不同時(shí)間點(diǎn)載菌量，RBA5表示接種重組菌株RBA5 不同時(shí)間點(diǎn)載菌量，RB51表示接種菌株RB51不同時(shí)間點(diǎn)載菌量。結(jié)果表明重組 菌株RBA5接種后，2、 5、 8、 11周的脾臟載菌量變化與疫苗菌株S19、粗糙型疫苗 菌株RB51的脾臟載菌量的變化一致，至ll周在小鼠體內(nèi)全部清除；說(shuō)明RBA5的 毒力與S19、 RB51相當(dāng)，并且這三株菌株的毒力明顯比流產(chǎn)布魯氏菌2308弱。
血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明接種流產(chǎn)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株2308和流產(chǎn)布魯氏菌疫苗 菌株S19的小鼠血清通過(guò)布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制 造，批號(hào)200801)檢測(cè)時(shí)，均能夠在2分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的凝集反應(yīng)，通過(guò)試管凝集 試驗(yàn)抗原(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制造，批號(hào)200603)檢測(cè)到的抗體效價(jià)達(dá)到l: 100 以上；接種流產(chǎn)布魯氏菌免疫標(biāo)記重組菌株RBA5與RB51的小鼠血清的檢測(cè)結(jié)果均 為陰性。
二、 疫苗效力評(píng)價(jià)
將健康小鼠隨機(jī)分為四組，每組15只。具體接種方案如下四組小鼠分別注射流產(chǎn)布魯氏菌基因缺失標(biāo)記重組菌株RBA5、流產(chǎn)布魯,疫 苗菌株S19、粗糙型疫苗菌株RB51和PBS,具體如下
第一組接種實(shí)施例1制備的重組菌株RBA5，每只小鼠腹腔接種劑量O. lml， 內(nèi)含107細(xì)菌。
第二組(疫苗對(duì)照組)接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接種劑量 0. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第三組(粗糙型菌株對(duì)照組)接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51，每只小鼠腹腔接 種劑量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第四組(空白對(duì)照組)接種0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)，每只小鼠 腹腔接種劑量0. lml。
上述菌株接種后于接種后第12周、16周和20周分別用流產(chǎn)布魯氏菌強(qiáng)毒株 2308攻毒，劑量為106CFU/ml。攻毒兩周后對(duì)各組小鼠采血并剖殺，取脾臟稱(chēng)重量 并計(jì)算脾臟載菌量變化，評(píng)價(jià)免疫效力。
脾臟的平均載菌量變化結(jié)果如圖ll所示。圖11中，PBS表示空白對(duì)照組，S19 表示接種S19的各時(shí)間點(diǎn)免疫保護(hù)力，RBA5表示接種重組菌株RBA5各時(shí)間點(diǎn)免疫 保護(hù)力，RB51表示接種RB51各時(shí)間點(diǎn)免疫保護(hù)力；Week代表小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)的 各菌株免疫保護(hù)力檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果表明，重組菌株RBA5的免疫保護(hù)效力比疫苗 菌株S19稍差，在第9周與粗糙型疫苗菌株RB51的免疫保護(hù)力相當(dāng)，第9周的免， 而12、 16周的免疫保護(hù)力要優(yōu)于RB51。序列表
<110〉 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>流產(chǎn)布魯氏菌免疫標(biāo)記重組菌株與其在制備疫苗中的應(yīng)用
<130〉 CGGNARY92464
<160> 9
<210> 1
<211> 519
<212> PRT
〈213> 流產(chǎn)布魯氏菌(5潔eWa aZ or"s)
〈400> 1
Met Asn Lys Leu Gly Val Phe lie 1 5 Pro Tyr Gin Gly lie Ser Arg Leu 20
Leu Asn Gin Gly Ser Gly Val Thr
35 40 Asp Asp Val Arg Val Leu Leu Glu
50 55 Val Lys lie lie Ala Thr Asn Gly 65 70 Lys Leu Arg Asp Lys Phe Arg Lys 85
Leu Trp Leu Glu Arg Tyr Gly Lys 100
Gly Tyr Asn Pro Gly Gin Leu Asp
10 15 lie Ala Phe Val lie Lys Gly Ala 25 30 lie Ala Cys Pro Gly Trp Leu Lys 45
Asp Ala Asp lie Pro Leu Glu Ala 60
Gin Pro Pro Leu Ala Ser Leu Trp 75 80 Arg Arg Thr Ser iLys Arg Lys Arg
90 95 Asn Val Ala Asn Phe Val Ala Glu 105 110Trp Leu Ser Ser Arg Ser Tyr Trp 115 120 Val Val Thr lie Leu Leu
lie Ala 130
Thr Ala Leu lie Gly 145
lie Arg Ser Lys
Asn Lys Leu Met 180 Leu
Leu 165 Ser
Glu Phe Ser 195
Tyr Val Pro Ala
VaJ Trp 210
Ser Lys lie Val Met 225
Gly Asn Phe Arg
Lys Ser
Lys Gin
Thr Val 290 lie Leu 305
Asn Asp
Leu
Gly 245 Ser
Ala 230 lie
Lys 275
lie Arg His Gly
Arg Gin Asp Gly Gin Val Pro Phe
Ala 310 Pro
Leu 135
Leu Phe Ala Arg
Gly lie Phe Leu Ala Val Pro
Leu 150
Gly Leu Phe Phe
Ser
Asp
Leu Met Lys
Met 215 Ala
Arg 260
His Phe Val Glu
Phe 295 Leu
Glu
Phe 340
Glu
Lys 200 Phe
Pro
Arg Glu His Asp
Ala Asp His
lie 140 Leu
Gly Ala Ala Ala 125
Ala lie Ala Phe
lie
Met 325
Phe Tyr Ser Ser
Arg 155
Lys Asn Ala
His 170
lie Asp Arg Met
Thr 185
lie Asn Ala Gin
Trp Pro Glu Asp
lie
Asn 250 Val
Val 235 Ser
Cys
Val 220 Phe
Tyr
Tyr
Leu 265
Cys Asp Val Pro
Lys 205 Ala
Phe
Asp
Ser
Arg 280
Val Asp Leu Gly
Asp Thr Heu Tyr
Ala 300 Ala
Ala 285 Ser
Leu
Gin 345
Lys 330
Leu Arg Pro His
Arg Asn
Arg 190 Asp
Arg
Gin 175 Glu
Val 160 Phe
Arg lie Lys Asn lie Lys
Asp
Arg
Glu 270 Glu
Tyr
Met 255 Asn
Lys Gly Ala Phe lie Lys
His 315
Gly Phe Arg Phe
Lys 350
Asp 335 Asn
Pro 240 Leu
Ala
lie
Ala
Lys 320 Asp
lieGlu Gly Leu lie Arg Ala Tyr Ala Lys Val Leu Lys Glu His Gin Arg
360 365 Ala Gin Phe Gin Tyr Asp Lys Arg lie
Leu 355
Lys Leu lie Leu
Pro Ala 370
Gin Thr Phe lie Asp 385
His Ser Leu Pro
Thr 375
Asn Gly Leu
Asp 390
Lys Val Leu Ala
Asn 405
Pro Thr Asn Phe
Leu Ser Val Thr 420
Tyr Ser Val Gly
Ser Glu Ala 435
Val Val Gin Glu Val lie 450
Phe Asn Pro Leu Asp Val 465 470 Leu Asp Asn Arg Gin Arg 485
Lys Leu Ser Ala Arg Thr 500
Leu Leu Lys Ser Val Ala 515
Trp Asp
Thr 440 Asp
Glu 425 Pro
Pro
Phe Gin Tyr 380
His Ala Asp Val Leu Ser Leu 395 400 Ala Leu Tyr His Leu Ala Ser 410 415 Gly Gly Phe Pro Phe Thr Phe 430
Ser lie Met Ser Arg lie Pro 445
Asp Leu Met Thr
Asp Asp Pro Glu Leu Gin 455 460 Asp Asp lie Ala Asn Lys Met lie Phe Gly 475 480 Leu Phe Glu Ala Gin Ser Ser Leu Tyr Ala 490 495 Gin Val Ala Ala Asn Asp Tyr Leu Ser
Val 505
Asp Tyr 510
〈210〉 2
〈211> 1560
<212> DNA
〈213〉 流產(chǎn)布魯氏菌(5r歸77a a力orz^)
〈400〉 2
atgaataagc tcggcgtgtt tatcggctat aacccaggcc aattagatcc atatcagggt 60atttctcgcttaattgcattcgtga_tC33gggggccttgaaccagggtagcggtgtaaca120
attgcttgccccggctggctaa明gacgatgtacgtgttcttttggaagatgctgatatc180
ccacttgaagcggtc肌肌ttatcgcgacgaatggtcagcctccattggcttcgttatgg240
aagttgagagataagttccgtaag卿cggacgagtaaacgaaaacgtctctggctggag300
cgctatggcaaaaatgttgcaaattttgttgcagaatggctttcttcgcgctcgtattgg360
gggatttttttgggggctgctgcaattgctgtagtgactattctacttgccgtaccaatt420
gctatagccttcaccgctcttatcggccttctatttgctcgtcggcttattagacgtgtt480
atcaggtcaaagcttggtttgttttttcacaaaaatgccaat caatt caacaaattaatg540
tcatctgatgaaaccatcgaccggatgagggaacgggaattctcattgttg3tga卿ag600
atcaacgcccagaaggacatC33Bgtttggtatgtaccagccatgttttggcccgaggtc660
gctaacataacgtgatggcggccccggatatcgtcttcttcgattaccca720
gggaacttccgagggatacg3g3gC3t33Ctcatacgstcgcatgttaa^gagcttgagg780
tctgccgatcatctcgtttgctacagtgaaMtgCg犯gCtgttgaacgg840
tgtgatgttcctgcggaa肌gataacggttatccgtcacgggttcgtagatttgggagct900
tctggtgcggctattttgcgtcaagatgcscttgacacattacatgcctttatca_￡igaag960
aatgatggtc8￡L￡ltgCCgga_atatttgaaaggtttccggtttg3Cg3tgttcctttcttc1020
ttctattcttcacagcttagaccacacaaaaacatagaaggccttattagggcttatgca1080
aaagtattgaaagagcatcagcgcccagcaaaacttatccttacggcacaatttcaMat1140
gacaagcgcatccagacctttatagatgataatggcctgcatgctgatgtgctgtcgctg1200
cattctttacacttgctgctctatatcacctggcatcattgtcggtcacg1260
ccaacaaacttcgeiggg鄉(xiāng)gttcccatttacattttcagaagcctattcggtcggcact1320
ccatcgatcatgagccgtatcccagtcgtgcaggaagtgattgatgatccagagcttcaa1380
gacttgatgacattcaatcctttggatgtggatgatatagccaataagatgatttttggt1440
ttggacaacaggcaacgtctatttgaggcgcagtctagtctatacgccaaattatccgct1500
cgcacatggcaggtcgccgcaaatgattatctgtctctgcttaaatctgttgcagactag1560
<210> 3
〈211> 24
<212〉 DNA <213>人工序列<220> <223>
<400> 3
ggggtaccaa cccaaatgct caca
〈210> 4
〈211〉 25
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220>
<223>
<400> 4
aagcttcacg ccgagcttat tcatg
<210〉 5
<211〉 29
〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
〈223〉
〈400〉 5ggcgtgaagc ttcaggtcgc cgca犯tga
〈210〉 6
〈211〉 25
<212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉
<223〉
<400> 6
cgggatccgc gtggcaagcg taatg 25
〈210〉 7
〈211〉 32
<212> 腿 <213>人工序列
<400> 7
ccccaagctt cacgtcttga gcgattgtgt ag 32
<220>
〈223〉
<210〉 8
〈211〉 30
<212〉 DNA <213>人工序列〈220〉 <223> <鄉(xiāng)> 8
ccccaagctt ggaaaacgat tccgaagccc
<210〉 9
<211〉 2406
〈212〉 醒 <213>人工序列
<220〉
〈223〉
<400> 9
atgctcacaaa^8iccEitgca
ggca肌ctaaagggtaagata^agacaaag
ccatcccatcgatggcaggccaagtacgaa
attgttgcgggtctcgacaacctgaaa3gc
aaggagtatgcggagcttcttgcttcagct
aacggaacttttgctgcggtcgaagcagca
tacccgcagatgcggtatatttctaaccgt
aggtctgtgaaggaaMggcatcagcgctt
ggtttattgcc肌gtcgagaaaccctatct
tEictgggatgtg3tCgtg3gggcagcggca
cgaagttcctatactttctagagaiateigga
acgctgccgca^gcactcagggcgc肪ggg
30
aaagcgtttcaagcgctaga cctatattac60
自gtcggtgtgagtagtgt gcggatggac120
aataaggcttatgtgaaatc tgtacgggaa180
aMgttgeigttcgctggtga ggttgcggac240
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ctgcattcgtgggaagctcsi cgcttccgaa540
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acttcggaataggaacttca agatcccctc660
ctgctaaaggaagcggaaca cgtagaaagc720cagtccgcag ggaaaacgca 卿ctgggcg taaggttggg gcgcagggg3 eLggLtggattg
ggC3C肌C3g
cccggttctt 3gcgcggctei
C3Ctg33gCg
atctcacctt tacgcttgat
3Cgt3CtCgg
gctcgcgcca cgtcgtgacc tggattcatc tacccgtgat cggtatcgcc ctgagcggga gatttcgatt ctgcttaaat agtttcgcat gagttgtcat tcaacgcaat a^ttgattag gcttaaagca gaaatcacca aggcgggtat tgccac
aaacggtgct agcgcaaaga gttttatgga aagccctgca tcaag3tctg cacgcaggtt acaatcggct tttgtcaaga tcgtggctgg
gg33ggg3Ct
gctcctgccg ccggctacct atggaagccg gccgaactgt catggcgatg gactgtggcc attgctgaag gctcccgatt ctctggggU ccaccgccgc ctgttgcaga cccaagtttc aagtaatctt aactgccagc cgcattgagg cacgtattca atggctaagg gtcgatcatc
gaccccggat gaaagcaggt
C3gC￡l￡lgCg8
a^gtaasctg atcaagagac ctccggccgc gctctgatgc ccgacctgtc ccacgacggg ggctgctatt agaaagtatc gcccattcga gtcttgtcga tcgccaggct cctgcttgcc ggctgggtgt agcttggcgg cgcagcgcat cgaaatgacc cttctatgaa ctagcgatta gtccacttta tgt卿tggt
agtacctctt atatagccgc gaacctttgc cga肌gaccc
gaatgtcagc agcttgcagt accggaattg gatggctttc aggatg鄉(xiāng)3 ttgggtggag cgccgtgttc cggtgccctg cgttccttgc gggcg鄉(xiāng)tg catcatggct ccaccaagcg tcaggatgat caaggcgcgc gaatatcatg ggcggaccgc cg感g(shù)ggct cgccttctat gaccaagcga aggttggtcg tcgaatgggc cgaaagttM gctttttctg ccagaaattc ctgaccatca ccactgaggc
C肌3gCg3tg
cggcggcgca
tactgggcta gggcttacat ccagctgggg ttgccgccaa tcgtttcgca aggctattcg cggctgtcag aatga_a_ctgc gcagctgtgc ccggggcagg gatgcaatgc aaa_ca_tcgca ctggacgaag atgcccgacg gtggaa感g(shù) tatcaggeica gaccgcttcc cgccttcttg cgcccaacct ccgcaaaitgai tgaactctgg tctcatcgct cgtccagcgc gaaca^taata aaatcaattg ggctttttct ccgcatgtct acgaatatgg
tctggacaag ggcgatagct cgccctctgg ggatctgatg tgsttgaac8 gctatgactg cgcaggggcg aggacgaggc tcgeicgttgt atctcctgtc ggcggctgca tcgagcgagc agcatcaggg gcgaggatct gccgcttttc tagcgttggc tcgtgcttta
3CgElgttctt
gccatcacga ttatctgtct attgcgcggt gtggtgatat ggcagggaat gtgccctcga ttcaaaatgc
ttgCCg333g
tctcggatga gcattacgct
780 840 ■ 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2406
19
權(quán)利要求
1、流產(chǎn)布魯氏菌重組菌株，是將流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因滅活得到的菌株。
2、 如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于所述流產(chǎn)布魯氏菌為流產(chǎn)布魯氏菌(5潔eJ7a由rzto) 2308菌株。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的重組菌株，其特征在于所述糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸 序列如序列表的序列1所示。
4、 如權(quán)利要求3所述的重組菌株，其特征在于所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序 列如序列表的序列2所示。
5、 如權(quán)利要求1至4中任一所述的重組菌株，其特征在于所述滅活是通過(guò)同 源重組實(shí)現(xiàn)的。
6、 如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于其特征在于所述同源重組是 將DNA片段KDA5導(dǎo)入所述流產(chǎn)布魯氏菌實(shí)現(xiàn)的；所述DNA片段KDA5自上游至下游依 次包括同源臂DA5-1和同源臂DA5-2;所述同源臂DA16-1和同源臂DA16-2能與所述 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列的上游和下游序列發(fā)生同源重組，滅活所述糖基轉(zhuǎn)移酶基 因。
7、 如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于其特征在于所述DNA片段KDA5 自上游至下游依次包括同源臂DA5-1、卡那霉素抗性基因片段和同源臂DA5-2;所述 同源臂DA5-1和同源臂DA5-2的長(zhǎng)度均為400-600bp。
8、 如權(quán)利要求7所述的重組菌株，其特征在于所述DNA片段KDA5的核苷酸序 列如序列表的序列9所示。
9、 權(quán)利要求1至8中任一所述重組菌株在制備流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗中的應(yīng)用。
10、 一種流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗，其活性成為權(quán)利要求1至8中任一所述的流產(chǎn)布 魯氏菌重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種流產(chǎn)布魯氏菌免疫標(biāo)記重組菌株與其在制備疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組菌株是將流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因滅活得到的。本發(fā)明的重組菌株的毒力較弱，無(wú)需滅活就可以作為疫苗免疫動(dòng)物，而且可使免疫接種動(dòng)物和臨床患病動(dòng)物通過(guò)血清學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒別。使用本發(fā)明的菌株免疫小鼠，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體與標(biāo)準(zhǔn)菌株、現(xiàn)有疫苗菌株不同，通過(guò)動(dòng)物血清的免疫學(xué)檢測(cè)能夠?qū)⒒疾?dòng)物從免疫動(dòng)物群體中鑒別出來(lái)。本發(fā)明可應(yīng)用于布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，應(yīng)用于開(kāi)發(fā)布魯氏菌病疫苗和配套的鑒別診斷試劑，對(duì)促進(jìn)全球動(dòng)物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101629151SQ200910090320
公開(kāi)日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者婕 任, 何倩倪, 吳清民, 張春燕, 牛建蕊, 真 王 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)