專利名稱：一種小反芻獸疫病毒的rt-lamp試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測小反芻獸疫病毒 的RT-LAMP試劑盒。
背景技術(shù)：
小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants vims， PPRV)屬于副粘
病毒科麻瘆病毒屬，其所導(dǎo)致的小反芻獸疫被世界動物衛(wèi)生組織列為 必須上報(bào)動物傳染病，是一種烈性、接觸性傳染病，主要感染小反芻 獸，特別是山羊高度易感，易感群中發(fā)病率高達(dá)100%,嚴(yán)重暴發(fā)時(shí) 致死率為100%。
本病于1942年在西非的科特迪瓦首次發(fā)現(xiàn)，近年來該病呈蔓延的 趨勢，并且規(guī)模越來越大。近期，我國周邊國家(老撾，孟加拉國， 印度，尼泊爾，俄羅斯，巴基斯坦和緬甸等)暴發(fā)了大規(guī)模小反芻獸 疫疫情。目前世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的小反芻獸疫病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)方法 有竟?fàn)嶦LIS A和PCR方法。
但是競爭ELISA實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長，操作復(fù)雜，屬于感染后的晚期診 斷，并不適合作為快速檢測方法；早期診斷主要釆用基于病毒核酸的 RT-PCR方法，但是由于RT-PCR耗時(shí)長、靈敏度低、特異性低、儀 器要求高，很難在感染的初期就檢測出病毒。實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan RT-PCR和NASBA方法雖然特異性和靈敏度有所提高，但是需要產(chǎn) 生熒光的引物和探針，還需要昂貴的檢測設(shè)備，最低也只能檢測到810 個(gè)拷貝的RNA模板。
環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由Notomi于2000年開發(fā)的 一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)利用4種不同的特異性引物識 別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，借助具有鏈置換作用Bst-DNA polymerase的幫助，從而可在等溫條件下進(jìn)行靶序列高效快速擴(kuò)增。近年來，國 外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。
Hong TC等人(2004 )根據(jù)LAMP的原理設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)定量 RT-LAMP方法，以快速檢測SARS-CoV，結(jié)果RT-LAMP的靈敏度是 RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速診斷H5N1禽 流感病毒的RT-LAMP檢測體系。
LAMP還可以檢測細(xì)菌、真菌等病原微生物，其靈敏度和特異性 都有很好的體驗(yàn)。但目前尚未見該方法在小反芻獸疫病毒檢測中的應(yīng) 用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于檢測小反芻獸疫病毒的特異性LAMP
引物組，包括以下四條引物
F3: 5'-ACATCAACGGGTCAAAGCT-3，；
B3: 5，-ACTCGAGGGTCCTTCAGTTG-3，；
5'-CCGCTGTATCAATTGCCCGGG-TT
FIP:
本發(fā)明的另 一 目的是提供一種包括上述四條LAMP引物，具有高 靈敏度、高特異性、可見化的、操作方法簡單的小反芻獸疫病毒的 RT-LAMP檢測試劑盒。
本發(fā)明所述的小反芻獸疫病毒的RT-LAMP檢測試劑盒還包含有
四條LAMP引物的LAMP反應(yīng)液，共同構(gòu)成LAMP檢測體系。
25nLLAMP檢測體系的具體配置為 F3、 B3 各0.1 0.2nM;
FIP、 BIP 各0.4 0.8(xM;
dNTPmix 0.4~1.0mM;
Mg2+ 2~6mM;
TT-CGGCGTGATGATC AGC ATG-3';
5 ，-GCATCCGCCTTGTTGAGGTAGT-TT
TT隱TTGTCCAAATCAGCACC ACG-3 ，。反應(yīng)緩沖液1 OxThermoPoI Reaction Buffer 1 x;
鏈置換DNA聚合酶(ZWJ/w/>wemye) 8 U;
甜菜堿(betaine) 0.5~2M;
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 10 U;
Triton X掘 0.1%。
優(yōu)選的，本發(fā)明25pLLAMP檢測體系的具體配置為
F3、 B3 各O.l pM;
FIP、 BIP 各0.8一；
dNTPmix 1.0 mM;
Mg2+ 4 mM;
反應(yīng)緩沖液lOxThermoPol Reaction Buffer lx;
鏈置換DNA聚合酶(&f ￡WXpo(ymerase ) 8 U;
甜菜堿(betaine) 0.5 M;
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 10 U;
Triton X掘 0.1%。
其中，四條LAMP引物的長度分別為
F3:ACATCAACGGGTCAAAGCT 19bp
B3: ACTCGAGGGTCCTTCAGTTG 20bp
CCGCTGTATCAATTGCCCGGG-TT
FIP: 44bp TT-CGGCGTGATGATCAGCATG
GCATCCGCCTTGTTGAGGTAGT-TT
BIP: 46bp TT-TTGTCCAAATCAGCACCACG
本發(fā)明所述LAMP試劑盒的檢測反應(yīng)條件為63X:恒溫l h, 80 °C 2min，然后終止反應(yīng)。
與現(xiàn)有的小反芻獸疫病毒早期檢測方法相比，本發(fā)明所述的 RT-LAMP試劑盒有顯著的優(yōu)點(diǎn)。首先RT-LAMP成本低廉，利用Bst DNApolymerase在63。C實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增，不需要復(fù)雜且卻昂貴的PCR儀；其次是反應(yīng)迅速，利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶實(shí)現(xiàn)一步法RT-LAMP無需 增加42'C 30min的反轉(zhuǎn)錄過程，可以在l h內(nèi)完成反應(yīng)(最少17 min )， 而一般的RT-PCR至少需要3-4h;反應(yīng)結(jié)果易于觀察，LAMP在DNA 擴(kuò)增過程中產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，在反應(yīng)結(jié)東 后無需瓊脂糖凝膠電泳可直接肉眼觀察反應(yīng)管中的渾濁來判斷陽性 與否，如果在反應(yīng)后加入熒光染料，陽性反應(yīng)管在紫外光下就會呈現(xiàn) 出強(qiáng)烈的綠色熒光；特異性好，對麻瘆病毒屬內(nèi)的犬瘟熱病毒等都呈 陰性反應(yīng)；靈敏度高，是一般RT-PCR靈敏度的1000倍，最低可以檢 測到7個(gè)拷貝的RNA模板，即使是幾個(gè)病毒粒子，也能被快速準(zhǔn)確的 檢測出來。
與RT-PCR相比，RT-LAMP操作更為簡單，產(chǎn)物更加容易檢測， 擴(kuò)增效率更高。除此之外，RT-LAMP在普通的恒溫水浴鍋中就能進(jìn) 行，而RT-PCR需要精確且快速的溫度變化，需要在精密的熱循環(huán) 儀中進(jìn)行。由于RT-LAMP的陽性結(jié)果用肉眼就可以觀察到，因此避 免了凝膠染色的步驟，也就避免了接觸溴化乙錠等危險(xiǎn)化合物。
本發(fā)明所述的RT-LAMP試劑盒可快速、靈敏地檢測小反芻獸疫 病毒，其操作簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常 適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及畜牧飼養(yǎng)場的現(xiàn)場檢測，易于大范圍 推廣應(yīng)用。


圖1為LAMP體系優(yōu)化結(jié)果，其中圖l-A為不同MgS04濃度與電 泳亮度關(guān)系圖，圖l-B為不同dNTP濃度與電泳亮度關(guān)系圖，圖1-C為 不同Betaine濃度比例與電泳亮度的關(guān)系圖，圖l-D為不同溫度下反應(yīng) 的電泳亮度關(guān)系圖。其中，圖l-A中l(wèi) 5泳道MgS04濃度分別為2mM, 4 mM， 6 mM, 8 mM, 10 mM; M為DL2000 plus marker;圖l-B中1 ~ 5泳 道dNTP濃度分別為0.2 mM， 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1.0 mM; M為DL2000 plus marker;圖l-C中1 ~ 5泳道Betaine濃度分別為0 mM, 1 mM， 1.5 mM, 2.0 mM, 2.5 mM， M為DL2000 plus marker;圖l-D中1 5 分別為反應(yīng)混合物的反應(yīng)溫度分別為6rC， 62°C, 63°C, 64°C， 65 °C ， M為DL2000-plus marker。
圖2為內(nèi)外引物濃度優(yōu)化的結(jié)果，1 4泳道分別是內(nèi)外引物濃度之 比分別為2:1 ，4:1,6:1 ，8:1的電泳結(jié)果；M為DL2000-plus marker。
圖3為RT-LAMP特異性實(shí)驗(yàn)；其中M: DL2000plus; 1:以犬瘟 熱病毒基因組為模板的RT-LAMP; 2:以PPRV基因組為模板的 RT丄AMP。
圖4為RT-LAMP 、 RT-PCR和巢式PCR的靈敏度檢測；
其中圖4-A中，M:DL2000plus; 1~ 12:以10倍稀釋的PPRVRNA (8.5 ng/^iL ~ 8.5 x 10-12ng/(iL)為模板的RT-LAMP。
圖4-B: M.DL 2000 plus; 1 ~ 12.以10倍稀釋的PPRVRNA (8.5 ng/|iL - 8.5 x l(T12 ng/(iL )為模板的RT-PCR。
圖4-C: M.DL2000plus; 1 ~ 12.以RT-PCR產(chǎn)物為模板的巢式 PCR。
圖5為RT-LAMP的可視化結(jié)果；其中，N:陰性對照；1-12: 以10倍梯度稀釋的PPRVRNA(8.5ng/pL 8.5x 10-12ng/jaL)為模板 的RT-LAMP實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 如無特別指明，以下實(shí)施例所用的引物由上海英駿生物技術(shù)有限
公司合成；5WDNA聚合酶(大片段購自NewEngland公司；甜菜堿 (Betaine )、 Mg2 +購自Sigma公司。
實(shí)施例l
一、引物的設(shè)計(jì)
使用Primer 4.0 (http:〃primerexlorer.ip: Eiken Chemical Co. Ltd,Japan),針對PPRV N基因的保守區(qū)域(GeneBank， gi: 39乃61,保 守區(qū)域l-700bp)設(shè)計(jì)四條引物，包括兩條內(nèi)引物(FIP和BIP)和兩 條外引物(F3和B3) 二、 RT國LAMP
1、 病毒RNA的提取
取小反芻獸疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 (新疆天康生物制品廠制 品小反芻獸疫弱毒疫苗)。使用TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒(TaKaRa公司)，按照說明書從250 juL PPRV細(xì)胞培養(yǎng)液中提取病毒總RNA，最后溶于30 洗提緩沖液 (Elution Buffer)中，加入1 m L RNA酶抑制劑(TaKaRa公司)(20 U)， -80 °C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br> 2、 RT-LAMP檢測體系的建立
參照Notomi等(Notomi， T.， Okayama, H., Masubuchi， H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA [J]. Nucleic Acids Res, 2000，28:E63)，構(gòu)建25 ju LRT-LAMP反應(yīng)體系，依次對MgS04、 dNTP、 Betaine的濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。
通過設(shè)置不同終濃度的Mg2+: 2 mM， 4 mM， 6 mM， 8 mM, 10 mM， 12 mM;不同終濃度的dNTP: 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1.0 mM，1.2mM;不同終濃度的Betaine: 0 mM, 0.3 mM, 0.5 mM, 1 mM; 不同終濃度的內(nèi)外引物濃度比例2:1,4:1,6:1,8:1, 10:1，此時(shí)具體的 引物濃度比為0.2^M: 0.1 pM， 0.4pM: 0.1 pM, 0.6|iM: 0.1 (iM， 0.8pM: 0.1 pM, l.OpM: 0.1 pM，其它條件選擇實(shí)驗(yàn)過程的優(yōu)選試驗(yàn)條件。
包含20mMTris-HCl， pH8.8, lOmMKCl， 10 mM (NH4)2S04， 0.1% Triton X畫100, 2 mM到10mMMgSO4， 0.2 mM到1.0 mM each dNTP, 0 M到2 M Betaine, 8 U Z)iV/i ; ofymera^ ， 10 U AMV反轉(zhuǎn) 錄酶，1 juLRNA，各O.l nMF3和B3;各0.8 juMFIP和BIP，補(bǔ) 充DEPC水至25 juL。反應(yīng)混合物分別置于61°C, 62°C, 63°C，64。C及65°C水洛鍋中反應(yīng)lh, 80°C 2 min終止反應(yīng)，最終通過產(chǎn) 物瓊脂糖凝膠電泳獲得獲得的典型梯狀條帶的亮度，優(yōu)化得到最佳反 應(yīng)參數(shù)。
結(jié)果見圖1的A、 B、 C、 D,顯然，當(dāng)MgS04的濃度為2-6mM時(shí)， 條帶清晰；當(dāng)dNTP的濃度為0.4-1.0mM,條帶清晰；當(dāng)甜菜堿Betaine 的濃度為l、 1.5、 2.0M時(shí)，條帶清晰；在65。C進(jìn)行反應(yīng)得到的電泳結(jié) 果的條帶清晰。
在65。C反應(yīng)lh, 80°C 2min對不同內(nèi)外引物濃度比例的反應(yīng)體 系進(jìn)行反應(yīng)，通過凝膠電泳選擇較亮的條帶作為反應(yīng)的最終濃度，結(jié) 果參見圖2。當(dāng)內(nèi)外引物濃度為8:1時(shí)，條帶清晰。
優(yōu)化的檢測體系(25 jaL)如下
1 x ThermoPol Reaction Buffer,夕卜引物(F3和B3 )各0.1 p M， 內(nèi)引物(FIP和BIP )各0.8 m M, Mg2+ 4 mM， Betaine 0.5 M, d NTP mix l.OmMeach， 0.1%的TritonX-100, BstDNA聚合酶8U, AMV 反轉(zhuǎn)錄酶10 U,模板1 )aL。
檢測反應(yīng)條件63"C恒溫lh, 80°C 2min終止反應(yīng)。
3、檢測體系特異性、靈敏性分析
使用同為皰瘆病毒屬的犬瘟熱病毒和小反芻獸疫病毒為模板檢 測體系的特異性，LAMP檢測體系的特異性測試良好，可特異性的檢 測到小反芻獸疫病毒。參見圖3。
從250 JuL小反芻獸疫病毒液中提取病毒總RNA，在紫外分光 光度計(jì)上測定其RNA含量，將RNA樣品進(jìn)行十倍梯度稀釋，將稀 釋后的樣品分別進(jìn)行RT-LAMP 、 RT-PCR和巢式PCR ( RT-PCR使用
的弓l物是 Nup :CTGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAG ; 和 Nlp : GTTGCGGCCGCTCAGCTGAGGAGATCCTTGT;巢式PCR所用的引物是夕卜引
物與RT-PCR使用的引物相同；內(nèi)引物為Nf: ggcgtgatgatcagcatgtt;
以及Nd: CCACGTGATGCAAAGGTCAAC ),比較三種檢測方法的靈敏度。RT-LAMP可以檢測到RNA的為水平8.5 x 1(T"ng/|a L,而RT-PCR 僅能檢測到8.8x l(T8ng/|aL,比RT-LAMP低了 3個(gè)數(shù)量級。參見圖 4。
4、檢測體系的結(jié)果鑒定
一方面，由于LAMP在DNA擴(kuò)增過程中產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉 淀使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，可通過觀察終反應(yīng)液是否渾濁確認(rèn)是否進(jìn)行了 擴(kuò)增反應(yīng)，是否為陽。
也可以在RT-LAMP檢測體系中加入熒光染料SYBR Green I，紫外 燈下肉眼觀察若反應(yīng)液變?yōu)榫G色，則說明反應(yīng)呈陽性，若無色則說明 反應(yīng)為陰性，參見圖5。序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
<120> —種小反芻獸疫病毒的RT-LAMP試劑盒
<130> KHP09112534.5
<160> 8
<170> Patentln version 3.5
<210> <211> <212> <213>
1
19
DNA
人工序列
<400> 1
acatcaacgg gtcaaagct
<210> 2
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
actcgagggt ccttcagttg
<210> 3
<211> 44
<212> DNA <213>人工序列
<400> 3
ccgctgtatc aattgcccgg gttttcggcg tgatgatcag catg 44
<210> 4 <211> 46 <212> DNA
19
20<213>人工序列 <400> 4
gcatccgcct tgttgaggta gtttttttgt ccaaatcagc accacg 46
<210> 5
<211> 29
<212> DNA <213>人工序列
<400> 5
ctggaattca tggctactct ccttaaaag 29
<210> 6
<211> 31
<212> DNA <213>人工序列
<400> 6
gttgcggccg ctcagctgag gagatccttg t 31
<210> 7
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<400> 7
ggcgtgatga tcagcatgtt 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<400> 8
ccacgtgatg caaaggtcaa c 2權(quán)利要求
1、一種用于檢測小反芻獸疫病毒的特異性LAMP引物組，包括以下四條引物F35’-ACATCAACGGGTCAAAGCT-3’；B35’-ACTCGAGGGTCCTTCAGTTG-3’；5’-CCGCTGTATCAATTGCCCGGG-TTFIPTT-CGGCGTGATGATCAGCATG-3’；5’-GCATCCGCCTTGTTGAGGTAGT-TTBIPTT-TTGTCCAAATCAGCACCACG-3’。
2、 一種包括如權(quán)利要求1所述的四條LAMP引物的小反芻獸疫 病毒的RT-LAMP檢測試劑盒。
3、 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包含LAMP反應(yīng) 液，與四條LAMP引物共同構(gòu)成LAMP檢測體系；25liLLAMP檢測體系的具體配置為F3、 B3 各0.1 ~0.2pM;FIP、 BIP 各0.4 0.8)xM;dNTPmix 0.4 1.0mM;Mg2+ 2~6mM;反應(yīng)緩沖液1 OxThermoPol Reaction Buffer 1 x;鏈置換DNA聚合酶 8 U;甜菜堿 0.5~2M;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 10 U;Triton X掘 0.1%。
4、如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，25pLLAMP檢測體 系的具體配置為F3、 B3 各O.l ^M;FIP、 BIP 各0.8pM;dNTPmix 1.0 mM;Mg2+ 4 mM;反應(yīng)緩沖液1 OxThermoPol Reaction Buffer 1 x;鏈置換DNA聚合酶 8 U;甜菜堿 0.5 M;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 10 U;Triton X-100 0.1%。
5、如權(quán)利要求2-4任一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測反應(yīng)條件為63r恒溫lh， 80°C 2min,然后終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測小反芻獸疫病毒的RT-LAMP試劑盒，所述試劑盒包含有四條LAMP引物的LAMP反應(yīng)液構(gòu)成的檢測體系。該試劑盒可快速、靈敏地檢測小反芻獸疫病毒，其操作簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及畜牧飼養(yǎng)場的現(xiàn)場檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/70GK101613766SQ20091009032
公開日2009年12月30日 申請日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日
發(fā)明者偉 李, 剛 李, 赫爾曼·昂格爾 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所