專利名稱：：一種輔助檢測豬生長速度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種輔助檢測豬生長速度的方法。
背景技術(shù)：
：豬是最早的家養(yǎng)動物，已經(jīng)有7000多年的歷史，是最重要的農(nóng)業(yè)動物之一。豬肉是人類動物蛋白的主要來源，占世界紅肉消費量的43%(RothschildandRuvinsky，1998)。提高產(chǎn)肉性狀(豬肉產(chǎn)量和肉品質(zhì)量)一直是豬遺傳改良的主要目標(biāo)。在過去二十多年來，為了人類提高豬肉產(chǎn)量，滿足市場對豬肉消費的需求，豬遺傳育種科技工作者通過長期的選育，使豬生長速度的大幅提高。盡管如此，增加豬肉產(chǎn)量仍然是豬育種的一個重要目標(biāo)，生長速度依舊是一個重要的育種性狀。在過去二十年來，利用數(shù)量遺傳學(xué)和傳統(tǒng)育種手段取得了顯著的成效。使生長速度的遺傳改良取得長足進展，但傳統(tǒng)育種對種豬生長速度指標(biāo)的度量依賴于性能測定，評估一頭豬的生長性能如何，需要經(jīng)過數(shù)個月的測定。長達數(shù)個月的飼養(yǎng)管理和繁瑣的測定工作，使性能測定工作在操作上存在諸多不便，且增加許多管理和飼養(yǎng)成本，同時測定的頭數(shù)受到人力、物力和財力的限制。因此，在許多種豬場，生產(chǎn)性能測定都難以實施。此外，一頭豬是否具有較好的種用價值須等到測定結(jié)束才能進行評價。從而使種豬測定工作和遺傳評估的開展帶來諸多不便，從而影響豬的遺傳改良效果。因此，尋找一種操作簡便，且能實施早期選擇和評定的標(biāo)準(zhǔn)，對于豬的遺傳育種工作非常重要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些性狀相關(guān)的分子標(biāo)記相繼被鑒定，這為豬的遺傳改良提供了新的手段，通過分子育種技術(shù)的實施，使豬的早期選擇和定向精細育種實現(xiàn)也逐漸成為現(xiàn)實。隨著基因和分子標(biāo)記的鑒定與定位，動物遺傳學(xué)家已經(jīng)開始研究影響豬生長、胴體和肉質(zhì)等產(chǎn)肉性狀的相關(guān)基因。生長、胴體和肉質(zhì)性狀是中或高遺傳力的性狀，通過基因組掃描、候選基因法等方法相繼鑒定了一些豬生長相關(guān)的基因和分子標(biāo)記。Kim等(2000)研究發(fā)現(xiàn)，黑皮質(zhì)激素受體(melanocortin4rec印tor，基因影響采食量，并與膘厚和生長速率有關(guān)。早在20年多前就發(fā)現(xiàn)，HAL基因是引起PSE肉的主效基因。后來研究發(fā)現(xiàn)，豬應(yīng)急綜合癥(PSS，PorcineStressSyndrome)是由豬6號染色體上的RYR1(Ryanodinerec印tor)的突變引起(Fujiiefa丄，41991)。第二個被發(fā)現(xiàn)影響肉質(zhì)的主效基因是RN基因。它最先是在法國的漢普夏豬中發(fā)現(xiàn)，因此，學(xué)術(shù)上稱為"漢普夏效應(yīng)"。研究表明，RN等位基因在白肌中增加大約70%的肝糖原。RN—位點的存在后來通過伺養(yǎng)試驗證明，并被定位于豬15號染色體上。RN等位基因已經(jīng)被證明與更瘦的胴體有關(guān)。之后，經(jīng)過數(shù)年不斷的努力，由L.Andersson,D.MilanandC.Looft所領(lǐng)導(dǎo)的小組報道一個突變位點被鑒定。這個相關(guān)基因是編碼AMP-活性蛋白激酶復(fù)合體基因家族調(diào)節(jié)亞基的一個新成員(名字叫PRKAG3)。此外，基因內(nèi)的另一個突變也被發(fā)現(xiàn)，它與滴水損失有關(guān)。在CAST基因中的突變影響嫩度。荷蘭研究者早期的工作表明，豬心脂肪酸結(jié)合蛋白基因(H-FABP)可能與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)。這個基因的位置臨近6號染色體一個QTL。Kini等(2000)研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因?qū)Σ墒沉坑泻艽笥绊?，并與膘厚和生長速率有關(guān)。幾乎所有被研究的商品系中都發(fā)現(xiàn)受突變的影響。對膘厚和肌肉量的顯著印記效應(yīng)在2號染色體短臂的一個QTL上檢測到。進一步分析表明產(chǎn)生的突變可能與IGF2有關(guān)，IGF2是一個眾所周知的印記基因。Malek等(2001b)的研究證明，在RN或PRKAG3基因中的區(qū)段存在一個pH值和肌肉染色性狀顯著的QTL。當(dāng)RN—突變在這些家系中不存在時，對15號染色體QTL效應(yīng)進一步研究顯示在RN—位點有三個額外的突變。數(shù)個與產(chǎn)肉性狀相關(guān)的基因已經(jīng)在商業(yè)生產(chǎn)中得以應(yīng)用。Fascins蛋白家族是一類結(jié)構(gòu)上獨特、進化中保守的肌動蛋白結(jié)合蛋白。Fascins蛋白在細胞突觸的形成過程中起到重要作用，在細胞黏附、細胞運動和細胞間相互作用過程中扮演著重要的角色。細胞表面的血小板凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin-l，TSP-1)和層粘連蛋白(Laminin-5，LN5)可以與fascin發(fā)生相互作用，與具有組成型活性結(jié)構(gòu)的GTP酶與Racl或Cdc42復(fù)合物共同促進突觸形成。另外，纖維結(jié)合蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和玻璃體結(jié)合蛋白(vitronectin,VN)介導(dǎo)fascin參與細胞形成黏著斑，并激活蛋白激酶Ca(PKCa)信號通路。Fascin作為PKCa酶活性底物，磷酸化后失去與actin結(jié)合活性，導(dǎo)致外皮層刺突形成。圖中鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(caldesmon)、原肌球蛋白(tropomyosin)和drebrin均可以抑制fascin與F-actin結(jié)合的活性。在脊椎動物中fascins蛋白家族包含3個成員Fascinl，F(xiàn)ascin2，F(xiàn)ascin3。Fascinl也成為fascin，最早是于20世紀(jì)70年代在海膽卵母細胞和腔泡中發(fā)現(xiàn)，分子量為55kDa，因為該蛋白具有將F-肌動蛋白緊密穩(wěn)定地結(jié)合在一起特性，故將它命名為fascin(源于拉丁文fasiculus)。這一類被稱為fascinl蛋白，無論在脊椎動物還是在無脊椎動物中都具備很高的保守性。后來，人們陸續(xù)在牛視網(wǎng)膜和人視網(wǎng)膜中鑒定出一類新的fascin蛋白，其氨基酸序列與人fascinl有56%的相似性，人們將這一成員命名為視網(wǎng)膜fascin(即fascin2)。第3類fascins家族成員是從人睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的，人fascin3蛋白的氨基酸序列與人fascin2和fascin3均有27%的相似性。Fascinl蛋白由FSCN1基因編碼，人們已經(jīng)通過生物化學(xué)和生物物理學(xué)等技術(shù)對其功能進行了深入的研究，它可以將F-肌動蛋白絲交聯(lián)成一束單極性的肌動蛋白束，從而增強肌動蛋白束的剛性，這種結(jié)構(gòu)也是構(gòu)成微絲、層形足板、絲足和樹突的主要組成構(gòu)件。近年來，人們對fascinl功能的報道日趨增多。fascinl蛋白在細胞水平上影響到細胞的生長、發(fā)育和正常的生物學(xué)作用。例如，人們發(fā)現(xiàn)Fascinl在神經(jīng)脊分化過程中發(fā)揮著重要的作用，F(xiàn)SCN1被認為NT2神經(jīng)元分化的標(biāo)記基因。同樣，F(xiàn)ascinl在脊椎動物胚胎發(fā)育過程中也起到了重要的生物學(xué)作用。人們發(fā)現(xiàn)尸5"GW基因在胚胎骨骼肌發(fā)育和橫紋肌肉瘤(RMS，rhabdomyosarcoma)發(fā)生中有著相似的表達特點，該基因被認為是賜S標(biāo)記基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種輔助檢測豬生長速度的方法。本發(fā)明所提供的輔助檢測豬生長速度的方法，包括如下步驟檢測待測豬的基因組DNA中的SEQIDNO:3所示序列自5'末端起第6840位核苷酸為C還是T或者檢測待測豬的基因組DNA中的SEQIDNO:4所示序列自5'末端起第159位核苷酸為C還是T，確定待測豬的基因型，再根據(jù)基因型判斷所述待測豬的生長速度；所述確定待測豬的基因型的方法如下若所述核苷酸為C，則所述待測豬的基因型記作CC(純合體)；若所述核苷酸為T，則所述待測豬的基因型記作TT(純合體)；若所述核苷酸為T和C，則所述待測豬的基因型記作CT(雜合體)；所述根據(jù)基因型判斷所述待測豬的生長速度的方法包括如下步驟所述基因型為CC或TT的待測豬的生長速度高于基因型為CT的待測豬的生長速度。上述過程中，所述檢測是通過PCR擴增實現(xiàn)的。具體是通過擴增含有待測豬的基因組DNA中的SEQIDNO:3所示序列自5'末端起第6840位核苷酸(或者待測豬的基因組DNA中的SEQIDNO:4所示序列自5'末端起第122位核苷酸)的片段。上述過程中，所述PCR擴增的引物如下1)一條引物的序列如序列表中SEQIDN0:5，另一條引物的序列如序列表中SEQIDNO:6;2)—條引物的序列如序列表中SEQIDN0:8，另一條引物的序列如序列表中SEQIDN0:9。上述過程中，所述檢測的方法，在所述PCR擴增后，可包括測序的步驟。上述過程中，所述檢測的方法，在所述PCR擴增后，還可包括對所述PCR擴增得到的產(chǎn)物進行酶切電泳的步驟。上述過程中，所述酶切中用的酶是限制性核酸內(nèi)切酶NaeI。上述過程中，若所述PCR擴增產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果顯示為441bp的一條帶，則所述待測豬的基因型為TT;若所述PCR擴增產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果顯示為159bp和282bp的兩條帶，則所述待測豬的基因型為CC;若所述PCR擴增產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果顯示為441bp、159bp和282bp的三條帶，則所述待測豬的基因型為CT。本發(fā)明的另一個目的是提供一種豬生長速度相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白名稱為FSCN1，來源于豬，其氨基酸序列如a)或b)所示(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQIDNO:1由493個氨基酸殘基組成。本發(fā)明所提供的編碼基因為如下l)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；(cDNA)2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；(基因組DNA)3)在嚴(yán)格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；4)與l)或2)限定的DNA序列有90y。以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為雜交后用含O.lxSSPE(或0.1xSSC)、0.1%SDS的溶液在65。C下洗膜。序列表中的SEQIDNO:2為本發(fā)明基因的mRNA序列，由2721個堿基組成，自序列的5'端第126-1607位核苷酸為開放閱讀框，自5'端第1-125位核苷酸序列為5'非翻譯區(qū)(UTR)，自5'端第1608-2727位核苷酸序列為3'UTR，自5'端第2687-2693bp處的核苷酸序列為AATAAA加尾信號，自5，端第2694-2721bp處的核苷酸序列為PolyA尾巴。序列表中的SEQIDNO:3由9043個堿基組成，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，自序列的5'端第1-920bp處的核苷酸為F5TA7基因的第1外顯子序列，6652-6808bp處的核苷酸為第2外顯子序列，6911-7032bp處的核苷酸為第3外顯子，7281-7448bp處的核苷酸為第4外顯子序列，7777-7979bp處的核苷酸為第5外顯子序列，921-6651bp處的核苷酸為第1內(nèi)含子的完全序列，6809-6910bp處的核苷酸為第2內(nèi)含子序列，7033-7280bp處的核苷酸為第3內(nèi)含子序列，7449-7776bp處的核苷酸為第4內(nèi)含子序列。本發(fā)明通過大量的實驗，找到了與豬生長速度相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記等位基因，從而為豬的標(biāo)記輔助選擇乃至分子育種提供理論依據(jù)。本發(fā)明的輔助篩選生長速度快的豬的方法可在個體早期進行生長速度檢測，可較早地對種豬進行選擇，加快分子育種進程，高效改善豬的生長性能。本發(fā)明的方法與常規(guī)生長性狀檢測相結(jié)合，可提高檢測的準(zhǔn)確性和效率。本發(fā)明方法操作簡便、快速、靈敏，檢測的結(jié)果可靠、穩(wěn)定、準(zhǔn)確。因此，本發(fā)明方法將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。圖1為本發(fā)明中豬尸5"Gy/基因的GLGI實驗獲得3'UTR電泳結(jié)果。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bpladder)。圖2為豬/^0(/基因第2內(nèi)含子船el-RFLP的三種基因型(CC，CT，TT)的分型結(jié)果。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、豬,5"GW基因及其全長mRNA的獲得1.豬/^GW基因序列信息的獲取以人的同源基因尸沉附的mRNA(GenBank收錄號NM一003088.2)為信息探針，8利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為85y。以上的ESTs(片段長度大于100bp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查詢相應(yīng)序列，然后用軟件DNAStar中的Seqman程序構(gòu)建豬的EST重疊群，從而獲得拼接的豬mRNA序列。為驗證該拼接得到的mRNA為豬/^07基因全長mRNA序歹ij，設(shè)計4對引物(見表2)進行PCR擴增、測序驗證。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.反轉(zhuǎn)錄PCR擴增反應(yīng):提取豬的總RNA。cDNA第一鏈的的合成反應(yīng)總體積為50ixL，首先將2ug總RNA與oligod(T)u混合于Ependorff管中，7(TC溫育5min以解除RNA的二級結(jié)構(gòu)，立即置于冰上冷卻以避免二級結(jié)構(gòu)的重新生成，經(jīng)短暫離心后按照表3的加樣條件加入其余組分，于37'C溫育1h后將溫度升至95'C滅活反轉(zhuǎn)錄酶，置于一2(TC保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)反應(yīng)總體積為20iiL，各組分的加樣體積及終濃度如表4所述(其中的引物如表2所示)。PCR擴增程序是94。C3min，94°C30s，退火45s，72°C1rain，循環(huán)35次，最后72'C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表3、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系表4、PCR反應(yīng)體系組分體積終濃度總RNA10(xL2嗎oligod(T)u1pmol/LDEPCH2020|jL一5xPCRbuffer10pL5xdNTP500拜ol/LRNAsinl)xL40UM-MLVl單300U總體積50jxL組分體積終濃度d線O13.2pL一10xPCRbuffer2(iL10xMgCl21.5mmol/L引物l(xL10(xmol/LdNTP1Ommol/LT叫DNA聚合酶1UcDNAluL>100ng總體積20|xL3.PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序(1)凝膠純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mLEpendorff管中，于7(TC溫育至凝膠完全融化，然后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)純化PCR產(chǎn)物，具體操作按試劑盒說明書進行。(2)連接反應(yīng)將純化RACE產(chǎn)物與pGEM-T(Promega)載體連接，連接反應(yīng)總體積是5uL，其中包括2.5"L2Xbuffer，0.5"L的T載體，1.5uL的純化PCR產(chǎn)物，0.5uL的T4連接酶，最后置4'C水浴過夜。(3)感受態(tài)細胞的制備從37。C培養(yǎng)了1620h的新鮮平板上挑取一個DH5a單菌落接種于2mLLB中，于37"C振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接lmL菌液于含有30mLLB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37°C振蕩培養(yǎng)約4h，待ODe。。達到0.3~0.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻1(T15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4'C4，OOOg離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10mL冰預(yù)冷的O.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30rain，重復(fù)4°C4，OOOg離心10min—次，用4mL冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4t:保存?zhèn)溆谩?4)轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100120uL感受態(tài)細胞于1.5mLEpendorff管中，將5uL的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3、min，加入40QuL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)45min。取100uL涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-e-D-galactoside，異丙基硫代—P-D—半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37。C平放lh后倒置培養(yǎng)。(5)質(zhì)粒的小量制備挑取平板上的單菌落，接種于23mLLB中，37。C300r/min培養(yǎng)過夜。用1.5mLEP管12000r/min離心數(shù)秒收集菌體。然后使用天根生化科技有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒進行質(zhì)粒DNA的提取。具體操作按試劑盒操作說明進行。(6)重組質(zhì)粒的測序取3uL質(zhì)粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為15uL，加入23U限制性內(nèi)酶及2uL相應(yīng)的10X限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置37X:水浴廣2小時，取23uL反應(yīng)液于瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切結(jié)果與預(yù)計完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進行測序，序列測定由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。(7)DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。4.GLGI獲得3，UTR對本人構(gòu)建的豬胚胎骨骼肌LongSAGE文庫進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽序列ATAGTAGCTTCAGACTGG與人的FSCN1基因3'UTR區(qū)高度同源，可能該標(biāo)簽代表豬的FSCN1基因。用于豬胚胎骨骼肌LongSAGE文庫構(gòu)建的RNA用于該實驗的未知標(biāo)簽序列分析。首先，cDNAs第一鏈和第二鏈通過oligo(dT)引導(dǎo)進行雙鏈合成。然后根據(jù)商家提供的說明書，按照I-LongSAGEkit(Invitrogen，USA)操作手冊，將合成好的雙鏈cDNAs用A7ain酶進行消化，并均分成兩等份分別進行接頭A和B連接。帶有接頭序列的3'cDNAs用作GLGI擴增的模板。為了產(chǎn)生足夠量的模板，需要對模板進行擴增。模板擴增參照陳建軍的方案進行。位于接頭中的序列(5，-GGATTTGCTGGTGCAGTACA-3，對應(yīng)于接頭A，或5，-CTGCTCGAATTCAAGCTTCT-3，對應(yīng)于接頭B)和位于3'cDNA末端的序列5，-ACTATCTAGAGCGGCCGCTT-3，(cDNAs雙鏈合成時整合在oligo(dT)弓|物序列中)分別用作模板擴增的正、反向引物。擴增的PCR條件為94°C2min;94°C30sec,55°C30sec，72°C30sec擴增27個循環(huán)；72°C5min。擴增產(chǎn)物進行純化然后溶解在DEPC處理的滅菌水中。正向引物基于LongSAGE標(biāo)簽設(shè)計(5-CATGATAGTAGCTTCAGACTGG-3)，位于3'cDNA末端的序列5'-ACTATCTAGAGCGGCCGCTT-3'作為通用的反向引物。引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成，濃度稀釋為50ng/uL。GLGI反應(yīng)體系為30uL，包括3uL10xPCRbuffer,0.45uL10mmol/LdNTPs,1.5ul50ng/uL正、反相引物，0.9uLcDNAs模板，1.2uL7邵DNApolymerase(5U/uL)，dH20補足到30.0uL。GLGI擴增在德國產(chǎn)的EppendorfPCRSystem9600儀上進行。PCR擴增條件為94°C2min;然后94。C，30sec;引物對相應(yīng)的退火溫度30sec;72°C，30sec條件下擴增27-30個循環(huán)；最后一個循環(huán)結(jié)束后72。C維持5min。擴增產(chǎn)物參照陳建軍等建立的方法進行沉淀，棄取上層懸浮物。擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖如圖1所示。室溫下風(fēng)干然后將其溶解在5uL滅菌水中。連接混合物體系為每個反應(yīng)5uL，包括0,5uL的10ng/uLp,18T載體(Katara,JPN);2uL的連接buffer;1.5uL的GLGI擴增產(chǎn)物；l.OuL的滅菌水。在16°C的恒溫循環(huán)器中連接2-3h。將連接好的載體混到50-100uL的大腸桿菌DH&感受態(tài)細胞中。冰上放置30min，然后42。C熱激90sec。然后再在冰上放置3-4min。每管加入500uL的無抗生素的LB培養(yǎng)基。37"C條件下以225r/min的速度在搖床上搖45分鐘。將100uL轉(zhuǎn)化物均勻涂布在有氨芐青霉素(濃度為50ug/mL)的LB培養(yǎng)皿中，37°C恒溫箱中過夜生長。挑取白色陽性克隆子直接進行菌液PCR擴增，每個標(biāo)簽挑取10個克隆進行PCR鑒定。用2。/。的膠對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，將插入有大小片段不同的克隆子送公司測序。序列如序列表中序列7所示。將所有克隆測序的序列在NCBI網(wǎng)上進行BLAST序列比對(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。只有那些包含標(biāo)簽序列、與數(shù)據(jù)庫中的序列在相同方向的同源性不到85%或完全不同源的序列才被認為是一個真正的新序列，否則被列為已知序列范圍。那些不含標(biāo)簽的序列被剔除。(8)具體實施效果RT-PCR和GLGI擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物凝膠回收純化后克隆測序，得到mRNA各部分片段和3'UTR區(qū)序列。將所獲得擴增產(chǎn)物序列用DNAStar中的Seqman程序進行拼接，得到一條長度為272lbp的mRNA完整序列(SEQIDNO:2)。將這段mRNA序列在GenBank中與人尸5KW基因進行同源性檢測，結(jié)果同源性達90%，從而證實了通過上述實驗已獲得豬,5UV7基因的mRNA全長序列。獲得豬的FSCN1基因的mRNA全長序列之后，利用開放閱讀框查找工具ORFFinder(http:〃www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找該基因的開放閱讀框，并推導(dǎo)出其蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:l)。實施例2、豬/^07基因的全基因組DNA序列的獲得(1)引物設(shè)計與豬/^GV7基因同源的人F5T7W基因組DNA(GenBank收錄號NC—000007.12)長約13.83kb，由5個外顯子，4個內(nèi)含子組成，其中第一內(nèi)含子為9488bp，第二內(nèi)含子82bp，第三內(nèi)含子245bp，第四內(nèi)含子1241bp。將豬的該基因cDNA全長序列與其進行比對，發(fā)現(xiàn)豬的該基因也具有5個外顯子，于是根據(jù)序列表中SEQIDN0:2的cDNA序列設(shè)計4對引物FG1F/FG1R-FG4F/FG4R，擴增豬的全基因組序列。其引物序列如下表5./^07基因組DNA分離用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(2)反應(yīng)條件然后以豬的基因組DNA為模板，并根據(jù)人的該同源基因的第二內(nèi)含子長度(2.58kb)設(shè)計反應(yīng)程序，進行PCR擴增反應(yīng)體系2.0uL10XBuffer，1.6uLMgCl2(2.5mmol/L)，luLFormerprimer(10umol/L)，IpLReverseprimer(10iimol/U，0.4uLdNTPs(10勤1/U，0.2uLTaqase，luL腿模板，ddH20定容至20uL。PCR擴增程序95°C3min，30個循環(huán)(94°C30s，對應(yīng)引物的溫度延伸50s，72°C3min)，最后在72°C延伸3min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(3)所獲得的效果所得序列進行拼接，最后得到一個長約9043bp的DNA片段(序列表中SEQID:3)，即為FSCN1基因的基因組DNA，其中第一內(nèi)含子長5731bp(序列表中SEQID:3中的921bp-6651bp處)，第二內(nèi)含子長102bp(序列表中SEQID:3中的6809bp-6910bp處)，第三內(nèi)含子長248bp(序列表中SEQID:3中的7033bp-7280bp處)，第四內(nèi)含子長328bp(序列表中SEQID:3中的7449bp-7776bp處)。實施例3、豬FSCNl基因物理定位-(1)用于豬FSCNl基因物理定位的引物序列FMF5'-AGCCTAGCTGTACCCATGAGTGG-3'FMR5'-TGAGATGCGTGGTGGACACTAAC-3'該引物擴增片段長度為358bp，是SEQIDNO:2的5'端第2241-2598位的核苷酸片段。(2)用于物理定位的實驗材料物理定位所用的材料包括①用于染色體區(qū)域定位的豬x嚙齒類體細胞雜種板(PigXrodentsomaticcellhybridpanel,SCHP)，包括27個體細胞雜種細胞系，119號是豬x倉鼠體細胞雜種細胞系，2027號是豬x小鼠體細胞雜種細胞系。②用于染色體精確定位的豬輻射雜種板(INRA-Minnesotaporcineradiationhybridpanel,IMpRH)。兩套體細胞雜種板的制備方法見參考文獻(Yerle等，Asomaticcellhybridpanelforpigregionalgenemappingcharacterizedbymolecularcytogenetics.CytogenetCellGenet.1996,73:194-202;Yerle等，Constructionofawhole-genomeradiationhybridpanelforhigh-resolutiongenemappinginpigs.CytogenetCellGenet.1998，82:182-188)。IMpRH使用的輻射劑量是7，000-rad。IMpRH包括118個豬x倉鼠輻射雜種細胞系，以及倉鼠和豬基因組DNA陽性對照，用757個標(biāo)記的鑒定結(jié)果表明IMpRH中的平均標(biāo)記存留率為29:3%，包含有128個連鎖群，覆蓋了18對常染色體及X染色體，用于估計標(biāo)記間距離的kb/cR比值是70kb/cR(lRay=100cR)，理論分辨率是145kb。(3)PCR分型條件在IMpRH中進行擴增的PCR反應(yīng)總體積為10uL，其中模板DNA為20ng，含1Xbuffer(Promega)，dNTP終濃度為150umol/L，引物終濃度為0.3umol/L，0.5Urs(7DNA聚合酶(Takara)。PCR擴增程序是:94°C4min，循環(huán)35次94°C30sec，62.5。C退火30s;然后72。C2(T30sec，最后72。C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物均用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(4)豬^Sm基因的定位效果分型結(jié)果000010000001100001100000000100000000100101000100100000010000000110010000001001010000001100000000010101001001011011100(其中0和1分別表述擴增結(jié)果為陰性和陽性)將以上分型數(shù)據(jù)輸入IMpRH數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析服務(wù)器(http:〃www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/RH/IMpRH.htmL/),用腿P3.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析結(jié)果，兩點分析結(jié)果顯示，尸5"07基因與豬染色體SSC3號上的己有的標(biāo)記SSC10E12緊密連鎖，L0D值為8.03，RH圖距是0.52Ray。實施例4、豬7^07基因的基因組咖A的三個位點的單核苷酸多態(tài)性檢測檢測豬/^GW基因中如下三個位點的單核苷酸多態(tài)性SEQIDNO:3中自5'末端起第6840位核苷酸(記作位點684(T)，SEQIDNO:3中自5'末端起第7365位核苷酸(記作位點7365^)，SEQIDNO:3中自5'末端起第8462位核苷酸(記作位點8462A";其中位點684(T利用船el-RFLP進行分析，位點7365^利用SSCP方法進行分析，位點8462^通過5feal-RFLP進行分析。1、實驗材料檢測表6中所述9個豬群的豬尸5"OW基因的基因組DNA的單核苷酸多態(tài)性。表6、SNPs檢測的群體和樣品數(shù)品種組合樣品數(shù)類型來源地五指山豬40近交系小型豬中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所貴州香豬40近交系小型豬貴州市畜禽良種場巴馬香豬47近交系小型豬廣西大學(xué)巴馬香豬近交繁育中心<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、實驗步驟如下提取各豬的基因組DNA，-2(TC保存?zhèn)溆?。一、RFLP檢測位點684(T的單核苷酸多態(tài)性檢測1、測序檢測6840"T位點的單核苷酸突變類型以豬的基因組DNA為模板，用引物對FS1F/FS1R進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序，測得產(chǎn)物序列為SEQIDNO:3中自5'末端起第6682-7122bp位核苷酸(即SEQIDNO:4)。擴增片段長度441bp，位于基因/^(3V/的第二內(nèi)含子中。FS1F5'-AGACCGACCAGGAGACTTT-3'(SEQIDN0:5)FS1R5'-GAGCAAACTTCTGGTAGGG-3'(SEQIDN0:6)序列分析結(jié)果表明在這441bp的DNA片段中，在SEQIDNO:4中自5'末端起第159bp(即SEQIDNO:3中自5'末端起第6840bp)處存在C-T的突變。當(dāng)159bp處的核苷酸為C時，存在1個他el酶切位點(gccIggc)。當(dāng)159bp處為T時，該個體的基因型記作TT，441bp產(chǎn)物被船el酶切后，只有441bp—個片段；當(dāng)159處為C時，該個體的基因型記作CC，441bp產(chǎn)物被vVael酶切后，有159bp和282bp兩個片段；當(dāng)159處為C和T時，該個體的基因型記作CT，441bp產(chǎn)物被船el酶切后，有如下三個大小的片段441bp、159bp和282bp。2、批量檢測9個豬群的豬的單核苷酸多態(tài)性用PCR-RFLP(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性內(nèi)切酶多型性)進行檢測。以表6中各豬的基因組DNA為模板，以上述引物對FS1F/FS1R進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系模板DNA50ng，lXbuffer，75umol/L的dNTP，0.3umol/L的引物，1.5mmol/L的Mg2+，1.0UTaqDNA聚合酶，總體積為20uL。PCR擴增程序為95。C預(yù)變性5min，然后94。C變性30s，61。C退火30s，72。C延伸，共35個循環(huán)，最后72。C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下拍照。PCR產(chǎn)物于4"C保存。PCR產(chǎn)物分別用核酸內(nèi)切酶NaeI酶切，反應(yīng)體積是10uL，其中l(wèi)XbufferluL，PCR產(chǎn)物3-5uL，限制性內(nèi)切酶O.5nL(5.0U)，用ddH20補足10uL，將樣品混勻后離心，37T:溫育4h。酶切完畢后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)照像，記錄每個豬的基因型并統(tǒng)計基因頻率。三種基因型的PCR產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果如圖2所示。檢測結(jié)果如表7所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在9個不同豬品種共339個DNA樣品中分析了多態(tài)位點6840e/T，如表7所示，表明，該SNP位點在三種小型豬(巴馬小型豬、五指山小型豬、貴州香豬)中以偏T型存在。而在其它幾個豬品種中C和T基因型的分布較為均勻。二、7365^利用SSCP方法進行分析1、檢測7365A/e的單核苷酸突變類型以豬的基因組DNA為模板，用引物對FS2F/FS2R進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序，測得產(chǎn)物序列為SEQIDNO:3中自5'末端起第7347-7452bp位核苷酸。擴增片段長度106bp，位于基因/^GW的第四外顯子中。SSCP引物的DNA序列FS2F5'-ATCAACCGCCCCATCAT-3'FS2R5'-GCTGGAAGACGTCGTAGTT-3'序列分析結(jié)果表明在這106bp的DNA片段中，在SEQIDNO:3中自5'末端起第7365bp處存在A-G的突變。當(dāng)7365bp處為A時，該個體的基因型記作AA，106bp產(chǎn)物進行SSCP分析后，只有l(wèi)個106bp片段；當(dāng)7365bp處為G時，該個體的基因型記作GG，106bp產(chǎn)物進行SSCP分析后，存在1個單鏈構(gòu)像多態(tài)，有56bp和50bp兩個片段；當(dāng)7365bp處為A和G時，該個體的基因型記作AG，106bp產(chǎn)物進行SSCP分析后，產(chǎn)生三個片斷(106bp，56bp和50bp)。2、用PCR-SSCP(PCR-single-strandconformationpolymorphism,單鏈構(gòu)象多態(tài)性)方法批量分析以表6中各豬的基因組DNA為模板，以引物對FS2F/FS2R進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系及PCR擴增程序與實驗一中所述相同。電泳前準(zhǔn)備洗滌劑清洗玻璃板，自來水反復(fù)沖去殘余的洗滌劑，再用雙蒸水沖洗玻璃板3次，自然干燥。在兩塊玻璃內(nèi)的兩側(cè)和底部夾上墊條，用固定夾夾緊兩塊玻璃，并用4%瓊脂糖溶膠封邊。配制濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠:先加15mL30%聚丙烯酰胺溶液和14.782mL去離子水，輕輕搖勻混合液，除去氣泡，馬上補加15uLTEMED和210uL過硫酸銨，快速混勻。用10ml玻璃吸管吸取膠液，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿玻璃板頂部。立即插入相應(yīng)的點樣梳(小心勿使梳齒下帶進氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，留約2mm梳齒于玻璃板上端，以免下一步操作中把凝膠孔處的凝膠拔斷)。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以需要補加少許膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合lh。將玻璃板底部封口墊條掀去，將帶凝膠玻璃板放入電泳槽，固定玻璃板兩側(cè)。在上下電泳槽內(nèi)灌入1XTBE電泳緩沖液。小心取出點樣梳，并用緩沖液反復(fù)沖洗點樣孔，以除去可能殘留的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。PCR產(chǎn)物變性將2ulPCR產(chǎn)物與18ul點樣液混勻。樣品上樣前于IO(TC變性10min，立即冰浴，10min后，將變性樣品上樣。電泳電泳槽接上電極，開啟電源，設(shè)置電壓130V，810小時后電泳結(jié)束。染色電泳結(jié)束后，倒棄電泳緩沖液，取下玻璃板，在玻璃板上給凝膠作順序標(biāo)記。快速用ddH20沖洗凝膠2次，將凝膠置于20%乙醇中15min。用ddH20沖洗凝膠30s，將凝膠置于P/q硝酸溶液中3min。快速用ddH20沖洗凝膠2次，將凝膠放入200mL顯影液中，待凝膠上條帶清晰后，將顯影液倒去，用4%乙酸溶液終止顯色。鑒定以測序結(jié)果的多態(tài)類型為分型對照的標(biāo)準(zhǔn)樣，根據(jù)凝膠顯色結(jié)果判斷每一個樣品SNP的多態(tài)類型，并作記錄。結(jié)果如表8所示。表8、FSCN1SNP(7365A/e)多態(tài)性在9個豬群中的分布品種樣本數(shù)基因型等位基因頻率AAA/GGGAG巴馬香豬49490010五指山豬39390010貴州香豬413600.880.12萊蕪豬4313250.270.73通城豬46251830.740.26長白豬20200010大白豬26260010長大通52391300.880.12大長通4743400.960.04在9個不同豬品種共352個DNA樣品中分析多態(tài)位點7365，表8結(jié)果表明，SNP位點A/G，在兩種小型豬(巴馬小型豬、五指山小型豬)和兩種國外豬品種(大白、長白)中以絕對A型存在，而且在貴州香豬，通城豬和三元雜交豬(大長通、長大通)中該SNP位點以A型為主。只有在萊芫豬中則該SNP位點以G型為主。三、8462A/G通過5kal-RFLP進行分析1、檢測位點8462^的單核苷酸突變類型以豬的基因組DNA為模板，用引物對FS3F/FS3R進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序，測得產(chǎn)物序列為SEQIDNO:3中自5，末端起第8355-8639bp位核苷酸。擴增片段長度285bp，位于基因,6UW的3'UTR中。FS3F5'-GGCGGGGTGTGTAACTG-3'FS3R5'-CCCTCCAGCAACAACATT-3'序列分析結(jié)果表明在這285bp的DNA片段中，在序列表SEQIDNO:3中自5'末端起第8462bp處存在A-G的突變。當(dāng)?shù)?462bp處的核苷酸為G時，存在1個酶切位點(CCC4GGG)。當(dāng)8462bp處為A時，該個體的基因型記作AA，285bp產(chǎn)物進行酶切電泳后，只有l(wèi)個285bp片段；當(dāng)8462bp處為G時，該個體的基因型記作GG，285bp產(chǎn)物進行酶切電泳后，存在144bp和141bp兩個片段；當(dāng)8462bp處為A和G時，該個體的基因型記作AG，285bp產(chǎn)物進行酶切電泳后，有285bp、144bp、和141bp三個片段。2、用PCR-RFLP(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性內(nèi)切酶多型性)進行批量檢測以表6中各豬的基因組DNA為模板，以上述引物對FS3F/FS3R進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系及PCR擴增程序同實驗一種所述相同。PCR產(chǎn)物用核酸內(nèi)切酶Smal酶切，反應(yīng)體積是10uL，其中l(wèi)XbufferluL，PCR產(chǎn)物35uL，限制性內(nèi)切酶0.5uL(5.0U)，用ddH20補足10uL，將樣品混勻后離心，37。C溫育4h。酶切完畢后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)照像，記錄每個豬的基因型并統(tǒng)計基因頻率。檢測結(jié)果如表9所示。表9、尸5UV7SNP(8462AA:)多態(tài)性在9個豬群中的分布品種樣本數(shù)基因型等位基因頻率GGG/AAAGA巴馬香豬47470010五指山豬40400010貴州香豬40400010萊蕪豬3735200.970.03通城豬36122220.640.36長白豬16830.560.44大白豬191600.920.08長大通46232300.750.25大長通39211710.750.25在9個不同豬品種共313個DNA樣品中分析了多態(tài)位點8462AA;，表9表明該SNP位點在三種小型豬(巴馬小型豬、五指山小型豬、貴州香豬)和萊蕪豬中以絕對G型存在，而且在通城豬、長白豬和三元雜交豬(大長通、長大通)中該SNP位點以G型為主。只有在大白豬中該SNP位點A型和G型分布較為均勻。實施例5、豬,5TyW基因的單核苷酸多態(tài)性與經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析對三個豬群(長大通、大長通和通城豬，共165頭份)的三個位點分別進行了基因型與生長性狀、胴體性狀以及肉質(zhì)性狀間的關(guān)聯(lián)分析。三個位點如下FSCN1基因第二個內(nèi)含子中的SNP位點(6840e/T)、第四個外顯子中的SNP位點(7365A/(;)和3'UTR中的SNP位點(8462A/e)。關(guān)聯(lián)分析是應(yīng)用SAS8.0軟件中的廣義線性模型(GeneralLinearModel)程序來完成的。20首先建立如下的分析模型以消除性別、組合及批次對表型值的影響-Yijk=u+BATCHi+SEXj+COMBINATIONk+(BS)ij+(BC)ik+(SC)jk+eijkl(模型I)其中，Yijk是性狀觀察值，u為總體均數(shù)，BATCHi為批次效應(yīng)，SEXj為性別效應(yīng)，C0MBINATI0Nk為組合的效應(yīng)，(BS)ij為批次和性別的互作效應(yīng)，(BC)ik為批次和組合的互作效應(yīng)，(SC)jk為性別和組合的互作效應(yīng)，eijk為隨機誤差，假定服從N(0，o2)分布。應(yīng)用這個模型對于所分析的每個性狀都獲得了一個新的性狀值，即標(biāo)準(zhǔn)化的殘差值。然后將所獲得殘差值作為新的性狀值，再建立如下的分析模型-Yij=u+GENOTYPEi+eij(模型II)Yij是新的性狀值，n是新的性狀值的總體均值，GENOTYPEi為基因型效應(yīng)，eij為隨機誤差，假定服從N(0，o2)分布。應(yīng)用上述模型II，根據(jù)最小二乘分析法分析基因型的效應(yīng)，同時進行基因型間的兩兩比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，684(fT突變位點與豬的生長速度顯著相關(guān)，53個個體為CC基因型，48個個體為TT基因型、64個個體為CT基因型，CC、TT基因型與CT基因型的豬生長速度差異極顯著(P〈0.0005)?；蛐烷g性狀的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果總結(jié)于表10。而位點7365^、8462^的突變與豬生長速度相關(guān)性狀并沒有顯著的相關(guān)性。AGE(ageatmarketweight):達上市體重日齡ADG1(averagedailygainfrombirthtomarket):出生至上市期間平均日增重ADG2(averagedailygainduringthetrialperiod):測定期間(30-90kg)平均日增重。表10、FSCN16840e/T與生長性狀間的關(guān)聯(lián)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>上述結(jié)果表明，基因型為CC或TT個體的達上市體重日齡、日增重與基因型為CT的個體間存在極顯著差異(PO.0005)，說明基因型為CC或TT的個體的肌肉生長速度要高于基因型為CT的個體。序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所〈120〉一種輔助檢測豬生長速度的方法〈160〉10<210〉1<211>493<212〉PRT<213〉豬(5k釘ofs)<400〉1MetThrValValGluHis65GluAspGlyAlaTyr145AsplieHisAsnAsnGin50LeuHisAspGlyGlu130SerGluThrArgAlaCysAla35ProGlyGluGlyThr115LysLeulieLeuPhe195AsnSer20SerProArgValArg100GluTrpAlaSerAla180LeuGly5AsnAlaAspTyrPro85TrpAspSerArgVal165PheArgThrLysSerGluLeu70AspSerArgValLys150AspGinHisAlaTyrSerAla55AlaAlaLeuLeuHis135ArgArgAspAspGluLeuLeu40GlyAlaAspGinSer120lieTyrAspGinGly200AlaThr25LysGlyAspCysSer105CysAlaAlaValArg185ArgLeu10AlaLysAlaLysArg90GluPheMetHisPro170TyrLeuGinlieGinGluThrPheLysGinlie45AlaMetCys60AspGlyAsn75PheLeulieAlaHisArgAlaGinThr125HisProGin140LeuSerAla155TrpGlyValSerLeuGinValGluGin205PheGlyLeu15GlyPheLys30TrpThrLeuLeuArgSerValThrCys80ValAlaHis95ArgTyrPhe110ValSerProValAsnlieArgProAla160AspSerLeu175ThrAlaAsp190ProGluPro22LysAlaGluGinValSerThrAsp290CysAla305GlyGlyAsplieLysPheThrAla370lielie385ThrGlyGluPheTrpMetValAsp450ValGly465CysAlaGlyGluGlySerThr275GinPheValGluVal355GlyValThrArgVal435PheGlyAspTyrGlyLysCys260ArgGluArgGinTrp340ThrAspPheLeuAsp420GlyPheHisAlaThrArgAla245AlaGinThrThrSer325ArgAlaSerArgAsp405GlyThrPheTyrlie485LeuTyr230ThrGinGlyPheHis310ThrAspLysGluGly390AlaAlaAspGluLeu470AspGlu215LeuLysValMetGin295SerAlaArgLysLeu375GluAsnTyrSerPhe455LysProPheAlaValValAsp280LeuGlySerArgAsn360PheHisArgAsnSer440LeuGlyAlaArgProGlyLeu265LeuGluLysSerlie345GlyLeuGlySerlie425ValAspAspThrSerSerLys250GinSerlieTyrLys330lieGinMetPheAsn410LysThr丁yrHisLeu490GlyGly235AspAlaAlaAspTrp315AspLeuLeuLyslie395TyrAspSerAsnAla475TrpLys220ProGluAlaAsnGly300ThrAlaArgAlaLeu380GlyAspSerSerLys460GlyValAlaPheArgSerGlyThrLeu240LeuPheAlaLeu255AsnGluArgAsn270GinAspGluGlu285AspThrLysLysLeuThrAlaSer320SerCysTyrPhe335AlaSerAsnGly350AlaSerValGlu365lieAsnArgProCysArgLysVal400ValPheGinLeu415ThrGlyLysTyr430SerAspThrPro445ValAlalieLysValLeuLysAla480GluTyr<210〉2〈211>2721〈212〉RNA<213>豬"usscrofa)〈400>2uuuuuguagagcgcugcugagggugcgcgcacggccgcggcaguagaacaaaggagcagg60gcgccgccgcagggacccgccaccgaccucccgggccgcgccggggccuccagcccgccg120ccaccaugaccgccaacggcacggccgaggcccuccagauccaguucggccucaucaauu180gcagcaacaaguaccugacggccgagacguucggguucaaggugaacgcuucggccagca240gccugaagaagaagcagaucuggacgcuggagcagccgcccgacgaggcgggcggugcag300ccaugugccugcgcagccaccugggccguuaccuggcggcggacaaggauggcaacguga360ccugcgaacaugaggugcccgacgccgacugccgcuuucucaucguggcgcacgacgscg420gccgcuggucacugcaguccgaggcgcaccggcgcuacuuuggcggcaccgaggaccgcc480ugucgugcuucgcucagaccgugucaccggccgagaaguggagcgugcscaucgccaugc540acccgcaggucaacaucuacagccuggcccgcaagcgcuacgcgcaccugagcgcccggc600ccgccgacgagaucucaguggaccgcgacgugcccuggggcgucgacucgcucaucacgc660uggccuuccaggaccagcgcuacagccugcagacggccgaccaccgcuuccugcgccacg720acgggcgccuaguggagcaaccugagcccgccacaggcuacacucucgaguuccgcuccg780gcaagguggccuuccgcgacugcgagggccgcuaccuggcgccgucggggcccagcggca840cgcucaaggcgggcaaggccaccaaggugggcaaggacgagcucuucgcccuggagcaga900gcugcgcccaagucgugcugcaggcugccaacgagaggaacguguccacgcgccagggua960uggaccugucagccaaucaggacgaagagaccgaccaggagacuuuccagcuggagaucg1020acggcgacaccaaaaagugugccuuccgcacccacucgggcaaguacuggacgcugacgg1080ccagcgggggcgugcaguccacugccuccagcaaggaugccagcugcuacuuugacaucg1140aguggcgugaucggaggaucauacugcgugccuccaacggcaaguuugugacggccaaga1200agaauggccagcuggcugccucgguggagacagcaggggacucggagcucuuccucauga1260agcucaucaaccgccccaucaucguguuccgcggcgaacacggcuucsucggcugccgca1320aggucacaggcacccuggacgcgaaucgcuccaacuacgacgucuuccagcuggaguuca1380gggacggugccuacaacaucaaagacuccacgggcaaguacuggauggugggcaccgacu1440ccuccgucaccagcagcagcgacacccccguggacuucuucuucgaguuccuugacuaca1500acaaaguggccaucaaggugggcggccacuaccugaagggggaccacgcggggguccuga1560aggccugugccgaugccaucgacccugccacgcugugggaguacuaggcccgcugcccgu1620gucccccuccccacccugcccagcccccucccgcucacucuucucuccaggggggcuccg1680ccgcagguggcaagccccucgccuuuccaacuggaaacccagagaaaacggugcccucac1740cuguuccccgugcggccuccccugagcaggucaguggcuguggccugguccucggaggga1800uuuccgaucccucugcccuuucuucucugcccugggcguggcuggaaccucuuucuucug1860accucagacgacucugagccuuaucucccugaagaggccaaggagaaucacggggcuggg1920agccuucccaagccccugagcgcgcggcgggguguguaacuggaaucucuguccccuccu1980gagccuccccucccccgagccugccggugcccccccagagccccgucccugcaucaggag2040gaaagccgggcaggggagagcuggaacagauguguccccuccugcccccgggugaggggc2100ccgcccgcugcgcaccccacugggcuccuggggcccugcuccugucuccuuucuuucacc2160cuggccugacuggaaacagaaaaugaccgaaucaguamruuuuucgaaaugaaauguugu2220ugcuggaggggccccaggcaagccuagcuguacccaugaguggucuucagggggucuugg2280gggguccugagaaggcaugccugggcccaacggccucugcccacuaggguuggggcaggc2340cgggugccucccugaguccagaaccugcccccaccuuccccugggccccggccccaggcc2400uguguuccccuggugaugcugggccugucaccgccucagccggagccccggugugauugg2460ugcuccucuucugacuggscuccuuagucucggagggaugaagcugggcauccgccucag2520ccgggagccccguggaagcucccagccccaccccugccagcuccccucacuucugguuag2580uguccaccacgcaucucacucugggugucuuggucuuuuauuuuuuguaagugucauuug2640uauaaucucaaacgcccaugauaguagcuucagacuggaacgagcaaaauaaaucgugca2700sauccgaaassaaasasssss2721〈210>3〈211〉9043〈212〉DNA〈213〉豬(51〃51sor。/a)〈221>mis—feature〈222〉6840〈223〉n=t或c24<400>3cggcagtagsgcgccggggcgatccagttcgcccgacgsgggcggacssgtctcatcgtgctttggcggcgtggsgcgtgctacgcgcacgggcgtcgaccgsccaccgcctscactctcggcgccgtcgcgagctcttcgascgtgtccaaagcgcaccccatcccgaggggccgtgcgcccccaictcccgccctccgagcggscccagcccgcccccggggcgtgcccctgcagggtggggsggggttcctcctcccgcctcgscaggsgatgcggcgcctcccccgccggcctccctgcaccctgtcggagcctccgagggaacccatgccgcggcccccccctttctcgtcgttggctcctctgssgggaggccccttgactccsggtctcctcttaacatggagcttccggatccgtgtcsagcaggtgcctttcgggtsga3C3gcagsasgccccsgcagggctgggctgtgtagtccttggggcctgggcsgaagctgstgggtttgaagggggttctgattggggcgtctgtccgacacatgggatgtgacgctgaagctgctgtgctctgttagggtcccasgtggtgtaagggccacttgccacaccctgcccagctgtgacgtgtaagggtgacgtgsacaaaggagcctccagcccgggcctcgtcagcttcggccagcgggcggtggstggcs3cggcgcacgscgsccgaggscccacatcgccactgagcgccctcgctcatcattcctgcgccgagttccgctgggcccsgcggccctggagcacgcgccaggccscccccgtcgacgcccggctccggccccgccgtggagtsccccccgcctcttggggagtcsgcgggcccagctcccttcscttccsccggcttctgcgcgtctgccccgccctccctcgggtgggggscsccgcgtcgcctcgcgcccctgcsicccgccgcgagccggtCCCCC5l3g3tcccgcgggcctttcttagacgsacaaggctgggaicgttgccttctgccteigccagttggsacsggctctcccsgtctcactctagcgagttaattcttgaaggcctggggggctgcsggcsgtggggctcacaggactcccagcstcttgccsggsaggacgccctctcgagggagcttggctgactcccsgsggccatgttgggsssatc3tcctgsccsgcccgctcggsggsggctgggagctgaggctgtgaccsgggc33sgccgccctgggggagttctcctgsgggattcgsggccscagstsgggcgccgcccgccsccat3ttgcsgta3csgccatgtgtgacctgcgsacggccgctggcctgtcgtgtgcscccgcsggcccgccgscgctggccttscg3cgggcgccggcsaggtgcscgctcaaagsgctgcgcgtgsgtggggccccscsgcccgagcccccggsggasgcggtgggactccccagtccgggtgggscgccccttcsgctcagtgggcagccttcctggccccggsagggggtgcgctcgagggccccctttgggggstgggccccccaggcccgggctccggcgcscgtctcgsg3ccct33tccctcctggctggccatttttcttccccsagtcttttccggctcsggctgggctctgccccactgtcactstctggactcacsgt3ct3tgsgacaggcggtgcagtgtggtccagcsa3cctgscctgC3csgggcstgsggsgcsgcscgttgggttctctggggssctttctsgtsgccggssscttgggagccaggcttcttccttttggscagggccsgccaggaggcctgcactctggcctcsgtgscaaggccsc3ggtgggtsctcatgcttC3CC3CtttctccatgctctttgggcaggS3tggtcsgggcttctaggccgcagggaccgaccgccaaccaagtacctgcctgcgcagcacatgaggtggtcactgcsgcttcgctcagggtcaacstccgeigatctcaccaggaccagcctsgtggagggccttccgcggcgggcasgccaagtcgtgeicgccgcccctcccgcccttctgggcgcgcctttccctgttaggccgcgccctccctcccttgtccgttcgggcggaggcttcgccggcgctgggcctttcgccccgsggccgcggcctttcctgctcggtttccgcgggcagtgcccctsacggcgtggccggccgcggccsgcsccct33C33ttggccctcctaccaggcggcttcgttcccagcggctgggaatsggsgggggcsgccctgatgccggtgggggcasgaggcctgatctcactgggggcttgtscattgtgaggttctcatcaatggatgtggcsggcctggggct3sgcctgctggstsggsgccggtgggstggcctgcgtggcaaggaggaggaggctgggcggtttccccatccsctsgagggscatggctcccsttggagccccccctggc3ggasgggc3acatttcaggtsgtggcaagccccctctctcgccsccgscggcacggccgacggccgagaatctggacgccacctgggcccccgacgccgtccgaggcgcaccgtgtcact3csgcctgggtggaccgcgcgctacagcccaacctgsgcgactgcgagggccsccsaggctgcaggctgccgcctctcgtctcgcccgcgggccsccccccttgggtgcttaggctccacgcgcagstcctcgtgccccgsggggtcgcggataggggaCCCC3CCCCCgtctgccctttgtgsigccggtctctgcagatccctcctgctccgssgtcgcgcggctggccgctctgctccgggsggccctgcssctcgagcctgcgcgccttccttcggaggggcctttctggatgggattttgtgcttsccagcctcgggsctccccaacgscgggc3agstgsgccsgtcccaggttcaaggtagcaagagtccgggggtagstgggcsggcatgctgagcsggtggggttttggcaggggtgtcstaggtgttggcaccctggcctaggatgacctasggaggcggstcctgggctgcccgggtggctgt33sgggctgagtcggctgtctgtcccgggcagggctcccgcctgccatcacsgcccggtcaggctgctgtgggaacsactgscgggttsactgasgttcccgggccaggccctccacgttcgggtttggagcagccgttacctggcactgccgcttsccggcgctacggccgagsscccgcssgcgacgtgccctgtgcagacggcccgccacsgggccgctaccttgggcaaggaggctgtgcacggcgcgtctgsccccgccgcccccaagtggccgggtatctCCCtCCt3CCctccggcgcagctttgstcttctctcggccccccccggccggggcgggctcgssgsccccccccsggsggggctcgccsgtgcgggtgcccctsccctcgtgcgtcctctC3gcsgtgaggcgtcctcgcggggctcttgttccstggtcgggtttgccc3g3actgggtggggctcsggctsttcagcacgtgggcatgcaccccagagcgc3tcsggtgcgggssggs3ctgg3gcsgccatgcttgctcctggccctggcacggcgaggtgtgattctcstctgtgacggatttgggstggggsgggcsgctgtgctttctggctggggtgctccctctcgcccaggcaccgggaagsggtcctgggggsggtgggcctgggctctaccttgcgtgtggctttgcsgsgcttgtgtscggggggtgg60120180240300360420480540600660720780謂900960102010801140120012601320138014401500156016201680174018001860192019802040210021602220228023402400246025202580264027002760282028802940300030603120318032403300336034203480354036003660372037803840390039604020408025ggtgggggtggagagatctttactgacaagccaggggaatttgggaactgctagggctca4140七ggggtggggaccatagggtgcgctcgcagggatggggggcacccccttggagccactgc4200agaaggtggcttagsggctggsgacagggacsgctgtgacsgagggggscaggcgggggc4260cggtgtctcacgagggctctctggagggggatgtggctctgggctctgctgagcccccac4320gtctcctgccgcccccacgtctcctgccttccccaaggctcctgggggcctgtgactcag4380gttttctctgctgctgttgatgaaaagaaaaatcctgaagaaaaccctgttcccatagta4440acccggctctaattagagactctgaagccaagtggggcctttcccgtctgggcagggcct4500tggsgcctggcgggacccccgccccctgccstggggcaggggsctcgcctccsscccctt4560cctactggggacggaaggcggtgtctgcttggcactaaatcctttccgtctcctggcaga4620atggagagatggggcccttttgatgataggcagagagggaaactgagggctggggtgggt4680gcctggccccggctttgggtaccttgctggctgctctaggcctttttctcaggsctggac4740scagtctggctggggtctgggtgactgsgcagatggtggtggccctgtggccctgggcag4800gtacctctggggtggagcctccctttgtgtggacctgctggaggagtcgtctcttggccg4860ggcctcgctgcccccggcgaaggctgagctctcaggaaccggtcccattgagaaggagcc4920cccggatttcctgcatttgtctccggccggctggggagcgccttgtttacgtgcagggct4980gtgttatctcaggtgctggsggttcctctgctctcctgcacctggacccctttctttcct5040gctgccgaggtgagccccggggcgtctcctcttgtccgttctctgcttcccctcagctgg5100cccagcgtgctgggcsgggggtgccatgcggtggctctgcsgcagcgggggtggtcsgcc5160acaggttgtgctcctgtgcgtggctttgggatggccctcctccggctgctcctcgcctgg5220tgcttcagtccggcctgggggtggatccggctcacccccgggccctgagcagtcagcagg5280ggctgccctggggctcagggggcccagtgggcctggagcgtggagcccagcggttctgag5340ggtctggttcsggacccagggtgscccgsggccatggccagcsgtctgtggagaggaggg5400agggtgggggcaggaggcccgagtctgcccatctctcctcctgagagcccctggacgcct5460tgttttctctctggtgaccttggccaaggacaccagcactctgcctcsgttgcctttgcg5520aggtgggggtgggactgacatggggacacgagacccggttagcatggggctgacaccctt5580ccgggcctctgggtggtggttagagaactgaggctgggggctccgcctgccccgcgcagc5640ccccccs3cccgcctcstctcstctgagggggtgccggccgcccaccscsgggcccsgct5700ccacaaagtcctcagggcccaatgactcaccctgctgctgaggctcttaggatccacsgc5760gcttggggaatgtgaattttttgtggggaatcaatgatcccgcttccgggttttagctgg5820aggagtccacaggaccacgtggctgcagctggtgggagcaaaaccccagaagccacccct5880atcacgtcagatgactcggggacacgggaacatgtaaaggtgacaggcagatcatttgtg5940agttgaggtgtgcagcatgtgtgcacttgaaggtcaagaaaacgcacgtgcgaagggcag6000gaaacacggcttggaggatgtggtcacggccgtggtggtggcggcggtggcgctctgggg6060cgcgctgggcgcggagggggatgcagtttgacttgcatgcttttacgagttgtcagaatg6120tcccgacgggagtgtgtgctgtcacatcctgcactttttgggtttscggatacagagaag6180caggaaggatacactgaatacgccgccacaccggctccctgtctctctcttccctgtttt6240tggttgtacttagagcaaatccgtgacttcaggacagttcatctcaaaacgtttgtctgt6300acatctaaaaataatcagggtcgtgttcttacctaatgacaacacgagtgataatgattg6360gtcctgcctcgctcatcctgggccatgtaaagatgctcccaagtggctctcgaatgtctt6420tttgcatttggtttgctggaaggtattcattgcttctgtaaccagagaaagtgatgtgta6480aatgcccctccggcctcggtccttgacggaccctcctgggatcctgggttctgaccgcgg6540ccgaggggtctgagctttgccgtggggtcttggcagccccctgccacattggtgtgtgag6600ggcaggggtgtgggggtccccgtactagctggagcctctctctcgctgcaggtatggacc6660tgtcsgccsatcaggacgasgagsccgaccsggagactttccsgctggsgstcgacggcg6720acaccaaaaagtgtgccttccgcscccactcgggcasgtsctggacgctgscggccagcg6780ggggcgtgcagtccactgcctccagcaagtgagtgcccgctgcccttgcgcgcgctggcn6840ggcccttcctggagacrggggcctggggtggtccggggtggcccctcctgaccctgtccc6900gccccgccagggatgccagctgctactttgacatcgagtggcgtgatcggaggatcatac6960tgcgtgcctccaacggcaagtttgtgacggccaagaagaatggccagctggctgcctcgg7020tggagscagcaggtsgccscctgtgggcscaccccaagtccccgttccccggagggtctg7080cctatgccatggtcacttaccaaccctsccagsagtytgctctrtgctgggcatcgcccc7140agactggcaccaccccgcctcgcccgagggctggcatgcagagtgaccccaggctcctgc7200tgtccctctctg3gcc3c3ccctgagcgcggcactcccscccccgcgaggctcsctgccc7260cttcccscctccctggacsggggactcggsgctcttcctcstgasgctcstcssccgccc7320catcatcgtgttccgcggcgsacscggcttcstcggctgccgcssggtcscsggcsccct7380ggacgcgaatcgctccaactacgacgtcttccagctggagttcagggacggtgcctacaa7440catcaaaggcaggttctcctgtgggtggtgctgggtggggtcctctgggcccttggggcg7500caggaggcaaccccctgccccacttggccctggttggggggttcagcctggccaccttgt7560gcgatgacttgggccccacgtggcygccaggggctctcggcttggggaggagctccttcc7620cctctcgtctgtgcgggaggaagatggggttctggaaggtgggggccaggggacscatca7680cacctgagttatgggacccagactctggtgggggcctggcggggggcgcggtgcccacgg7740cagggcctgatggggtcccccscgcccccgctgcagsctccacgggcssgtsctggatgg7800tgggcaccgactcctccgtcaccagcagcagcgacacccccgtggacttcttcttcgagt7860tccttgactacaacaaagtggccatcaaggtgggcggccactacctgaagggggaccacg7920cgggggtcctgaaggcctgtgccgatgccatcgaccctgccacgctgtgggagtactagg7980cccgctgcccgtgtccccctccccaccctgcccagccccctcccgctcsctcttctctcc8040aggggggctccgccgcaggtggcaagcccctcgcctttccaactggaaacccagagaaaa8100cggtgccctcacctgttccccgtgcggcctcccctgagcaggtcagtggctgtggcctgg8160tcctcggagggatttccgatccctctgccctttcttctctgccctgggcgtggctggaac8220ctctttcttctgacctcagacgactctgagccttatctccctgaagaggccasggsgaat8280cacggggctgctgtcccctcctgcatcaggcgggtgagggCtttCtttC3atgaaatgttagggggtcttgttggggcagcggccccaggcggtgtgattcatccgcctcacttctggttasgtgtcattggagccttccctgagcctcc3gga33gccggcccgcccgcccctggcctggttgctggagggggggtcctgccgggtgcccctgtgttccggtgctcctcsgccgggsgc3gtgtcc3cctgtataatctcasgcccctgcctcccccgaggcsggggsgtgcgcacccc3Ctgg33scagggccccagggagaaggcsttccctgagtccctggtgstgttctgactggcccgtggssgscgc3tctcaagcgcgcggcgcctgccggtagctggaacasctgggctcccsi3gcctsgcgcctgggccccagaacctgcct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