專利名稱：一種培育耐旱植物的方法及其專用重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育耐旱植物的方法及其專用重組質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
干旱與水資源短缺已成為制約世界農(nóng)業(yè)和社會(huì)發(fā)展的重要因素，同時(shí)受溫室效 應(yīng)的影響，水資源短缺的問題將愈來愈突出。玉米是世界上三大糧食作物之一，也是重要 的飼料作物，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有相當(dāng)重要的地位。我國(guó)是世界上第二大玉米生產(chǎn)國(guó)， 也是最大的玉米消費(fèi)國(guó)。干旱是影響玉米產(chǎn)量的重要因素之一，也是限制我國(guó)玉米生產(chǎn) 發(fā)展和產(chǎn)量提高的第一要素(Hu R-F(胡瑞法)，Meng Erika C-H, Zhang S_H(張世煌)， Shi X-H(石曉華)· Prioritization for maize research anddevelopment in China. Sci Agric Sin (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué))，2004，37 (6) :781_787 (inChinese with English abstract))。 因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)玉米抗旱育種的研究越來越重視，然而由于玉米抗旱性狀屬于數(shù)量性狀，采 用傳統(tǒng)育種方法獲得優(yōu)良抗旱品種十分困難。禾_轉(zhuǎn)基因技術(shù)將具有優(yōu)良性狀的外源基因 導(dǎo)入作物中，培育出具有優(yōu)良性狀的作物新品種，為作物的抗逆育種開辟了一條新的途徑。植物的轉(zhuǎn)基因抗逆育種，主要有3個(gè)方面的問題一方面是目的基因的選擇，主 要包括功能抗逆基因和調(diào)控抗逆基因，轉(zhuǎn)錄因子由于能調(diào)控下游一系列抗逆基因的表達(dá)而 逐漸受到人們的重視；其次是啟動(dòng)子的選擇，由于抗逆基因的組成型表達(dá)會(huì)給正常生長(zhǎng)條 件下的植物帶來負(fù)面影響，而用脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)的影響很小 (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Improving plantdrought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor. Novartis Found Symp，2001，236 :176_186)，因此抗逆基因工程需要選擇逆境誘導(dǎo)表達(dá)的 啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)基因抗逆育種的另一重要方面是對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗逆性的評(píng)估，需要 從分子水平、生理水平和代謝水平上對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子抗逆 基因工程育種來說，逆境下其下游調(diào)控的抗逆基因表達(dá)水平的檢測(cè)也很重要。植物在非生物脅迫的脅迫下主要表達(dá)兩類基因編碼產(chǎn)物為直接保護(hù)植物免受 環(huán)境脅迫的功能蛋白類的基因及調(diào)控基因表達(dá)和脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因；第一類基因包 括LEA蛋白基因、抗凍蛋白基因、脯氨酸合成酶基因等；第二類基因包括各種激酶和轉(zhuǎn)錄 因子等(Kasuga M，Liu Q，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，ShinozakiK. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transferof a single stress inducible transcription factor. Nat Biotechnol，1999，17 :287_291)。轉(zhuǎn)錄因子因 為調(diào)控下游一系列抗逆基因的表達(dá)而逐漸受到重視，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子抗逆基因工程的研究 也大量展幵(Hsieh T H，Lee J T，Charng Y Y，ChanM T. Tomato plants ectopicaly expressing Arabidopsis CBFlshow enhancedresistance to water deficit stress. Plant Physiol，2002，130 :618_626) (Lee S C，Choi H W，Hwang I S，Choi D S，Hwang B K.Functional roles ofthe pepper pathogen-induced bZIP transcription factor， CAbZIPl， in enhancedresistance to pathogen infection and environmentalstresses. Planta, 2006, 224 1209-1225) (Dai X Y, Xu Y Y, Ma Q B, Xu W Y, Wang T, Xue Y B, ChongK. Overexpression of an R1R2R3MYB gene, 0sMYB3R_2, increases tolerance tofreezing, drought, and salt stress in transgenic Arabidopsis. Plant Physiol, 2007,143 1739-1751)(Gutha L R，Reddy A R.Rice DREBlB promoter showsdistinct stress-specific responses, and the overexpression of cDNA intobacco confers improved abiotic and biotic stress tolerance. Plant Mol Biol. 2008,68 :533_555)。CBF轉(zhuǎn)錄因子是一類受低溫或干旱誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，它們特異地與CRT/ DRE(C-repeat dehydrat ion-responsive element)DNA i周控元件結(jié)合，激 舌下訪字冷誘 導(dǎo)或脫水誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而提高植物的抗逆能力。CBF4轉(zhuǎn)錄因子是擬南芥中的 干旱應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，其在擬南芥中超表達(dá)可提高擬南芥的抗旱和抗凍能力(Haake V, Cook D, Ri echmann J L, Pineda 0, Thomashow M F, Zhang J Ζ.Transcription factor CBF4is a regulator of drought adaptation inArabidopsis. Plant Physiol, 2002，130 =639-648) 0 rd29A基因是擬南芥中受干旱、高鹽、低溫脅迫等誘導(dǎo)表達(dá)的基因 (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Characterization of the expression of a desiccation-responsive rd29geneof Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol Gen Genet, 1993, 236 :331_340)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育耐旱植物的方法及其專用重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒，是含有CBF4基因的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒中，CBF4基 因由擬南芥rd29A基因(擬南芥親水蛋白rd29A基因)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。所述重組質(zhì)粒可為在pSP72質(zhì)粒中插入如下DNA片段得到的重組質(zhì)粒在BamHI 和SacI酶切位點(diǎn)間插入擬南芥CBF4基因；在Hind III和Bam HI酶切位點(diǎn)間插入擬南芥 rd29A(RD29A)基因的啟動(dòng)子；在HindIIII位點(diǎn)插入DNA片段B ；所述DNA片段B自上游至 下游依次為CaMV35S啟動(dòng)子、玉米Adhl內(nèi)含子和EPSP基因。所述CaMV35S啟動(dòng)子、玉米Adhl內(nèi)含子的制備方法如下用HindIII和BamHI酶 切質(zhì)粒 pBARGUS(Vasi 1, V.，et al, Bio/technology, 10(6) :667_674，1992)回收 1. Okb 片 段，該片段含CaMV35S啟動(dòng)子(0. 45kb)和玉米Adhl內(nèi)含子(0. 55kb)序列。所述EPSP基因的核苷酸序列具體可為GenBank Accession Number X63374. 1自 5’末端第1至1335位核苷酸。所述重組質(zhì)粒還可為在PSP72質(zhì)粒中插入如下DNA片段得到的重組質(zhì)粒在 BamHI和Sac I酶切位點(diǎn)間插入擬南芥CBF4基因；在Hind III和Bam HI酶切位點(diǎn)間插入 擬南芥rd29A基因的啟動(dòng)子。所述CBF4基因的核苷酸序列具體可為GenBank Accession Number NM_124578自 5’末端第1至675位核苷酸；所述擬南芥親水蛋白rd29A基因的啟動(dòng)子的核苷酸序列具體 可為 GenBank Accession Number D13044 自 5，末端第 3928 至 5410 位核苷酸。所述重組質(zhì)粒在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述轉(zhuǎn)基因植株具體可為抗旱轉(zhuǎn)基因植物，如抗旱轉(zhuǎn)基因玉米。本發(fā)明還保護(hù)一種培育抗旱植物的方法，是將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到抗旱植物。所述植物具體可為玉米。本發(fā)明還保護(hù)一種培育脯氨酸含量和/或葉綠色含量提高的植物的方法，是將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物中，得到脯氨酸含量和/或葉綠色含量提高的植物。所述植物具體可 為玉米。本研究用PCR方法克隆了擬南芥菜脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子CBF4基因，以逆境誘導(dǎo)表達(dá) 基因rd29A的啟動(dòng)子為驅(qū)動(dòng)，構(gòu)建了逆境誘導(dǎo)表達(dá)載體PBAC146。用基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化玉米 優(yōu)良自交系的幼胚和胚性愈傷組織，轟擊后的愈傷組織經(jīng)過篩選、分化和植株再生過程，共 獲得36棵轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)PCR、PCR-Southern和Southern檢測(cè)表明，外源目的基因已成功 整合到部分轉(zhuǎn)基因玉米株系的基因組中。人工干旱處理下，轉(zhuǎn)基因株系的抗旱生理指標(biāo)測(cè) 定顯示，一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量和葉綠素含量比野生型對(duì)照提高一倍，間接表明轉(zhuǎn) 基因株系的抗旱能力在某種程度上有所提高。


圖1為pBAC146重組質(zhì)粒的圖譜。圖2為愈傷組織的誘導(dǎo)、分化與轉(zhuǎn)基因玉米苗的田間移栽；A 玉米幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；B 愈傷在篩選培養(yǎng)基上篩選；C 分化出 苗；D 壯苗；E 移栽。圖3為轉(zhuǎn)基因Ttl代植株外源CBF4基因片段的PCR檢測(cè)；M :DL2000plus ladder ；+ 陽(yáng)性質(zhì)粒pBAC146 ；0 空白；-陰性對(duì)照(ck) ；1 12 轉(zhuǎn)基因玉米Ttl代植株。圖4為轉(zhuǎn)基因T1代植株外源CBF4基因片段的PCR檢測(cè)；M :DL2000plus ladder ；+ 陽(yáng)性質(zhì)粒 pBAC146 ；0 空白；_ 陰性對(duì)照(ck) ；1 4 轉(zhuǎn)基因玉米T1代植株。圖5為轉(zhuǎn)基因T1代植株外源CBF4基因片段的PCR-Southern分析；+ 陽(yáng)性質(zhì)粒PBAC146 ；0 空白；-陰性對(duì)照(ck) ；1 4 轉(zhuǎn)基因玉米T1代植株。圖6為轉(zhuǎn)基因Tl代玉米植株的Southern雜交檢測(cè)；+ 陽(yáng)性質(zhì)粒pBAC146 ；0 陰性對(duì)照(ck) ； 1 4 轉(zhuǎn)基因植株。圖7為轉(zhuǎn)基因玉米脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果；Ck 轉(zhuǎn)空載體植株(對(duì)照)；1 8 轉(zhuǎn)基因植株。圖8為轉(zhuǎn)基因玉米葉綠素含量測(cè)定結(jié)果；Ck 轉(zhuǎn)空載體植株(對(duì)照)；1 8 轉(zhuǎn)基因植株。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。玉米遼單青貯178(北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室)； pGEM-Teasy Vector、T4DNA連接酶等購(gòu)自Promega公司；Taq DNA聚合酶、氨芐青霉素、 IPTG、X-gal等試劑均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Promega、New England Biolabs ；地高辛(DIG)標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒和 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche Diagnostics GmbH公司；普通生化試劑購(gòu)自Sigma公司、 Promega公司或國(guó)產(chǎn)?；驑屝吞?hào)PDS_1000/He (BioRad)實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pBAC146的構(gòu)建一、重組質(zhì)粒pSHK49H3的構(gòu)建1、將質(zhì)粒 pBARGUS(Vasil，V.，et al, Bio/technology, 10(6) :667_674，1992)用 HindIII和BamHI酶切，回收1. Okb片段，該片段含CaMV35S啟動(dòng)子(0. 45kb) +玉米Adhl內(nèi) 含子(0. 55kb)序列。2、將步驟1得到的1. Okb片段插入到pSP72的HindIII和BamHI位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒。3、將編碼抗除草劑草甘膦的玉米EPSP基因(GenBank Accession NumberX63374. 1 自5’末端第1至1335核苷酸序列)插入步驟2得到的重組質(zhì)粒的BamHI和EcoRI位點(diǎn)間， 獲得重組質(zhì)粒PSHK49。4、將重組質(zhì)粒pSHK49用EcoRI位點(diǎn)酶切后補(bǔ)成平端，引入含HindIII位點(diǎn)的適配 子(adaptor) CCCAAGCTTGGG序列，將得到的重組質(zhì)粒命名為重組質(zhì)粒pSHK49H3。二、重組質(zhì)粒pBAC145的構(gòu)建1、制備擬南芥 CBF4 基因(GenBank Accession Number NM124578 自 5，末端第 1 至675核苷酸)。2、制備擬南芥 rd29A 基因啟動(dòng)子(GenBank Accession Number D13044 自 5，末端 第3928至5410位核苷酸)。3、將 CBF4 基因用 Bam HI 和 SacI 酶切后插入到 pSP72 (Promega)的 Bam HI 和 Sac I位點(diǎn)間，得到重組質(zhì)粒。4、將rd29A基因啟動(dòng)子用HindIII和Bam HI酶切后插入到步驟3得到的重組質(zhì) 粒的Hind III和Bam HI酶切位點(diǎn)間，得到重組質(zhì)粒pBAC145。三、重組質(zhì)粒pBAC146的構(gòu)建用HindIII酶切重組質(zhì)粒pSHK49H3，回收2. 3kb片段(該片段含 35S+intron+EPSP)，將該2. 3kb片段插入到重組質(zhì)粒的pBAC145的HindIIII酶切位點(diǎn)間， 選擇正向插入陽(yáng)性質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了重組質(zhì)粒pBAC146(如圖1所示)。pBAC146以CaMV 35S啟動(dòng)子和玉米Adhl基因的Intronl驅(qū)動(dòng)的EPSP基因作為選 擇標(biāo)記基因，目的基因CBF4以擬南芥親水蛋白rd29A基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。rd29A基因的啟 動(dòng)子在受到干旱、冷害、鹽漬等脅迫時(shí)表達(dá)，在正常條件下并不表達(dá)或表達(dá)量很低，對(duì)轉(zhuǎn)基 因植株的正常生長(zhǎng)沒有影響。四、對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pSHK49H3的構(gòu)建方法同實(shí)施例1的步驟一。2、對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建用HindIII酶切重組質(zhì)粒pSHK49H3，回收2. 3kb片段(該片段含 35S+intron+EPSP)，將該2. 3kb片段插入到pSP72 (Promega)的HindIIII酶切位點(diǎn)，選擇正 向插入陽(yáng)性質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了含攜帶DNA片段B的重組質(zhì)粒，將其作為對(duì)照質(zhì)粒；所述DNA片段B自上游至下游依次為CaMV35S啟動(dòng)子、玉米Adhl內(nèi)含子和EPSP基因。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得和鑒定一、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得取授粉后12d左右的遼單青貯178的果穗，經(jīng)75%乙醇表面消毒后挑取其幼胚接 種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6基本培養(yǎng)基+10mgL-1 AgNO3+100mg L-1肌醇+2mg L-12,4-0+308 L-1 蔗糖+7g L—1瓊脂)上，暗培養(yǎng)3 5d后誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。純化好的PBAC146質(zhì)粒 調(diào)整濃度為Iygy L—1，按張曉東等的方法(Zhang X-D (張曉東)，Li D-M (李冬梅)，Xu W-Y (徐文英)，Jiang Y-Y (蔣有繹)，Hu D-F (胡道芬)，HanL-X (韓立新)· Development of transgenic wheat by biolistic bombardmenttransferring Basta resistance gene and novel HMW Glutenin subumit genes. Acta Agric Boreali—Sin (華北農(nóng)學(xué) 艮)，1997, 12(1) :133-136(in Chinese))進(jìn)行基因槍微彈的制備，PDS-1000/He型基因槍轟擊胚性愈 傷組織，5d后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有草甘膦的篩選培養(yǎng)基(誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入Img L—1草 甘膦)上篩選20d左右。然后選取生長(zhǎng)正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(N6基本培養(yǎng)基 +0. 5mg L-11AgNO3+100mg L-1 肌醇+1. 5mg L^KT+SOg L—1 蔗糖+7g Γ1 瓊脂+0. 5mg L-1 草甘 膦)上分化，分化的幼苗進(jìn)行壯苗后移栽到溫室。獲得轉(zhuǎn)基因植株的過程中，在各個(gè)時(shí)期進(jìn)行觀察和拍照，見圖2。共獲得36株轉(zhuǎn)基 因再生植株(T0代)。用對(duì)照質(zhì)粒代替PBAC146質(zhì)粒，其它步驟同上，得到轉(zhuǎn)空載體玉米，作為對(duì)照。二、轉(zhuǎn)基因玉米的鑒定(一)Ttl代轉(zhuǎn)基因玉米植株的鑒定 用CTAB法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米葉片進(jìn)行基因組DNA的提取，根據(jù)rd29A基因片段和CBF4 基因片段設(shè)計(jì)引物(上游引物為rd29A5 5，-AGGGTTTGATTACTTCTATTGG-3 ’ ；下游引物為 rdcbf3 :5，-TATGATTCCAGCCAACTTCC-3，；見序列表的序列1和序列2)，對(duì)36株轉(zhuǎn)基因植株 (Ttl代)進(jìn)行PCR檢測(cè)。轉(zhuǎn)空載體玉米植株為陰性對(duì)照，PBAC146為陽(yáng)性對(duì)照，水為空白對(duì) 照。PCR 反應(yīng)體系ddH2017. 3μ L，DNA 1 μ L (1 μ g μ L-1)，10 X PCR Reaction Buffer2. 5 μ L, dNTPs (2. 5mmol L-1) 2 μ L,上游引物 1 μ L,下游引物 1 μ L, Taq DNA 聚合酶 (5U μ L-1)?！?2μ L。PCR 反應(yīng)程序95°C變性 5min ；94°C變性 50s，45°C復(fù)性 50s，72°C延伸 50s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)產(chǎn)物用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。陽(yáng)性質(zhì)粒和13株轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出了 669bp的目標(biāo)片段，而轉(zhuǎn)空載體玉米植株 (陰性對(duì)照)和水(空白對(duì)照)沒有擴(kuò)增出帶，初步說明外源CBF4基因片段整合到部分轉(zhuǎn) 化玉米株系的基因組。部分植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果見圖3。(二)T1代轉(zhuǎn)基因玉米植株的鑒定獲得的Ttl代轉(zhuǎn)基因植株移栽到溫室后，4株成功結(jié)實(shí)獲得T1代，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的 T1代進(jìn)行鑒定，轉(zhuǎn)空載體玉米植株的T1代作為陰性對(duì)照，PBAC146為陽(yáng)性對(duì)照，水為空白對(duì)眧。1、PCR 鑒定方法同步驟(一)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。有四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系擴(kuò)增出669bp目標(biāo)片段，表明這四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均整合進(jìn)了外源目的基因片段。2、PCR-Southern 鑒定為了防止假陽(yáng)性的出現(xiàn)，將步驟1鑒定陽(yáng)性的四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR-Southern鑒定，步驟如下(1)以pBAC146為模板，rd29A5和rdcbf3為上下游引物，按照Roche公司PCR DIG Probe Synthesis Kit使用手冊(cè)提供的步驟進(jìn)行探針標(biāo)記，PCR所得產(chǎn)物經(jīng)膠回收后作為雜 交探針。(2)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序步驟(一)，PCR 產(chǎn)物電泳后按照785型真空轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)使用手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，信號(hào)檢測(cè)按照Roche公 司的DIG DNA Labeling and Detection Kit使用手冊(cè)提供的方法進(jìn)行。結(jié)果如圖5所示。四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的PCR-Southern結(jié)果也為陽(yáng)性，進(jìn)一步驗(yàn)證了 PCR結(jié)果。3、Southern 雜交鑒定為避免PCR及PCR-Southern檢測(cè)結(jié)果中假陽(yáng)性的出現(xiàn)，又對(duì)PCR-Southern檢測(cè) 呈陽(yáng)性的四個(gè)株系進(jìn)行了 Southern雜交檢測(cè)，步驟如下(1)為了使用適宜大小的Southern檢測(cè)探針(500bp左右最佳)，根據(jù)CBF4 基因序列設(shè)計(jì)引物(上游引物5’ -CTGGGAGGAAGAAGTTTCGT GAG-3’ ；下游引物 5，-CGTTATGATTCCAGCCAACTTCC-3，)，用該引物按照 Roche 公司 PCR DIG ProbeSynthesis Kit使用手冊(cè)提供的步驟進(jìn)行探針標(biāo)記。(2) Southern 步驟參照 Sambrook 等(Sambrook J,Russell D. MolecularCloning A Laboratory Manual,3rd edn. New York CoId Spring HarborLaboratory Press,2001. PP 304-331)方法進(jìn)行。植物基因組DNA利用HindIII進(jìn)行完全酶切。酶切產(chǎn)物濃縮后、 0. 8%瓊脂糖凝膠、25V電泳過夜，轉(zhuǎn)膜、雜交，然后進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)(同步驟2)。結(jié)果如圖6所示。陽(yáng)性質(zhì)粒和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系出現(xiàn)特異性雜交信號(hào)，轉(zhuǎn)空載體植 株沒有出現(xiàn)雜交信號(hào)，由于質(zhì)粒PBAC146上含有兩個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)，因此Southern雜 交結(jié)果不能看出外源基因?qū)氲目截悢?shù)。Southern雜交結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)外源基因CBF4成 功導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因玉米基因組中。三、轉(zhuǎn)基因玉米的耐旱能力鑒定為了驗(yàn)證所獲得的轉(zhuǎn)基因株系的抗旱能力，將T1代長(zhǎng)勢(shì)較好的并且經(jīng)分子檢測(cè)陽(yáng) 性的1個(gè)轉(zhuǎn)基因株系所獲得的種子(T2代)種植到溫室花盆中，并通過PCR的方法篩選到8 個(gè)陽(yáng)性植株，將該8個(gè)植株干旱處理如下(轉(zhuǎn)空載體玉米植株的T2代作為對(duì)照)將植株的3周齡苗置于26_28°C、相對(duì)濕度為15_20%、連續(xù)光照下，不澆水，觀察 表型并拍照同。實(shí)驗(yàn)共設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)中，所測(cè)試的各株系植株均分別為15株。1、轉(zhuǎn)基因玉米植株的脯氨酸含量測(cè)定脯氨酸作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其在植物受到水分脅迫時(shí)可出現(xiàn)大 量積累。大量研究表明，在干旱脅迫下，玉米不同生育期的葉片中游離脯氨酸含量均有明顯 增加。一般來說，同一品種，脯氨酸含量越高，抗旱性越強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因玉米的T2代人工抗旱處理6d后，用磺基水楊酸法測(cè)定其葉片中的游離脯 氨酸含量，測(cè)定方法參見王軍衛(wèi)等(Wang J W，Yang F P，Chen X Q，Zhang L Q，Geng D M，Zhang X D, Song Y Z, Zhang G S. Induced expression of DREBtranscriptional factor and study on its physiological effects of droughttolerance in transgenic wheat. Acta Genet Sin, 2006，33 :468_476)。結(jié)果見圖7。除2號(hào)和5號(hào)轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量比對(duì)照較低外，其余轉(zhuǎn)基因植 株均比對(duì)照高，其中7號(hào)最高，達(dá)到了 199. 53mg L—1，將近對(duì)照的2. 5倍，而其余也比對(duì)照高 出20%以上，脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果間接表明轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力高于轉(zhuǎn)空載體植株。2、轉(zhuǎn)基因玉米植株的葉綠素含量測(cè)定葉綠素是植物葉片的主要光合色素，葉綠素含量是植物生理研究中的重要指標(biāo)。轉(zhuǎn)基因玉米的T2代人工抗旱處理6d后，參照彭運(yùn)生等(Peng Y_S(彭運(yùn)生)， LiuE(>ClJM). Comparative study about extraction method of chlorophyll. ActaAgric Univ Pekingsis (北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，1992，18 (3) :247_250(in Chinese))的方法進(jìn)行葉 綠素含量測(cè)定，取玉米葉片的中部，準(zhǔn)確稱取鮮重(W)，剪碎，置于15mL試管中，采用丙酮 無水乙醇(2 1)混合液浸提，每個(gè)樣品加IOml混合液，絕對(duì)黑暗的環(huán)境中浸提24h。取 提取液于721型分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)663nm和645nm下讀取OD值，按以下公式計(jì)算Ca、 Cb。
葉綠素 Ca=(12‘7D663_2‘69D645”V
1000W
cb_ (22.69D645 - 4.68D663) * V 1000W結(jié)果見圖8。干旱處理下的部分轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照水平，其 中5號(hào)(2. 25mg g-1)葉綠素含量是對(duì)照的2倍，此項(xiàng)結(jié)果也表明部分轉(zhuǎn)基因株系的抗旱性 高于轉(zhuǎn)空載體株系。序列表<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院<120> 一種培育耐旱植物的方法及其專用重組質(zhì)粒<130>CG6NARY92438<160>2<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1agggtttgat tacttctatt gg 22<210>2<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220><223><400>2tatgattcca gccaacttcc 20
權(quán)利要求
含有CBF4基因的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒中，CBF4基因由擬南芥rd29A基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
2.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是在PSP72質(zhì)粒中插入 如下DNA片段得到的在BamHI和Sac I酶切位點(diǎn)間插入擬南芥CBF4基因；在Hind III和 Bam HI酶切位點(diǎn)間插入擬南芥rd29A基因的啟動(dòng)子；在HindIIII酶切位點(diǎn)插入DNA片段 B ；所述DNA片段B自上游至下游依次為CaMV35S啟動(dòng)子、玉米Adhl內(nèi)含子和EPSP基因。
3.如權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述EPSP基因的核苷酸序列為 GenBank Accession Number X63374. 1 自 5，末端第 1 至 1335 位核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是在PSP72質(zhì)粒中插入 如下DNA片段得到的在BamHI和Sac I酶切位點(diǎn)間插入擬南芥CBF4基因；在Hind III和 BamHI酶切位點(diǎn)間插入擬南芥rd29A基因的啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述CBF4基因的核苷酸序 列為GenBank Accession Number NM_124578自5，末端第1至675位核苷酸；所述擬南芥 rd29A基因的啟動(dòng)子的核苷酸序列為GenBank Accession Number D13044自5，末端第3928 至5410位核苷酸。
6.權(quán)利要求1至5中任一所述重組質(zhì)粒在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物為抗旱轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn) 基因植物為抗旱轉(zhuǎn)基因玉米。
8.一種培育抗旱植物的方法，是將權(quán)利要求1至5中任一所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物中，得 到抗旱植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物為玉米。
10.一種培育脯氨酸含量和/或葉綠色含量提高的植物的方法，是將權(quán)利要求1至5中 任一所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物中，得到脯氨酸含量和/或葉綠色含量提高的植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育耐旱植物的方法及其專用重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒，是含有CBF4基因的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒中，CBF4基因由擬南芥rd29A基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。用發(fā)明得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化玉米的幼胚和胚性愈傷組織，獲得了耐逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。人工干旱處理下，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量和葉綠素含量比野生型對(duì)照提高一倍，表明轉(zhuǎn)基因株系的抗旱能力有所提高。本發(fā)明具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101988073SQ200910090410
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者張曉東, 張立全, 李向龍, 楊東歌, 楊鳳萍, 薛靜, 陳緒清 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院