專利名稱：血清鈉離子酶法定量測定試劑盒及其制備方法和其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定血清中鈉離子含量的試劑盒及其制備方法以及其檢測方法。

背景技術(shù)：
血液內(nèi)鈉離子含量對人體內(nèi)電解質(zhì)的調(diào)節(jié)起著重要的作用，一般鈉離子的正常值在135-148mmol/L的范圍內(nèi)，而臨床上常見的電解質(zhì)紊亂是低血鈉癥。因此，血清中鈉離子的測定已經(jīng)成為醫(yī)院里常規(guī)的分析項目之一。
目前應(yīng)用的鈉離子分析方法中常用的有火焰光度法、離子選擇電極法和酶法?；鹧婀舛确ǖ脑硎菍⒋郎y鈉原子通過火焰加熱刺激而被激發(fā)，當(dāng)回到基態(tài)時發(fā)出具有特征波長的光，火焰中由被激發(fā)的待測鈉原子產(chǎn)生的特征波長的輻射能的強(qiáng)度與鈉原子的數(shù)量直接成正比，而被激發(fā)的待測鈉原子數(shù)量與樣本中所要測定的鈉原子的濃度直接成正比。但是，這種方法需要的儀器復(fù)雜，且設(shè)備昂貴，造成檢測的成本高，并且需要使用可燃?xì)怏w，因此，在臨床分析中具有應(yīng)用難度大的缺點。
離子選擇電極法(Ion-Selective Electrodes、ISE)的原理是電極溶液中被測離子接觸電極時，在離子選擇電極膜基質(zhì)的含水層內(nèi)發(fā)生離子遷移，而遷移離子的電荷改變存在著電勢，因而使膜面間的電位發(fā)生變化，在測量電極與參比電極間產(chǎn)生一個電位差。理想的離子選擇性電極需要溶液中所要測定的離子產(chǎn)生的電位差和離子的活度對數(shù)成比例，當(dāng)活度對數(shù)保持恒定時，電位差與離子濃度的對數(shù)也成比例，由此可以求出溶液中離子的濃度。對于離子選擇電極法，其理想的情況是所使用的電極都要具有單一離子的選擇性，而使電極只對一種離子產(chǎn)生反應(yīng)。但是，實際上所有的離子選擇電極都存在干擾離子，即使經(jīng)過校正也不能完全保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。并且，在使用離子選擇性電極時要保證管道的暢通，如果經(jīng)多次保養(yǎng)后的電極，經(jīng)過定標(biāo)后不能達(dá)到規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，就不能再被使用，需要進(jìn)行更換，由此可見，離子選擇性電極具有一定的壽命。因此，離子選擇電極法存在難于保證測定值的精度，且需要定期對電極進(jìn)行檢測，電極的壽命不長這樣的缺點。
對于酶法的測定，其原理在于通過鈉依賴性β-半乳糖苷酶催化底物O-硝基酚-β-D-吡喃半乳糖的酶動力學(xué)反應(yīng)檢測鈉離子，其產(chǎn)物O-硝基酚在405nm的吸光度變化率與鈉濃度呈正比。酶法檢測血清鈉離子的優(yōu)點在于可以使用全自動生化分析儀，不需要專門的儀器和相應(yīng)的耗材，因此，大大的降低了檢測的成本。
在現(xiàn)有技術(shù)中，對于酶法測定鈉離子的方法公開有中國200410066188.6的專利申請，記載了一種酶法測定鈉離子含量的方法及鈉離子診斷試劑盒，使用的酶為β-半乳糖苷酶，底物為O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖。樣本中的鈉離子激活β-半乳糖苷酶，分解底物O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖，生成有色物質(zhì)，該生成有色物質(zhì)的速率與樣本中的鈉離子濃度成正比。為了使反應(yīng)體系中的鈉離子維持在一個合適的濃度范圍，需要加入一定濃度的穴醚或冠醚來結(jié)合掉一部分鈉離子，為了保證穴醚或冠醚與鈉離子的結(jié)合效率較高，反應(yīng)體系應(yīng)為堿性。但是，β-半乳糖苷酶和O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖在溶液中不穩(wěn)定，尤其是在堿性溶液中更不易穩(wěn)定，因此，該鈉離子診斷試劑盒存在血清中鈉離子的檢測精度差、試劑不穩(wěn)定這樣的缺點。雖然該專利申請?zhí)岢隽丝梢詫⒃噭┲瞥煞€(wěn)定的干粉試劑或干試劑，但是卻沒有具體的提供干粉試劑或干試劑的制備方法。
專利申請200610028451.1也公開了一種酶法檢測血清中鈉離子的試劑及方法，檢測原理與專利申請?zhí)?00410066188.6基本相同，但使用了成本較低的冠醚代替穴醚。雖然該申請將試劑做成稀釋液和凍干品來保證試劑的穩(wěn)定性，并且使用15％或18％的蔗糖作為賦形劑。但是，蔗糖的共熔點較低，10％的蔗糖共熔點為-26℃，40％的蔗糖共熔點為-33℃。一般情況下，凍干過程中為了避免試劑融化必須將主凍干的溫度控制在共熔點5℃以下，因此，對同時兼顧冷阱和箱體制冷的設(shè)備提出了較高的要求。并且在-30℃下、冰面的飽和蒸汽壓為0.37mbar(大氣壓為1000mbar)，凍干過程中的壓力只有維持在0.12mbar左右，才能達(dá)到較高的升華效率，否則凍干的速度會很慢，因此，對真空泵及真空冷凍干燥機(jī)封閉性的要求也很高。再加上蔗糖在凍結(jié)時極易形成玻璃態(tài)，且在冰面形成干物質(zhì)密度較大的表層，對凍干速率和凍干外形有很大的影響。因此，專利申請200610028451.1公開的血清中鈉離子的檢測方法，還存在一定的缺陷。


發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明在試劑組成成分上進(jìn)行了優(yōu)化，提供一種血清鈉離子酶法定量測定試劑盒。本發(fā)明的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，采用不同于現(xiàn)有技術(shù)的賦形劑，使該凍干試劑比現(xiàn)有的凍干試劑更穩(wěn)定，且凍干工藝對設(shè)備的要求低。
本發(fā)明還提供一種血清鈉離子酶法定量測定試劑盒的制備方法。
另外，本發(fā)明提供一種血清鈉離子酶法定量測定試劑盒的檢測方法。
為了克服了現(xiàn)有技術(shù)中所存在的缺陷，本發(fā)明提供的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括R1復(fù)溶液成分、R1凍干品成分、R2復(fù)溶液成分和R2凍干品成分，其中，所述R1復(fù)溶液成分包含緩沖液，以及溶解于該緩沖液中的穴醚或冠醚和穩(wěn)定劑；所述R1凍干品成分包括緩沖液，以及溶解于該緩沖液中的β-半乳糖苷酶、穩(wěn)定劑和賦形劑；所述R2復(fù)溶成分包括緩沖液；所述R2凍干品成分包括緩沖液，以及溶于緩沖液中的O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和賦形劑，所述賦性劑包含選自多元醇和蛋白中的任意一種或多種，或者它們的組合，并且所述R1凍干品成分與R2凍干品成分中的賦形劑彼此相同或不同，所述各穩(wěn)定劑彼此相同或不同，所述各緩沖液彼此相同或不同。
本發(fā)明的優(yōu)選的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述賦性劑進(jìn)一步含有糖類或多聚糖類。
本發(fā)明的優(yōu)選的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，所述賦形劑為蛋白和其它物質(zhì)的混合物，其混合質(zhì)量比為0.1～10∶1。
本發(fā)明的優(yōu)選的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述多元醇為選自山梨醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚糖醇和聚乙二醇中的一種或多種，優(yōu)選為選自甘露醇、木糖醇和聚乙二醇中的一種或多種。
另外，本發(fā)明的優(yōu)選的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述蛋白為選自脫脂牛奶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、馬血清白蛋白、牛γ球蛋白、魚精蛋白和大豆白蛋白中的一種或多種，優(yōu)選為選自牛血清白蛋白、卵清蛋白和魚精蛋白中的一種或多種。
本發(fā)明的優(yōu)選的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述賦性劑進(jìn)一步含有選自葡聚糖、可溶性淀粉、環(huán)糊精、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、阿拉伯膠和果膠中的一種或多種，優(yōu)選進(jìn)一步含有選自葡聚糖和羥乙基纖維素中的一種或多種。
本發(fā)明的優(yōu)選的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述R1復(fù)溶液成分包含濃度為20-800mmol/L的緩沖液，在該R1復(fù)溶液成分中，基于該R1復(fù)溶液成分，所述穴醚或冠醚的含量為0.5-30mmol/L，所述穩(wěn)定劑的含量為0.5-100mmol/L；所述R1凍干品成分包括濃度為10-100mmol/L的緩沖液，在該R1凍干品成分中，基于該R1凍干品成分，所述β-半乳糖苷酶的含量為500-150000U/L，所述穩(wěn)定劑的含量為0.5-100mmol/L，所述賦形劑的含量為0.5-30質(zhì)量％；所述R2復(fù)溶液成分包含濃度為0.5-100mmol/L的緩沖液；所述R2凍干品成分包括10-100mmol/L的緩沖液，在該R2凍干品成分中，基于該R2凍干品成分，所述O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量為2.5-150mmol/L，所述賦形劑的含量為0.5-5質(zhì)量％。
本發(fā)明的優(yōu)選的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述R1復(fù)溶液成分包含濃度為50-500mmol/L的緩沖液，在該R1復(fù)溶液成分中，基于該R1復(fù)溶液成分，所述穴醚或冠醚的含量為0.5-20mmol/L，所述穩(wěn)定劑的含量為0.5-50mmol/L；所述R1凍干品成分包括濃度為20-50mmol/L的緩沖液，在該R1凍干品成分中，基于該R1凍干品成分，所述β-半乳糖苷酶的含量為1000-80000U/L，所述穩(wěn)定劑的含量為0.5-50mmol/L，所述賦形劑的含量為2-15質(zhì)量％；所述R2復(fù)溶液成分包含濃度為10-50mmol/L的緩沖液；所述R2凍干品成分包括20-50mmol/L的緩沖液，在該R2凍干品成分中，基于該R2凍干品成分，所述O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量為10-100mmol/L，所述賦形劑的含量為1-3質(zhì)量％。
本發(fā)明的優(yōu)選的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒的方法，其特征在于，分別配制R1復(fù)溶液成分、R1凍干品成分、R2復(fù)溶液成分和R2凍干品成分，其中，配制所述R1復(fù)溶液成分的步驟包括在緩沖液中溶解穴醚或冠醚和穩(wěn)定劑；配制R1凍干品成分的步驟包括在緩沖液中溶解β-半乳糖苷酶、穩(wěn)定劑和賦形劑，制成凍干品。配制R2凍干品成分的步驟包括將O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和賦形劑溶解于緩沖液中，制成凍干品。
本發(fā)明的使用血清鈉離子酶法定量測定試劑盒的檢測方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～8中任一項所述血清鈉離子酶法定量測定試劑盒凍干試劑的R1復(fù)溶液溶解R1凍干品得到RA，使RA中含有β-半乳糖苷酶的含量為100-10000U/L，R2復(fù)溶液溶解R2凍干品得到RB，使RB中含有O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量為1-20mmol/L，RA和RB的體積配比為1～10∶1。
由本發(fā)明提供的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，提高了β-半乳糖苷酶和O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖在堿性溶液中的穩(wěn)定性，并且使用醇類和蛋白中的任意一種或多種及其組合，以及它們和糖類的組合作為賦形劑，大大提高了凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性，同時，有效的升高了凍干試劑的共熔點，最終獲得了制備簡便、穩(wěn)定性良好的凍干試劑。

具體實施例方式 以下，具體的說明本發(fā)明的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒。
本發(fā)明的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒中，其測定血清中的鈉離子的原理在于，將樣品加入主要由β-半乳糖苷酶、O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖組成的試劑中，使之發(fā)生如下的反應(yīng)
其產(chǎn)物O-硝基酚在405nm的吸光度變化率與鈉離子濃度呈正比。
本發(fā)明的試劑主要包括緩沖液、β-半乳糖苷酶、O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖、穩(wěn)定劑、賦形劑。
該鈉離子含量的試劑盒成分中的緩沖液主要是維持反應(yīng)體系的pH值在穩(wěn)定的范圍內(nèi)，保證穴醚或冠醚能與鈉離子高效結(jié)合。其pH在6.0-11.0之間，優(yōu)選在8.0-10.0之間。對于這樣的緩沖液可以舉出2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液、二(2-羥乙基)亞氨基(Bis-Tris)緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、1，3-二[tris(羥甲基)甲基氨基]丙烷(Bis-Tris Propane)緩沖液、N(2-乙酰氨基)-2-亞氨基二醋酸(ADA)緩沖液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(MOPSO)緩沖液、N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)緩沖液、嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)緩沖液、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)緩沖液、三乙醇胺(TEA)緩沖液、3-雙(2-羥乙基)氨基-2-羥基丙磺酸(DIPSO)緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)緩沖液、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸(CAPSO)緩沖液、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、甘氨酸緩沖液等緩沖液中的至少一種。其中，優(yōu)選為三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、1，3-二[tris(羥甲基)甲基氨基]丙烷(Bis-Tris Propane)緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)緩沖液、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸(CAPSO)緩沖液、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液和甘氨酸緩沖液。
對于β-半乳糖苷酶優(yōu)選來自微生物的酶，這是因為微生物來源的酶有熱穩(wěn)定更好的優(yōu)點，可以提高試劑的長期穩(wěn)定性。
而O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖優(yōu)選純度在95％以上，并且加入到試劑中后在405nm下的吸光度較小。
試劑中的穩(wěn)定劑是為了保證試劑的穩(wěn)定，使酶不失活，酶的量決定顯色反應(yīng)的大小。對于穩(wěn)定劑例如可以舉出硫酸鎂、氯化鎂、醋酸鎂、d-生物素、甘氨酸、丙氨酸、牛γ球蛋白、N-乙酰半胱氨酸、甲硫氨酸、巰基乙醇、二硫蘇糖醇、還原性谷胱甘肽、乙二醇(α-氨基乙基)醚四乙酸、乙二胺四乙酸、氫氧化鋰、檸檬酸鋰、碳酸鋰、硫酸鋰、硝酸鋰、磷酸鋰、氯化鋰等。可以使用其中的一種，或幾種混合后使用。其中，優(yōu)選為硫酸鎂、氯化鎂、醋酸鎂、巰基乙醇、二硫蘇糖醇、還原性谷胱甘肽、乙二醇(α-氨基乙基)醚四乙酸、乙二胺四乙酸、氫氧化鋰、碳酸鋰、氯化鋰。
本發(fā)明的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒作為一種凍干雙試劑，含有如下成分 其中，緩沖液的濃度為其本身的濃度，其余的濃度為基于相應(yīng)混合后成分的濃度，凍干品的濃縮倍數(shù)是基于β-半乳糖苷酶或O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的濃度而言的。各成分的濃度配比只是優(yōu)選的范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明說明書的指導(dǎo)下，可以適當(dāng)選擇不同的緩沖液、穩(wěn)定劑、賦形劑等，并且調(diào)整、確定其最佳配比。
在測定時，將R1復(fù)溶液溶解R1凍干品得到RA，R2復(fù)溶液溶解R2凍干品得到RB，該RA和RB的體積配比為1～10∶1，并且各物質(zhì)所在的位置可進(jìn)行調(diào)整以形成多個配方。
凍干試劑中賦形劑是選自多元醇類和蛋白中的任意一種或多種，以及它們的組合，還可以進(jìn)一步含有糖類或多聚糖類。本發(fā)明的多元醇類例如可以舉出，山梨醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚糖醇、聚乙二醇等，優(yōu)選為甘露醇、木糖醇、聚乙二醇，對于蛋白類，可以舉出脫脂牛奶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、馬血清白蛋白、牛γ球蛋白、魚精蛋白、大豆白蛋白、明膠等，優(yōu)選為牛血清白蛋白、卵清蛋白、魚精蛋白。對于本發(fā)明中的糖類可以舉出乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、海藻糖等糖類，優(yōu)選乳糖、葡萄糖、海藻糖。多聚糖類可以舉出葡聚糖、可溶性淀粉、環(huán)糊精、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、阿拉伯膠、果膠等，優(yōu)選葡聚糖、羥乙基纖維素。在這些賦形劑中，更優(yōu)選為蛋白和其它物質(zhì)的混合物，例如，蛋白和多元醇的混合，蛋白和糖類的混合，以及蛋白和多聚糖類的混合，該混合物的混合比根據(jù)配比物質(zhì)的性質(zhì)而定，優(yōu)選其他物質(zhì)與蛋白的混合質(zhì)量比為0.1～10∶1。
本發(fā)明中的賦形劑作用在于提高凍干產(chǎn)品的干物質(zhì)含量，改善凍干產(chǎn)品的溶解性和穩(wěn)定性，減少冷凍干燥過程中對有效成分的損害，提高產(chǎn)品的共熔點和崩解溫度，使凍干產(chǎn)品有美觀的外形。賦形劑也稱保護(hù)劑、懸浮介質(zhì)、填充劑、緩沖劑、基礎(chǔ)物等。
所有試劑的組成成分中應(yīng)盡量減少鈉離子的含量，或者使其含量為零，否則會升高試劑空白、降低試劑的穩(wěn)定性。
對于需要凍干的溶液經(jīng)過過濾除菌后，分別裝入西林瓶或其它凍干用瓶內(nèi)，真空冷凍干燥后，真空壓塞或通入氮氣、氦氣、氬氣后壓塞，密封。對于本發(fā)明中凍干試劑的凍干方法，可以采用常規(guī)的凍干方法。
檢測最終反應(yīng)產(chǎn)物是在主波長下(405nm或其他選定的波長)吸光度的變化，測定樣本中鈉離子含量。該測定波長優(yōu)選O-硝基酚有最大吸收的波長。對于本發(fā)明的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒的制備方法，可以是分別配制R1復(fù)溶液成分、R1凍干品成分、R2復(fù)溶液成分和R2凍干品成分，R1復(fù)溶液成分，首先配制緩沖液，然后在緩沖液中溶解穴醚或冠醚和穩(wěn)定劑，R1凍干品成分也是首先配制緩沖液，然后在緩沖液中溶解β-半乳糖苷酶、穩(wěn)定劑和賦形劑，制成凍干品，凍干方法可以采用任何一種常規(guī)的凍干方法，然后，配制緩沖液制成R2復(fù)溶成分，而R2凍干品成分，首先配制緩沖液，然后將O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和賦形劑溶解于緩沖液中，制成凍干品，凍干方法也是采用任何一種常規(guī)的凍干方法。按上述混合比配制成的R1復(fù)溶液成分、R1凍干品成分、R2復(fù)溶液成分和R2凍干品成分，作為一種試劑盒產(chǎn)品，具有很高的穩(wěn)定性。
在測定時，只要將R1復(fù)溶液溶解R1凍干品得到RA，使RA中含有β-半乳糖苷酶的含量為100-10000U/L，R2復(fù)溶液溶解R2凍干品得到RB，使RB中含有O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量為1-20mmol/L，RA和RB的體積配比為1～10∶1，就可以進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的血清中鈉離子含量的測定。
實施例 以下，基于實施例，進(jìn)一步具體說明有關(guān)本發(fā)明。但是，本發(fā)明不限于以下的實施例。
實施例1 (1)R1復(fù)溶液Tris-HCl緩沖液pH 9.0(25℃)450mmol/L，1000mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 硫酸鎂0.6g 氨基聚醚221(Kryptofix 221)2.0g 巰基乙醇0.78g (2)R1凍干品(10倍濃縮液)Tris-HCl緩沖液pH 9.0(25℃)50mmol/L，100mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 硫酸鎂 0.06g 海藻糖 1.0g 牛血清白蛋白6.0g β-半乳糖苷酶 5000U (3)R2復(fù)溶液Tris-HCl緩沖液pH 9.0(25℃)30mmol/L，400mL (4)R2凍干品(5倍濃縮液)Tris-HCl緩沖液pH 9.0(25℃)30mmol/L，80mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 牛血清白蛋白1.6g O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷2.0g R1凍干品分裝為4.5ml/瓶，凍干后用45ml R1復(fù)溶液溶解得到RA，R2凍干品分裝為4.0ml/瓶，凍干后用20ml R2復(fù)溶液溶解得到RB，該RA和RB的體積混合比為2.5∶1。
在全自動生化分析儀(奧林巴斯AU400)設(shè)置參數(shù)如下反應(yīng)溫度37℃，主波長410nm，副波長660nm，兩點速率法(RATE1)，RA∶RB∶樣本體積比為200∶80∶8(單位μl)，樣本與RA在37℃保溫3分鐘后，加入RB，1分鐘后記錄吸光度A1，反應(yīng)100秒后，記錄吸光度A2。計算兩點間的吸光度變化，對照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線可測得樣本中的鈉離子含量。
實施例2 (1)R1復(fù)溶液Tris-HCl緩沖液pH 8.5(25℃)100mmol/L，1000mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 氯化鎂1.0g 氨基聚醚221(Kryptofix 221)2.7g 二硫蘇糖醇0.3g (2)R1凍干品(10倍濃縮液)Tris-HCl緩沖液pH 8.5(25℃)20mmol/L，100mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 氯化鎂0.1g 甘露醇10g 牛血清白蛋白 2.0g β-半乳糖苷酶 3000U (3)R2復(fù)溶液Tris-HCl緩沖液pH 8.5(25℃)10mmol/L，500mL (4)R2凍干品(5倍濃縮液)Tris-HCl緩沖液pH8.5(25℃)10mmol/L，100mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 甘露醇2.5g 牛血清白蛋白 0.5g O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷1.0g R1凍干品分裝為5ml/瓶，凍干后用50ml R1復(fù)溶液溶解得到RA，R2凍干品分裝為5ml/瓶，凍干后用25ml R2復(fù)溶液溶解得到RB，該RA和RB的配比為2∶1。
在全自動生化分析儀(日立7060)設(shè)置參數(shù)如下反應(yīng)溫度37℃，主波長405nm，副波長660nm，兩點速率法(2 Point Rate)，RA∶RB∶樣本體積比為200∶100∶8(單位μl)，樣本與RA在37℃保溫5分鐘后，加入RB，1分鐘后記錄吸光度A1，反應(yīng)2分鐘后，記錄吸光度A2。計算兩點間的吸光度變化，對照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線可測得樣本中的鈉離子含量。
實施例3 (1)R1復(fù)溶液Tris-HCl緩沖液pH 7.5(25℃)200mmol/L，1000mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 硫酸鎂0.6g 氨基聚醚221(Kryptofix 221)2.0g 二硫蘇糖醇0.5g (2)R1凍干品(8倍濃縮液)Tris-HCl緩沖液pH 7.5(25℃)40mmol/L，125mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 硫酸鎂 0.075g 葡萄糖 1.25g 卵清蛋白 6.25g β-半乳糖苷酶125U (3)R2復(fù)溶液Tris-HCl緩沖液pH 7.5(25℃)60mmol/L，1000mL (4)R2凍干品(4倍濃縮液)Tris-HCl緩沖液pH 7.5(25℃)60mmol/L，250mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 卵清蛋白5.0g O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷0.76g R1凍干品分裝為6.25ml/瓶，凍干后用50ml R1復(fù)溶液溶解得到RA，R2凍干品分裝為6.25ml/瓶，凍干后用25ml R2復(fù)溶液溶解得到RB，該RA和RB的體積混合比為1∶1。
在全自動生化分析儀(日立7060)設(shè)置參數(shù)如下反應(yīng)溫度37℃，主波長405nm，副波長660nm，兩點速率法(2 Point Rate)，RA∶RB∶樣本體積比為175∶175∶10(單位μl)，樣本與RA在37℃保溫5分鐘后，加入RB，1分鐘后記錄吸光度A1，反應(yīng)2分鐘后，記錄吸光度A2。計算兩點間的吸光度變化，對照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線可測得樣本中的鈉離子含量。
實施例4 (1)R1復(fù)溶液CAPSO緩沖液pH10.0(25℃)50mmol/L，1500mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 氯化鎂1.8g 15-冠醚-5 6.0g 二硫蘇糖醇0.8g (2)R1凍干品(15倍濃縮液)CAPSO緩沖液pH10.0(25℃)50mmol/L，100mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 氯化鎂 0.12g 甘露醇 1.0g 卵清蛋白 5.0g β-半乳糖苷酶8000U (3)R2復(fù)溶液CAPSO緩沖液pH9.0(25℃)80mmol/L，200mL (4)R2凍干品(5倍濃縮液)CAPSO緩沖液pH9.0(25℃)80mmol/L，40mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 卵清蛋白 0.4g O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷 1.2g R1凍干品分裝為4.0ml/瓶，凍干后用60ml R1復(fù)溶液溶解得到RA，R2凍干品分裝為4.0ml/瓶，凍干后用20ml R2復(fù)溶液溶解得到RB，該RA和RB的配比為7.5∶1。
在全自動生化分析儀(日立7060)設(shè)置參數(shù)如下反應(yīng)溫度37℃，主波長405nm，副波長660nm，兩點速率法(2 Point Rate)，RA∶RB∶樣本體積比為225∶30∶8(單位μl)，樣本與RA在37℃保溫5分鐘后，加入RB，1分鐘后記錄吸光度A1，反應(yīng)3分鐘后，記錄吸光度A2。計算兩點間的吸光度變化，對照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線可測得樣本中的鈉離子含量。
比較例1 制作以下組成的試劑，但不含有賦形劑，試劑配比及檢測參數(shù)同實施例2。
(1)R1Tris-HCl緩沖液pH 8.5(25℃)102mmol/L，1000mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 氯化鎂 1.1g 氨基聚醚221(Kryptofix 221)2.7g 二硫蘇糖醇 0.3g β-半乳糖苷酶3000U (2)R2Tris-HCl緩沖液pH 8.5(25℃)12mmol/L，500mL，準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷1.0g 比較例2 制作以下組成的試劑，主要成分與復(fù)溶后的實施例2相同，但是，不經(jīng)過凍干，為液體試劑，試劑配比及檢測參數(shù)同實施例2。
(1)R1Tris-HCl緩沖液pH 8.5(25℃)102mmol/L，1000mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 氯化鎂 1.1g 氨基聚醚221(Kryptofix 221)2.7g 二硫蘇糖醇 0.3g 甘露醇 10g 牛血清白蛋白 2.0g β-半乳糖苷酶 3000U (2)R2Tris-HCl緩沖液pH 8.5(25℃)12mmol/L，500mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 甘露醇 2.5g 牛血清白蛋白0.5g O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷1.0g 比較例3 主要成分與實施例4相同，用蔗糖作為賦形劑。
(1)R1復(fù)溶液CAPSO緩沖液pH10.0(25℃)50mmol/L，1500mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 氯化鎂1.8g 15-冠醚-5 6.0g 二硫蘇糖醇0.8g (2)R1凍干品(15倍濃縮液)CAPSO緩沖液pH10.0(25℃)50mmol/L，100mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 氯化鎂 0.12g 蔗糖 27.0g β-半乳糖苷酶 8000U (3)R2復(fù)溶液CAPSO緩沖液pH9.0(25℃)80mmol/L，200mL (4)R2凍干品(5倍濃縮液)CAPSO緩沖液pH9.0(25℃)80mmol/L，40mL，依次準(zhǔn)確的加入以下物質(zhì) 蔗糖4.8g O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷1.2g 1.有關(guān)血清鈉離子酶法定量測定試劑盒凍干試劑檢測準(zhǔn)確度的效果試驗 根據(jù)各實施例和比較例的要求設(shè)定檢測參數(shù)，同時復(fù)溶試劑并在相應(yīng)檢測儀器上進(jìn)行實驗，使用配套標(biāo)準(zhǔn)液定標(biāo)后檢測多個廠家的質(zhì)控品，評價與靶值的偏離程度，檢測結(jié)果見表1。
表1 其中，質(zhì)控品是臨床檢驗實驗室為了對檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性及檢測結(jié)果的可靠性進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測而使用的穩(wěn)定的、有定值的樣本。本實驗中的質(zhì)控品都是凍干品，各個質(zhì)控品的生產(chǎn)廠家和批號，見下表。
從表1中我們可以看出，實施例中的測定值都比比較例的測定值更接近于靶值，說明由該試劑測定的血清中的鈉離子比現(xiàn)有的試劑具有更好的精確度。
2.有關(guān)血清鈉離子酶法定量測定試劑盒凍干試劑穩(wěn)定性的效果實驗 (1)定標(biāo)穩(wěn)定性臨床檢驗實驗室在使用檢測試劑的過程中一般將試劑開蓋置于生化儀試劑倉中一直到試劑使用完，并且不一定每次檢測前都定標(biāo)。為了避免不必要的試劑浪費，要求試劑開蓋置于試劑倉中的定標(biāo)頻次越低越好。對復(fù)溶后的實施例3、實施例4與比較例1的試劑，同時在日立7060全自動生化儀上定標(biāo)，檢測質(zhì)控品(下面使用的為英國朗道多項生化質(zhì)控品水平2和水平3，水平2靶值142mmol/L，為正常范圍內(nèi)的質(zhì)控品，水平3靶值161mmol/L，為異常高值的質(zhì)控品。)然后將所有試劑開蓋置于試劑倉內(nèi)，每天不定標(biāo)檢測相同的質(zhì)控，用最初定標(biāo)的結(jié)果進(jìn)行計算，結(jié)果見表2。
表2

從表2的數(shù)據(jù)中可知實施例3和實施例4的開蓋穩(wěn)定性好于比較例1，能明顯降低定標(biāo)頻次，避免浪費試劑。
(2)加速破壞穩(wěn)定性將未復(fù)溶的實施例2試劑、比較例3試劑(包括R1復(fù)溶液、R1凍干品、包括R2復(fù)溶液、R2凍干品)和液體的比較例2試劑(包括R1和R2)同時置于37℃或41℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)加速破壞，一定時間取出，復(fù)溶實施例2、比較例3的試劑，與比較例2一起定標(biāo)檢測質(zhì)控，評價加速破壞對試劑準(zhǔn)確度的影響，結(jié)果見表3。
表3
從表3的數(shù)據(jù)中可知對于實施例2，在37℃、41℃分別加速12天、3天，對質(zhì)控測值無影響。按照通常法則，生物試劑在37℃每穩(wěn)定1天，相當(dāng)于在4-10℃穩(wěn)定1.5月，41℃每穩(wěn)定1天，相當(dāng)于在4-10℃穩(wěn)定5-6個月，因此可推算實施例2的試劑盒在4-10℃可穩(wěn)定18個月左右。而比較例2在37℃加速破壞3天后尚能測準(zhǔn)，但41℃加速破壞3天后，質(zhì)控測值上升。37度加速6天后試劑失效。其主要原因在于β-半乳糖苷酶失活，不能通過定標(biāo)，因此，無法檢測樣本。并且R2顏色變深，在405nm的吸光度增大，接近儀器的檢測高限，使檢測反應(yīng)的吸光度監(jiān)測受到影響。比較例3加速破壞后雖然可以進(jìn)行測定，但是其測出的值卻比實施例2測出的值偏離靶值。由此可見，制成凍干試劑的實施例2穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于液體試劑的比較例2，也好于使用蔗糖作為賦形劑的比較例3。
3.有關(guān)血清鈉離子酶法定量測定試劑盒凍干條件改善的探討 將比較例3的凍干試劑與實施例4的凍干試劑一起凍干，將兩試劑降溫到-40℃，并維持2小時后開始抽真空并緩慢升溫，主凍干期間板層溫度維持在-5℃，冷阱溫度低于-40℃，真空度0.1～0.3mbar，將產(chǎn)品的溫度維持在-20℃。主凍干結(jié)束后升高板層溫度到30℃進(jìn)行二次凍干，總時長35小時。實施例4凍干狀態(tài)良好，呈白色勻質(zhì)固體，體積與凍干前一致。比較例3凍干后脫壁萎縮，形成致密表層，中間層干物質(zhì)較少，有明顯的崩解現(xiàn)象，外觀上不如實施例4。
對于比較例3，將試劑降溫到-50℃，并維持2小時后開始抽真空并緩慢升溫，主凍干期間板層溫度維持在-25℃，冷阱溫度低于-55℃，真空度0.1～0.2mbar，將產(chǎn)品的溫度維持在-35℃。主凍干結(jié)束后升高板層溫度到30℃進(jìn)行二次凍干，總時長45小時，才能制成和實施例4具有同樣外觀的凍干試劑。
由此可見使用蔗糖作為賦形劑對凍干設(shè)備提出了很高的要求，在產(chǎn)品溫度很低的情況下進(jìn)行升華要求冷阱的溫度更低，真空度更高，并且為了維持較低的溫度，凍干設(shè)備的能耗也很高，凍干的速率也較慢，而本發(fā)明的凍干試劑，通過對賦性劑的選擇，降低了對凍干條件的要求，也減小了凍干過程中試劑融化的風(fēng)險，凍干工藝更容易控制。
由本發(fā)明提供的制備方法制備的凍干試劑使用了共熔點較低的賦形劑或賦形劑組合，提高了試劑的穩(wěn)定性，降低了凍干制劑的難度，可適用于手工、半自動、自動檢測系統(tǒng)中。由該制備方法制備的凍干試劑測定的血清中的鈉離子準(zhǔn)確度高，可在4-10℃穩(wěn)定長達(dá)18個月左右。
權(quán)利要求
1.一種血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括R1復(fù)溶液成分、R1凍干品成分、R2復(fù)溶液成分和R2凍干品成分，其中，
所述R1復(fù)溶液成分包含緩沖液，以及溶解于該緩沖液中的穴醚或冠醚和穩(wěn)定劑；所述R1凍干品成分包括緩沖液，以及溶解于該緩沖液中的β-半乳糖苷酶、穩(wěn)定劑和賦形劑；
所述R2復(fù)溶成分包括緩沖液；所述R2凍干品成分包括緩沖液，以及溶于緩沖液中的O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和賦形劑，
所述賦性劑包含選自多元醇和蛋白中的任意一種或多種，或者它們的組合，并且所述R1凍干品成分與R2凍干品成分中的賦形劑彼此相同或不同，所述各穩(wěn)定劑彼此相同或不同，所述各緩沖液彼此相同或不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述賦性劑進(jìn)一步含有糖類或多聚糖類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，所述賦形劑為蛋白和其它物質(zhì)的混合物，其混合質(zhì)量比為0.1～10∶1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述多元醇為選自山梨醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚糖醇和聚乙二醇中的一種或多種，優(yōu)選為選自甘露醇、木糖醇和聚乙二醇中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項所述的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述蛋白為選自脫脂牛奶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、馬血清白蛋白、牛γ球蛋白、魚精蛋白和大豆白蛋白中的一種或多種，優(yōu)選為選自牛血清白蛋白、卵清蛋白和魚精蛋白中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項所述的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述賦性劑進(jìn)一步含有選自葡聚糖、可溶性淀粉、環(huán)糊精、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、阿拉伯膠和果膠中的一種或多種，優(yōu)選進(jìn)一步含有選自葡聚糖和羥乙基纖維素中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項所述的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，所述R1復(fù)溶液成分包含濃度為20-800mmol/L的緩沖液，在該R1復(fù)溶液成分中，基于該R1復(fù)溶液成分，所述穴醚或冠醚的含量為0.5-30mmol/L，所述穩(wěn)定劑的含量為0.5-100mmol/L；所述R1凍干品成分包括濃度為10-100mmol/L的緩沖液，在該R1凍干品成分中，基于該R1凍干品成分，所述β-半乳糖苷酶的含量為500-150000U/L，所述穩(wěn)定劑的含量為0.5-100mmol/L，所述賦形劑的含量為0.5-30質(zhì)量％；
所述R2復(fù)溶液成分包含濃度為0.5-100mmol/L的緩沖液；所述R2凍干品成分包括10-100mmol/L的緩沖液，在該R2凍干品成分中，基于該R2凍干品成分，所述O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量為2.5-150mmol/L，所述賦形劑的含量為0.5-5質(zhì)量％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項所述的血清鈉離子酶法定量測定試劑盒，其中，
所述R1復(fù)溶液成分包含濃度為50-500mmol/L的緩沖液，在該R1復(fù)溶液成分中，基于該R1復(fù)溶液成分，所述穴醚或冠醚的含量為0.5-20mmol/L，所述穩(wěn)定劑的含量為0.5-50mmol/L；所述R1凍干品成分包括濃度為20-50mmol/L的緩沖液，在該R1凍干品成分中，基于該R1凍干品成分，所述β-半乳糖苷酶的含量為1000-80000U/L，所述穩(wěn)定劑的含量為0.5-50mmol/L，所述賦形劑的含量為2-15質(zhì)量％；
所述R2復(fù)溶液成分包含濃度為10-50mmol/L的緩沖液；所述R2凍干品成分包括20-50mmol/L的緩沖液，在該R2凍干品成分中，基于該R2凍干品成分，所述O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量為10-100mmol/L，所述賦形劑的含量為1-3質(zhì)量％。
9.一種制備權(quán)利要求1～8中任一項所述血清鈉離子酶法定量測定試劑盒的方法，其特征在于，分別配制R1復(fù)溶液成分、R1凍干品成分、R2復(fù)溶液成分和R2凍干品成分，其中，
配制所述R1復(fù)溶液成分的步驟包括在緩沖液中溶解穴醚或冠醚和穩(wěn)定劑；
配制R1凍干品成分的步驟包括在緩沖液中溶解β-半乳糖苷酶、穩(wěn)定劑和賦形劑，制成凍干品；
配制R2凍干品成分的步驟包括將0-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和賦形劑溶解于緩沖液中，制成凍干品。
10.一種使用血清鈉離子酶法定量測定試劑盒的檢測方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～8中任一項所述血清鈉離子酶法定量測定試劑盒凍干試劑的R1復(fù)溶液溶解R1凍干品得到RA，使RA中含有β-半乳糖苷酶的含量為100-10000U/L，R2復(fù)溶液溶解R2凍干品得到RB，使RB中含有O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量為1-20mmol/L，RA和RB的體積配比為1～10∶1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種血清鈉離子酶法定量測定試劑盒及其制造方法以及檢測方法，該試劑盒包括R1復(fù)溶液成分、R1凍干品成分、R2復(fù)溶液成分和R2凍干品成分，其中，所述R1復(fù)溶液成分包含緩沖液，以及溶解于該緩沖液中的穴醚或冠醚和穩(wěn)定劑；所述R1凍干品成分包括緩沖液，以及溶解于該緩沖液中的β-半乳糖苷酶、穩(wěn)定劑和賦形劑；所述R2復(fù)溶成分包括緩沖液；所述R2凍干品成分包括緩沖液，以及溶于緩沖液中的O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和賦形劑，所述賦性劑包含選自多元醇和蛋白中的任意一種或多種，或者它們的組合。該試劑盒，通過選擇適當(dāng)?shù)馁x性劑，使得該產(chǎn)品具有穩(wěn)定性高的特點，同時，凍干時對設(shè)備要求低。
文檔編號C12Q1/34GK101698880SQ200910090690
公開日2010年4月28日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司