專利名稱：：鑒定野牦牛遺傳資源親緣關(guān)系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鑒定野牦牛遺傳資源親緣關(guān)系的方法。
背景技術(shù)：
：牦牛是青藏高原地區(qū)最重要的家畜之一，家養(yǎng)牦牛對高海拔、低氣溫、少氧的高原生態(tài)環(huán)境有極好的適應(yīng)能力，為當(dāng)?shù)啬撩袢罕娞峁┗镜纳a(chǎn)和生活資料。由于自然和社會經(jīng)濟(jì)等條件的局限，經(jīng)營方式落后，飼養(yǎng)管理粗放，導(dǎo)致家養(yǎng)牦牛品種選育缺乏力度，其生產(chǎn)性能逐漸下降，甚至有明顯的退化，已不適應(yīng)高效畜牧業(yè)發(fā)展的要求。作為家養(yǎng)牦牛的祖先，野牦牛在體格大小，生長發(fā)育強(qiáng)度，抗逆性等方面有著明顯的優(yōu)勢，因此利用野牦牛育種，使得家養(yǎng)牦牛品種復(fù)壯一直是人們關(guān)注的內(nèi)容。然而，目前品種培育中所選用的野牦牛都是通過對一些形態(tài)特征的篩選而確定的，這些形態(tài)特征可能是由環(huán)境的影響造成的，并不能在后代中遺傳，使得難以依據(jù)形態(tài)特征對野牦牛的遺傳資源進(jìn)行鑒定。線粒體DNA(mtDNA)具有拷貝數(shù)高、分子量小、無組織特異性、進(jìn)化速度快等特點，在遺傳上具有自主性，是嚴(yán)格的母系遺傳。D-loop是線粒體DNA中變異速率最快的一個片段，研究發(fā)現(xiàn)，D-loop的堿基替換速率比ratDNA分子的其它區(qū)域高5-10倍。這一片段具有很多的信息位點，在揭示種內(nèi)不同個體之間遺傳差異方面有廣泛的應(yīng)用，利用mtDNAD-loop堿基突變來鑒定不同群體、個體的親緣關(guān)系已經(jīng)在豬、黃牛、馬等多種家畜中開展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種鑒定野牦牛遺傳資源親緣關(guān)系的方法。本發(fā)明保護(hù)一對鑒定牦牛親緣關(guān)系的專用引物，是序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對。所述專用引物在制備鑒定牦牛親緣關(guān)系的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定牦牛親緣關(guān)系的試劑盒，它包括所述專用引物。除了所述專用引物，所述試劑盒還可包括PC財廣增的常規(guī)試劑，如緩沖液、dNTP、Taq酶等。所述專用引物和所述試劑盒在鑒定牦牛親緣關(guān)系中的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述牦牛具體可為野牦牛。本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定牦牛親緣關(guān)系的方法，包括如下步驟(1)提取待測牦牛的總DNA;(2)以步驟(1)提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增的引物為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對(Floop和Rloop);(3)通過PC財廣增產(chǎn)物的核苷酸序列鑒定牦牛的親緣關(guān)系。所述牦牛具體可為野牦牛。所述動物總DNA的提取方法可為標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿法。所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體可如下雙蒸水23.lul;10Xtris-HCl緩沖液(pH8.3，500mMKC1，15raMMgCl2)3ul;dNTP(2.5mM)0.7ul;上游引物和下游引物各lul;Taq酶(5U/ul)0.2ul;DNA模板lul(50ng)。所述PCR擴(kuò)增的程序具體可為95°C--4分鐘；然后以95。C—55秒，5(TC—55秒，72°C--55秒，循環(huán)35次；最后在72。C保溫5分鐘。所述專用引物、所述試劑盒或所述方法均可應(yīng)用于牦牛遺傳資源鑒定。本發(fā)明針對線粒體D-loop設(shè)計了一對專用引物，該專用引物可以分析野牦牛與家牦牛的親緣關(guān)系，從而對野牦牛的遺傳資源進(jìn)行鑒定，避免了利用形態(tài)學(xué)原理進(jìn)行鑒定時存在的證據(jù)不足等問題，因而能夠?qū)σ瓣笈５倪z傳資源進(jìn)行更加合理、準(zhǔn)確的鑒定。圖l為鑒定牦牛親緣關(guān)系的流程圖。圖2為123條線粒體D-loop序列所構(gòu)建的ML樹的示意圖。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。47個野牦牛樣品、407個家牦牛樣本;Wiener,G.，Han，J.L.&Long,R.J.(2003)7Te2ndedition.TheRegionalOfficeforAsiaandthePacific,FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNations,Bangkok,Thailand.4實施例l、野牦牛親緣關(guān)系的鑒定對47個野牦牛和407個家牦牛分別進(jìn)行D-loop測定，每個樣品測定步驟如下1、利用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿法對野牦牛(或家牦牛)組織進(jìn)行總DNA提?。?、對步驟1提取的總DNA進(jìn)行PC財廣增。PCR擴(kuò)增的引物對正向引物(Floop):5，-TGTAAAGAGCCTCACCAGT-3，；反向引物(Rlo叩)5，-GATGCAGTTAAGTCCAGCT-3，。PCR擴(kuò)增體系:雙蒸水23.lul;10Xtris-HCl緩沖液(pH8.3，500mMKCl，15raMMgCl2)3ul;dNTP(2.5mM)0.7ul;引物Floop(10uM)lul;引物Rlo叩(10uM)lul;Taq酶(5U/ul)0.2ul;DNA模板lul(50ng)。PCR擴(kuò)增程序:95。C一4分鐘;然后以95°C--55秒，50°C--55秒，72°C--55秒，循環(huán)35次；最后在72"C保溫5分鐘。3、將步驟2擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物利用天根公司生產(chǎn)的普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。4、利用測序儀對純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序獲得一段核苷酸序列。47個野牦牛和407個家牦牛樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果見表1。表147個野牦牛和407個家牦牛樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>然法(maximumlikelihood)構(gòu)建系統(tǒng)樹，進(jìn)行親緣關(guān)系分析。根據(jù)親緣分析的結(jié)果可以判定野牦牛的資源是否對牦牛的育種具有重要的遺傳價值。在野牦牛中檢測到29個單倍型，在家牦牛中檢測到99個單倍型，其中5個單倍型由野牦牛和家牦牛共享，這樣在所有牦牛的序列中(452條)共檢測到123個單倍型，將這123個單倍型一次標(biāo)注為hapl-hapl23(單倍型對應(yīng)的序列見表1)，hapl-hap29為野牦牛中檢測到的單倍型。以牦牛近緣物種北美野牛(Bisonbison)的D-loop序列(GenBankAccessionN咖ber:U12936)作為外類群，對所有樣品中檢測到的單倍型(123個)構(gòu)建ML系統(tǒng)樹，結(jié)果如圖2所示。圖中hap8、hapl5、hapl6、hapl8和hap24為野牦牛和家牦牛共享的單倍型，這些共享的單倍型表明擁有這些單倍型的野牦牛個體與家牦牛之間的親緣關(guān)系很近，其遺傳資源在育種過程中沒有重要的意義；從圖中還可以看出，部分野牦牛的單倍型與家牦牛的單倍型混雜在一起(如hap9、hap10、hap20、h即23、hap27等等)，說明這些野牦牛與家牦牛的親緣關(guān)系較近，這些野牦牛具有一定的遺傳資源；從圖中也可以發(fā)現(xiàn)一些由完全野牦牛單倍型組成的小分支，如hapl和hap凹形成的分支A、hap6、hapl2和hapl4形成的分支C以及hap5、h即25和hap26形成的分支E，同時在一些大的分支的基部我們可以發(fā)現(xiàn)一些野牦牛的單倍型，如箭頭B、D和F分別指向的hap7、hap22和hap3，這些野生牦牛的單倍型與家牦牛的單倍型之間的遺傳距離很大，具有很重要的遺傳資源，在家牦牛的育種方面有著非常重要的價值，特別是hapl和hap29形成的分支A，這一分支位于系統(tǒng)樹的基部位置，與家牦牛單倍型之間的遺傳距離特別大，表明這一分支所包括的野牦牛與家牦牛之間存在著很大的遺傳差異，具有非常重要的遺傳資源。從以上示例可以看出，應(yīng)用線粒體D-loop能夠揭示野牦牛與家牦牛之間親緣關(guān)系，從而能夠?qū)σ瓣笈５倪z傳資源進(jìn)行合理、準(zhǔn)確的鑒定，對家牦牛的育種工作具有重要的指導(dǎo)意義。序列表<110>蘭州大學(xué)〈120〉鑒定野牦牛遺傳資源親緣關(guān)系的方法〈130〉CGGNARY92500<160>32<210>1〈211〉19<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉<400>1tgtaaagagcctcaccagt19<210>2<211>19<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉2gatgcagtt3叫tccagct〈210〉3<211〉618〈212〉DNA<213〉牦牛(Aosgr朋/7j'e"50〈400〉3aaaaattccaataactcaac￡icaaactttgactaacaacacacatccctaatgta^ta肌aacatactatgtatatagtatctctattaatt3tgtca^ctcactcttgaccatgccgcgtgsa^cc8gcaacccgctacatgaactgtgggggtcgctatttaatgaagccatctcacctaaaaccgtccattxtttcga^ctaatcstgcccatgctxacacataactgtgggggatgcttggactcagctatggccgtgctggacttaactgcatx<210>4〈211〉618<212>DNA<213>牦牛(Adxg_r"73/7ie/750<400>4a肌犯ttcc33tetactc犯c3ca^6ictttggctaac犯cacacatccccaa^肌tgcattatgtaataaeLgacatattatgtatateigtaaagtacataattcctattgatagtacataattatgtcagacctactcctaacaacatgta19tactctaaccaaatattacaaactccacta60gtccaaacgggggatacgtacataatatta120cattaaat"tatttaccccalgcatataagc180tacatg33gttattaatcgt240taccccttccactagatcacgagcttaatt300ggcaaaggactcctcttctcgctccgggcc360ctttatxagacatctggttctttcttcagg420ctcttaaataagacatctcg■tgctgtcatacatttggtatttttttatU540caaaggccccgacccggagcatxtattgta600618tactctaaccaaatattacaaacaccacta60gtccaaacgggggatacgtacataatatta120ca11asiattatatgccccatgcatataagc180tacatgaaattattaatcgtacataacata240taccccttccactagatcacgagcttawt300gtg犯3CC3gcaacccgctaggcggaggactcctcttctcgctccgggcc360catgaactgtgggggtcgctatttaatgaactttatcagacatctggttctttcttcagg420gccatctcacctaaaaccgtccactctttcctcttaaataagacatctcgatggactaat480ggctaatcagcccatgctcacacataactgtgctgtcatacatttggtatttttttattt540tgggggatgcttggactcagctatggccgtcaaaggccccgacccggagcatctattgta600gctggacttaactgcatc618<210>5〈211〉618〈212〉DNA<213〉牦牛(Sosgrw朋j'e/751)〈400〉5aaaaattccaataactcaacacaaactttgtactctaaccaaatattacaaactccacta60actaacaacacacatcccta犯犯tacattgtccaaacgggggatacgtacataatatta120atgt^taa^aacatactatgtatatagtac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