專利名稱：一種利用蔗糖水解物發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種持檬酸的生產(chǎn)方法，具體地說，涉及一種利用蔗 糖水解物進行發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法。
背景技術(shù)：
檸檬酸及其鈉鹽等是發(fā)酵行業(yè)的支柱產(chǎn)品之一，近年來，我國檸
檬酸生產(chǎn)規(guī)模飛速發(fā)展，杼檬酸及其鹽的年產(chǎn)量已達45萬噸，是有機 酸類發(fā)酵產(chǎn)品中產(chǎn)量最大的產(chǎn)品，其中80%出口囯外。我國檸檬酸生 產(chǎn)原料主要以糧食作為主，我國人多地少，糧食危機日益嚴重。檸檬 酸的原料長期供應(yīng)不足，特別時玉米供應(yīng)不足，檸檬酸的巿場價格將 會一直上升。
近年來，蔗糖產(chǎn)量呈逐年遞升趨勢，尤其是國外巿場上的蔗糖價 格以低于我國的淀粉糖價格。因此，開展蔗糖發(fā)酵檸檬酸技術(shù)的研究 對于減輕國內(nèi)檸檬酸生產(chǎn)用糧的壓力，保證糧食生產(chǎn)安全具有十分重 要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用蔗糖水解物進行發(fā)酵生產(chǎn)衧檬酸 的方法，該方法利用蔗糖水解物為原料，提高了糖酸代謝速率，縮短 了發(fā)酵周期，發(fā)酵液質(zhì)量得以明顯提高。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用蔗糖水解物發(fā)酵法生產(chǎn) 檸檬酸的方法，其釆用先將培養(yǎng)好的黑曲霉麩曲孢子在含9.5 ~ 10.5% 重量百分濃度蔗糖水解物的種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)成黑曲 霉液體種子；然后再經(jīng)含14~16%重量百分濃度蔗糖水解物的發(fā)酵培 養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
具體地說，其包括如下步驟1) 平板或斜面培養(yǎng)將檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉接種到麥芽汁瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)；
2) 麩曲培養(yǎng)然后將培養(yǎng)后的檸檬酸菌種黑曲霉接入一環(huán)黑曲
霉孢子，在麩曲種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)成麩曲孢子；
3) 種子培養(yǎng)再將含7~12%重量百分濃度蔗糖水解物的種子培
養(yǎng)基接入麩曲孢子，進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)成黑曲霉種子；
4) 發(fā)酵培養(yǎng)最后將培養(yǎng)好的黑曲霉種子接入含14~16%重量
百分濃度蔗糖水解物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
其中，本發(fā)明所述檸檬酸生產(chǎn)菌種為黑曲霉Co827。
所述蔗糖水解物為蔗糖在酸性條件下或酶的作用下水解產(chǎn)物，其組成為77~81%的葡萄糖，18~22%的果糖，0.8~1.2%的蔗糖。
步驟l)中，所述麥芽汁的濃度為2 4婆美度。
步驟2)中，所述麩曲種子培養(yǎng)基組成為麩皮20~30%，硫酸鎂0.01~0.02%，磷酸二氫鉀0.01 ~0.02%， pH自然,自來水配制。百分數(shù)(％)為重量百分數(shù)，以下同。
麩曲培養(yǎng)條件為37X:下培養(yǎng)7-10天。
步驟3)中，種子培養(yǎng)基的組成為蔗糖水解物9.5~10.5%，玉米漿0.5~1.0%，磷酸二氫鉀0.01 ~0.02%，硫酸銨0.01 ~0.02°/。,硫酸鎂0.01~0.02%, pH自然，自來水配制。
種子培養(yǎng)條件為37'C下通風(fēng)培養(yǎng)24 30小時。
步驟4)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蔗糖水解物14~16%,玉米漿0.5~1.0%，磷酸二氫鉀O.Ol ~0.02%，硫酸銨O.Ol-0.02%,硫酸鎂0.01 ~ 0.02。/0,pH自然，自來水配制。
本發(fā)明所述發(fā)酵培養(yǎng)所需碳源為蔗糖水解物；氮源為硫酸銨、玉米漿。
所述發(fā)酵溫度為35 ~ 39°C ， pH為2.5 ~ 6.0，通風(fēng)比為l:( 0.1 ~ 0.6 )，攪拌轉(zhuǎn)速為200 500rpm,培養(yǎng)70~85小時。本發(fā)明利用蔗糖水解物發(fā)酵法獲得的檸檬酸酸度達到ll ~ 14%，
糖酸轉(zhuǎn)化率大于89%。
本發(fā)明利用蔗糖水解物發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的方法，具有如下優(yōu)
點
1. 本發(fā)明對蔗糖水解物培養(yǎng)基進行了優(yōu)化；
2. 針對蔗糖水解物培養(yǎng)基中，除碳源以外的氮源和營養(yǎng)元素比 較貧乏，在實驗過程中利用在線控制手段，對檸檬酸發(fā)酵的培養(yǎng)基氮 源和營養(yǎng)元素進行了優(yōu)化，使得生產(chǎn)成本最低化，并建立起檸檬酸菌 種生長代謝過程與發(fā)酵過程模型化及控制技術(shù)；
3. 本發(fā)明利用蔗糖水解物中的葡萄糖及少量蔗糖和果糖為碳源 加入無機及有機氮源、各種營養(yǎng)元素，根據(jù)微生物在生長、代謝的不 同階段對氧氣、各種營養(yǎng)元素、各種碳源、氮源的需求差異，進行發(fā) 酵生產(chǎn)衧檬酸，發(fā)酵液質(zhì)量明顯提高，提高了糖酸代謝速率，縮短了 發(fā)酵周期，發(fā)酵液中蔗糖水解物發(fā)酵檸檬酸酸度達到11~14%,發(fā)酵 周期70 85小時，糖酸轉(zhuǎn)化率大于89%;對開辟檸檬酸生產(chǎn)原料多樣 化，尤其是國外巿場的開發(fā)具有積極意義。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實施例l
先將檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉孢子Co827接種到麥芽汁(濃度為4 婆美度)瓊脂平板上培養(yǎng)；采用平板培養(yǎng)的檸檬酸生產(chǎn)菌種在無菌狀 態(tài)下接入一環(huán)黑曲霉孢子到含麩皮30%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀 0.01%的麩曲種子培養(yǎng)基三角瓶中，37。C培養(yǎng)9天。將培養(yǎng)成熟的麩曲 孢子接入到含蔗糖水解物10.5% (其為蔗糖在酸性條件下或酶的作用 下水解產(chǎn)物，其組成為77%的葡萄糖，1%的蔗糖，22%的果糖)， 玉米漿0.6%,磷酸二氫鉀0.012%，硫酸銨0.01%,硫酸鎂0.01%的液 體種子培養(yǎng)基中，pH自然，自來水配制。37°C,通風(fēng)培養(yǎng)25小時。待液體種子培養(yǎng)好后，再接種到含蔗糖水解物14.3%,玉米漿0.5%，磷酸二氫鉀0.011%，硫酸銨0.01%，硫酸鎂0.012。/。的5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37X:, pH自然，無菌空氣以通風(fēng)比為l: 0.4的通風(fēng)速率通入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm,通風(fēng)培養(yǎng)81小時，殘還原糖1.08%,檸檬酸酸度達到11.59%,糖酸轉(zhuǎn)化率89.1%。實施例2
先將檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉孢子Co827接種到麥芽汁(濃度為4婆美度)瓊脂平板上培養(yǎng)；釆用平板培養(yǎng)的檸檬酸生產(chǎn)菌種在無菌狀態(tài)下接入一環(huán)黑曲霉孢子到含麩皮20%，硫酸鎂0.02%,磷酸二氫鉀0.01%的麩曲種子培養(yǎng)基三角瓶中，37。C培養(yǎng)10天。將培養(yǎng)成熟的麩曲孢子接入到含蔗糖水解物10.5% (其組成為78%的葡萄糖，0.9%的蔗糖，21.1%的果糖)，玉米漿0.6%，磷酸二氫鉀0.015°/。，硫酸銨0.02%,硫酸鎂0.013%的液體種子培養(yǎng)基中，pH自然，自來水配制。37°C,通風(fēng)培養(yǎng)28小時。待液體種子培養(yǎng)好后，再接種到含蔗糖水解物14.7%,玉米漿0.8%，磷酸二氫鉀0.015%,硫酸銨0.012%，硫酸鎂0.018。/。的5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為39。C， pH為5.5,無菌空氣以通風(fēng)比為h 0.4的通風(fēng)速率通入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，通風(fēng)培養(yǎng)79小時，殘還原糖1.03%,檸檬酸酸度達到11.99%,糖酸轉(zhuǎn)化率89.4%。實施例3
先將檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉孢子Co827接種到麥芽汁(濃度為4婆美度)瓊脂平板上培養(yǎng)；采用平板培養(yǎng)的檸檬酸生產(chǎn)菌種在無菌狀態(tài)下接入一環(huán)黑曲霉孢子到含麩皮30%，硫酸鎂0.014%，磷酸二氫鉀0.01%的麩曲種子培養(yǎng)基三角瓶中，37。C培養(yǎng)9天。將培養(yǎng)成熟的麩曲孢子接入到含蔗糖水解物(其組成為78%的葡萄糖，1.1%的蔗糖，20.9°/。的果糖)10.5°/。，玉米漿0.6%,磷酸二氫鉀0.01%,硫酸銨0.01%,硫酸鎂0.012。/。的液體種子培養(yǎng)基中，pH自然，自來水配制。37°C,通風(fēng)培養(yǎng)26小時。待液體種子培養(yǎng)好后，再接種到含蔗糖水解物
14.4%,玉米漿1.0%，磷酸二氫鉀0.014%,硫酸銨0.015%,硫酸鎂 0.012。/。的5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37。C， pH為4.5，無菌 空氣以通風(fēng)比為l: 0.3的通風(fēng)速率通入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌 轉(zhuǎn)速為200rpm，通風(fēng)培養(yǎng)76小時，殘還原糖0.85%，檸檬酸酸度達到 12.95%，糖酸轉(zhuǎn)化率89.2%。 實施例4
先將檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉孢子Co827接種到麥芽汁(濃度為4 婆美度)瓊脂平板上培養(yǎng)；釆用平板培養(yǎng)的檸檬酸生產(chǎn)菌種在無菌狀 態(tài)下接入一環(huán)黑曲霉孢子到含麩皮25%,硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀 0.02%的麩曲種子培養(yǎng)基三角瓶中，37。C培養(yǎng)9天。將培養(yǎng)成熟的麩曲 孢子接入到含蔗糖水解物10.5% (其組成為78.9%的葡萄糖，1.1% 的蔗糖，20%的果糖)，玉米漿0.6%,磷酸二氫鉀0.01°/。，硫酸銨0.018%， 硫酸鎂0.01。/。的液體種子培養(yǎng)基中，pH自然，自來水配制。37°C, 通風(fēng)培養(yǎng)29小時。待液體種子培養(yǎng)好后，再接種到含蔗糖水解物 14.5%,玉米漿0.6%,磷酸二氫鉀0.01%,硫酸銨0.02%,硫酸鎂0.01°/。 的5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為39t:， pH為4.0，無菌空氣以 通風(fēng)比為l: O.l的通風(fēng)速率通入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為 500rpm，通風(fēng)培養(yǎng)75小時，殘還原糖1.09%,杼檬酸酸度達到13.59%， 糖酸轉(zhuǎn)化率89.55%。 實施例5
先將檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉孢子Co827接種到麥芽汁(濃度為2 婆美度)瓊脂平板上培養(yǎng)；釆用平板培養(yǎng)的檸檬酸生產(chǎn)菌種在無菌狀 態(tài)下接入一環(huán)黑曲霉孢子到含麩皮30%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀 0.016%的麩曲種子培養(yǎng)基三角瓶中，37。C培養(yǎng)10天。將培養(yǎng)成熟的麩 曲孢子接入到含蔗糖水解物10% (其組成為79.8%的葡萄糖，1.2% 的蔗糖，19%的果糖)，玉米漿0.8%,磷酸二氫鉀0.016°/。，硫酸銨0.02%，
8硫酸鎂0.013%的液體種子培養(yǎng)基中，pH自然，自來水配制。37°C, 通風(fēng)培養(yǎng)30小時。待液體種子培養(yǎng)好后，再接種到含蔗糖水解物 15.3%，玉米漿0.9°/。，磷酸二氫鉀0.017%，硫酸銨0.01°/。，硫酸鎂0.016% 的50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為38", pH為6.0，無菌空氣以 通風(fēng)比為l: 0.3的通風(fēng)速率通入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為 400rpm，通風(fēng)培養(yǎng)78小時，殘還原糖0.88°/。，杼檬酸酸度達到13.66%， 糖酸轉(zhuǎn)化率89.33%。 實施例6
先將杼檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉孢子Co827接種到麥芽汁(濃度為4 婆美度)瓊脂平板上培養(yǎng)；采用平板培養(yǎng)的檸檬酸生產(chǎn)菌種在無菌狀 態(tài)下接入一環(huán)黑曲霉孢子到含麩皮30%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀 0.02%的麩曲種子培養(yǎng)基三角瓶中，37。C培養(yǎng)9天。將培養(yǎng)成熟的麩曲 孢子接入到含蔗糖水解物10.5% (其組成為80%的葡萄糖，0.8%的 蔗糖，19.2%的果糖)，玉米漿0.9%，磷酸二氫鉀0.015%,硫酸銨0.01%, 硫酸鎂0.016%的液體種子培養(yǎng)基中，pH自然，自來水配制。37°C, 通風(fēng)培養(yǎng)26小時。待液體種子培養(yǎng)好后，再接種到含蔗糖水解物 16.0%，玉米漿0.5%，磷酸二氫鉀0.014%，硫酸銨0.02%,硫酸鎂0.01% 的50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37X:, pH為2.5，無菌空氣以 通風(fēng)比為l: 0.6的通風(fēng)速率通入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為 400rpm，通風(fēng)培養(yǎng)77小時，殘還原糖1.15°/。，杼檬酸酸度達到13.7°/。， 糖酸轉(zhuǎn)化率89.29%。 實施例7
先將檸檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉孢子Co827接種到麥芽汁(濃度為4 婆美度)瓊脂平板上培養(yǎng)；釆用平板培養(yǎng)的檸檬酸生產(chǎn)菌種在無菌狀 態(tài)下接入一環(huán)黑曲霉孢子到含麩皮30%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀 0.01%的麩曲種子培養(yǎng)基三角瓶中，37。C培養(yǎng)7天。將培養(yǎng)成熟的麩曲 孢子接入到含蔗糖水解物9.5% (其組成為80%的葡萄糖，1.2%的蔗糖，18.8%的果糖)，玉米漿0.6%，磷酸二氫鉀0.018%，硫酸銨0.015%,硫酸鎂0.01%的液體種子培養(yǎng)基中，pH自然，自來水配制。37°C，通風(fēng)培養(yǎng)30小時。待液體種子培養(yǎng)好后，再接種到含蔗糖水解物15.1%，玉米漿0.8%,磷酸二氫鉀0.01%，硫酸銨0.02%，硫酸鎂0.019。/。的500L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37。C， pH為4.0,無菌空氣以通風(fēng)比為l: 0.3的通風(fēng)速率通入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm,通風(fēng)培養(yǎng)74小時，殘還原糖1.01%,檸檬酸酸度達到14.2°/。，糖酸轉(zhuǎn)化率89.7%。
雖然，上文中已經(jīng)用 一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用蔗糖水解物發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的方法，其特征在于，其采用先將培養(yǎng)好的黑曲霉麩曲孢子在含9.5～10.5％重量百分濃度蔗糖水解物的種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)成黑曲霉液體種子；然后再經(jīng)含14～16％重量百分濃度蔗糖水解物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)檸檬酸的方法，其特征在于，其包 括如下步驟1) 平板或斜面培養(yǎng)將杼檬酸生產(chǎn)菌種黑曲霉Co827接種到麥芽 汁瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)；2) 麩曲培養(yǎng)然后將培養(yǎng)后的檸檬酸菌種黑曲霉Co827接入一環(huán) 黑曲霉孢子，在麩曲種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)成麩曲孢子；3) 種子培養(yǎng)再將含9.5~10.5%重量百分濃度蔗糖水解物的種 子培養(yǎng)基接入麩曲孢子，進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)成黑曲霉種子；4) 發(fā)酵培養(yǎng)最后將培養(yǎng)好的黑曲霉種子接入到含14~16%重 量百分濃度蔗糖水解物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)檸檬酸的方法，其特征在于， 所述檸檬酸生產(chǎn)菌種為黑曲霉Co827。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l-3任意一項所述的生產(chǎn)檸檬酸的方法，其特征 在于，所述蔗糖水解物組成為77~81%的葡萄糖，18~22%的果糖， 0.8~ 1.2%的應(yīng)糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4任意一項所述的生產(chǎn)杼檬酸的方法，其特征 在于，步驟3)中，種子培養(yǎng)基的組成為蔗糖水解物9.5~10,5%， 玉米漿0.5~1.0%，磷酸二氫鉀0.01 ~0.02%，硫酸銨0.01 ~0.02%，硫 酸鎂O.Ol-0.02%, pH自然，自來水配制。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)梓檬酸的方法，其特征在于，所述 種子培養(yǎng)條件為37°C下通風(fēng)培養(yǎng)24 ~ 30小時。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l-6任意一項所述的生產(chǎn)檸檬酸的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蔗糖水解物14~16%，玉米漿0.5~1.0%， 磷酸二氫鉀0.01 ~ 0.02%,硫酸銨0.01 ~ 0.02%，硫酸鎂0.01 ~ 0.02%， pH自然，自來水配制。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)梓檬酸的方法，其特征在于，所述 發(fā)酵溫度為35 39。C, pH為2.5 6.0，通風(fēng)比為1: ( 0.1 ~ 0.6 )，攪拌 轉(zhuǎn)速為200 500rpm，培養(yǎng)70-85小時。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3-8任意一項所述的生產(chǎn)檸檬酸的方法，其特征 在于，步驟2)中，所述麩曲種子培養(yǎng)基組成為麩皮20~30%，硫 酸鎂O.Ol ~ 0.02%，磷酸二氫鉀O.Ol ~0.02%， pH自然，自來水配制， 所述麩曲培養(yǎng)條件為37。C下培養(yǎng)7 10天。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蔗糖水解物發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的方法，該方法利用蔗糖水解物中的葡萄糖及少量蔗糖和果糖為碳源加入無機及有機氮源、各種營養(yǎng)元素進行發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。本發(fā)明對發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基的氮源進行了優(yōu)化，使得生產(chǎn)成本最低化。本發(fā)明利用蔗糖水解物為原料，發(fā)酵液質(zhì)量明顯提高，對開辟檸檬酸生產(chǎn)原料多樣化，尤其是國外市場的開發(fā)具有積極意義。
文檔編號C12P7/48GK101638674SQ20091009161
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者松 付, 尚海濤, 李榮杰, 穆曉玲, 薛培儉, 輝 鄭 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司