專利名稱：一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物和化學原料制備深海魚油營養(yǎng)物質(zhì)替代物的方 法，特別是涉及一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，二十碳五烯酸(EPA)、 二十二> 灰六烯酸(DHA)等多不飽 和脂肪酸(PUFA)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、預(yù)防心腦血管疾病、抗炎免疫、抗癌、 維護視網(wǎng)膜健康等方面可以發(fā)揮重要作用。而PUFA不能由人體合成，因此， 現(xiàn)有技術(shù)多是將深海魚油中的多不飽和脂肪酸甘油三酯提取并制成保健 品、藥品等再補充到人體。隨著我國心腦血管疾病發(fā)病率的逐年升高，多 不飽和脂肪酸甘油三酯的開發(fā)和推廣應(yīng)用，對于改善我國人民健康，延長 壽命具有重要作用和深刻的社會效益。目前，我國市場上EPA和DHA產(chǎn)品 主要以其乙酯形式應(yīng)用，其特點是制備工藝成熟，但該形式產(chǎn)品存在著功 能上的缺陷
1、 乙酯型魚油脂肪酸被小腸吸收進入人體后易作為供能的物質(zhì)基礎(chǔ)而 被氧化，影響了魚油的保健功效。
2、 乙酯型產(chǎn)品在胃腸道分解成形成乙醇，對乙醇耐受性差的人易引起 一些不良反應(yīng)，如過敏癥，尤其是不適宜兒童。
3、 長期以脂肪酸、乙醇為膳食來源，易引起人體內(nèi)甘油的缺失或不足， 從而拉動人體糖代謝，這樣易造成人體內(nèi)糖代謝的不平衡而產(chǎn)生一定的副 作用。
天然甘油三酯型魚油吻合了人們的吸收機能，是人體吸收魚油的最佳 形式。國際市場對EPA和DHA的需求主要是多不飽和脂肪酸乙酯混合物及 甘油酯形式，其制備工藝復(fù)雜，但是技術(shù)含量大大增加，產(chǎn)品價值很高。
石紅旗、劉澄凡等研究了脂肪酶催化水解法制備多不飽和脂肪酸甘油
背景技術(shù)：
酯產(chǎn)品的工藝方法，以國產(chǎn)解脂假絲酵母(Candida lipalytica Lipase) 脂肪酶為菌種，在選定脂肪酶的情況下，試驗了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、酶 用量、油水比、乳化劑種類等影響水解反應(yīng)的主要因素，提出了魚油水解 的適宜條件為脂肪酶用量300u/g油，乳化劑為Ca(0H)2,油水比為0. 4mL/g油，45。C下攪拌12h。用本工藝制得的富含DHA的甘油酯產(chǎn)品中，DHA 和EPA含量分別為34. 0 %和13. 9 % ，總含量為47. 9 % 。
吳可克研究了假絲酶母脂肪酶催化魚選擇性水解反應(yīng)，確定了油水 比、脂肪酶濃度、反應(yīng)溫度、pH、激活劑、溶劑、反應(yīng)時間、水解率等因 素對反應(yīng)的影響，同時對魚油水解產(chǎn)物進行了分離和檢測，使EPA、 DHA在 甘油脂型產(chǎn)品中含量達到50%以上。
上述的多不飽和脂肪酸甘油三酯的制造方法，雖可制備出具有較好功 效的多不飽和脂肪酸甘油三酯產(chǎn)品，確實具有進步性，但是在實際使用時 卻發(fā)現(xiàn)其工藝過于復(fù)雜，甘油三酯酶催化生產(chǎn)過程中酶試劑的成本較高 高、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較低且分離純化比較困難，因而未能達到最佳的使用效果。
由此可見，上述現(xiàn)有的多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法顯然仍存 在有不便與缺陷，而亟待加以進一步改進。如何能創(chuàng)設(shè)一種工藝比較簡單， 成本較低且反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高的新的多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 實屬當前的重要研究課題之一，也是當前業(yè)界極需改進的目標。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有的多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法 存在的缺陷，而提供一種新型結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，
所要解決的技術(shù)問題是使其工藝比較簡單，成;^低且反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高，從 而更加適于實用。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。依據(jù) 本發(fā)明提出的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:酶 的制備，即對酵母菌培養(yǎng)、發(fā)酵獲得發(fā)酵液；發(fā)酵液的分離純化，獲得酶 濃縮液；酶的固定化，即先將載體加入酶濃縮液中并進行孵育，再經(jīng)清洗 獲得固化酶；酯交換反應(yīng)，即丙三醇與多不飽和脂肪酸乙酯在固化酶作用 下反應(yīng)，制得甘油三酯；甘油三酯的提純。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施進一步實現(xiàn)。 前述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所述的酯交換反應(yīng)
是指在間歇式酶反應(yīng)器中加入質(zhì)量比1:6-8:0.6-0.7的丙三醇、多烯酸 乙酯與固化酶，并加入占丙三醇、多烯酸乙酯與固化酶總質(zhì)量8%的油酸鉀 作為均相化試劑，溫度為25-30°C,初始水活度為0.40-0. 50，反應(yīng)6-8h 制得甘油三酯。
前述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所迷的酶的固定化 包括按照酶液活力與載體質(zhì)量比為8000: 1 U/g，把載體加入酶濃縮液中； 在20-3(TC、搖床反應(yīng)器80r/min轉(zhuǎn)速下、孵育8-10h固定化；吸去酶液， 用pH8. 0 0. lmol/L的磷酸緩沖液清洗，所得固化酶于4 。C保存。
前述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所迷的載體經(jīng)以下 方法制得混合體積比為1: 0. 4-0. 5: 0. 7-0. 8: 0. 7-0. 8的甲基丙烯酸縮水 甘油酯、二乙烯基苯、曱苯和正庚烷，以10g/L的比例將粒徑小于80認 的納米碳酸釣加入上迷混合液中，并置于攪拌器中反復(fù)攪拌混合，再置于 65。C恒溫反應(yīng)器中反應(yīng)12h;所得固體經(jīng)粉碎后，篩分收集0. 3-0. 45mm粒 徑的顆粒，用乙醇抽提20-24h,然后用0. lmol/L的HC1于常溫、攪拌狀 態(tài)下浸泡70-72h，并且每隔24 h換1次HC1;最后用去離子水沖洗至中性， 制得的載體密封濕態(tài)保存。
前述的 一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所述的酶的固定化 之前，還包括載體的活化步驟，即將載體于65。C下用0.1 mol/L HC1水解 12h;用去離子水沖洗至中性，以每2. 0kg栽體加入100L10"/。的戊二醛酸性 溶液的比例，在室溫下于反應(yīng)器中攪拌反應(yīng)12h;用去離子水洗去戊二醛， 所得載體置于4'C保存。
前述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所迷的酶的制備包 括以下步驟將酵母菌在斜面培養(yǎng)基上活化4小時；以體積百分比10°/。的接 種量接種至裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，種子培養(yǎng)基初始pH為 5,0，培養(yǎng)溫度25-30。C，再置于HYG-II型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶拒中，轉(zhuǎn)速 220r/min,培養(yǎng)時間為20h;把種子培養(yǎng)液按體積分數(shù)10%的接種量接種至 裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度28-30。C,攪拌轉(zhuǎn)速300r/min,通 氣量4. 0L/min, pH為6. 0，發(fā)酵時間28h。
前述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所述的斜面培養(yǎng)基
7為YPD培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基的成分為2g/L的酵母膏、5g/L的豆油、1 g/L 的K2HP04、 0. 1 g/L的MgS04 7H20、以及0. 5 g/L的NaCl;發(fā)酵培養(yǎng)基 的成分為3g/L的酵母膏、20g/L的豆油、lg/L的K2HP04、 0. lg/L的 MgS04 7H20、以及O. 5g/L的NaCl。
前述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所述的發(fā)酵液的分 離純化是指將發(fā)酵液經(jīng)5000rpni離心30min，室溫下，用截留分子量為 20000的PU-20K-PS管式超濾膜系統(tǒng)處理，膜面積為0. 186ffl2，膜前壓力為 1.2MPa，膜后壓力為0. 15MPa， pH為6. 0~7. 0，分離獲得酶濃縮液。
前迷的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所述的甘油三酯的 提純是指酯交換反應(yīng)結(jié)束后，在攪拌狀態(tài)下滴入占物料質(zhì)量O. 96%的濃度 為85%的濃H3P04,維持攪拌35min;所得的混合物在釜溫16(TC、真空度 0. 5-0. 7Pa下分子蒸餾5-7h;殘留物加入2%的活性炭脫色，在氮氣保護下 加熱至110-120°C，擅:拌30-40min后，冷卻至室溫；板框抽濾除去活性炭、 磷酸鹽后得到多不飽和脂肪酸甘油三酯。
前述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，所述的酵母菌為假 絲酵母菌種。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比至少具有以下明顯的優(yōu)點和有益效果本發(fā)明 一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，工藝比較簡單，成本較低且反 應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高，對我國魚類資源的充分利用和推動海洋藥物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都 有重要的意義，并具有可觀的經(jīng)濟效益，在實用性及成本效益上，完全符 合產(chǎn)業(yè)發(fā)展所需，相當具有產(chǎn)業(yè)利用價值。
綜上所述，本發(fā)明一種多不^t包和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，工藝比 較簡單，成本較低且反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高。本發(fā)明具有上迷諸多優(yōu)點及實用價 值，較現(xiàn)有技術(shù)有較大的改進和顯著的進步，從而更加適于實用，并具有 廣泛的產(chǎn)業(yè)利用價值。
上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的 技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實施，并且為了讓本發(fā)明的上述和 其他目的、特征和優(yōu)點能夠更明顯易懂，特舉較佳實施例詳細說明如下。
具體實施方式
為更進一步闡述本發(fā)明為達成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功
效，以下結(jié)合4交佳實施例，詳細說明本發(fā)明一種多不飽和脂肪酸甘油三酯 的生產(chǎn)方法的具體實施方式
、生產(chǎn)方法、步驟、特征及其功效。
本發(fā)明一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法包括以下步驟 步驟一，酶的制備，即對酵母菌培養(yǎng)、發(fā)酵獲得發(fā)酵液。
具體來說，酶的制備包括以下步驟 將酵母菌再斜面培養(yǎng)基上活化4小時；
以體積百分比10%的接種量接種至裝有l(wèi)OOmL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶 中，種子培養(yǎng)基初始pH為5. 0,培養(yǎng)溫度25-3(TC,再置于HYG-II型回轉(zhuǎn) 式恒溫調(diào)速搖瓶拒，轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時間為20h;
把種子培養(yǎng)液按體積分數(shù)10%的接種量接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵 罐中，培養(yǎng)溫度28-30匸，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量4. OL/min, pH為 6. 0,發(fā)酵時間28h。
較佳的，酵母菌選用假絲酵母菌種(Candida sp. , YGB03-02,北京禹 光生物科學研究中心保藏和提供)；斜面培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(Yeast Extract P印tone Dextrose Medium,酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基)；種子 培養(yǎng)基的成分為2g/L的酵母膏、5g/L的豆油、1 g/L的K2HP04、 0.1 g/L 的MgS04 7H20、以及0. 5 g/L的NaCl;發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為3g/L的酵母 膏、20g/L的豆油、lg/L的K2HP04、 0. lg/L的MgS04 7H20、以及0. 5g/L的 NaCl。
步驟二，發(fā)酵液的分離純化，獲得酶濃縮液。
具體來說，是將發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心30min,室溫下，用截留分子量 為20000的PU-20K-PS管式超濾膜系統(tǒng)處理，膜面積為0. 186m2,調(diào)節(jié)膜前 壓力為l. 2MPa,膜后壓力為0. 15MPa， pH為6. 0 ~ 7. 0,分離獲得酶濃縮液。
步驟三，酶的固定化，即先將載體加入酶濃縮液中并進行孵育，再經(jīng) 清洗獲得固化酶。
其中，栽體是通過以下方法制得混合體積比為 1: 0. 4-0. 5: 0. 7-0. 8: 0. 7-0. 8的曱基丙烯酸縮7jc甘油酯，二乙烯基苯，甲苯 和正庚烷，以10g/L的比例將粒徑小于80 nni的納米^灰酸鉀加入上述混合 液中，并置于攪拌器中反復(fù)攪拌混合，再置于65。C恒溫反應(yīng)器中反應(yīng)12h。
9所得固體經(jīng)粉碎后，篩分收集0. 3-0. 45mm粒徑的顆粒，用乙醇抽提20-24h， 然后用適量的0.1 mol/L HC1于常溫、攪拌狀態(tài)下浸泡70-72h，并且每隔 24h換l次HCl，以除去碳酸釣。最后用去離子水沖洗至中性。制得的載 體密封濕態(tài)保存。
酶的固定化之前，先將載體活化，具體操作方法為將載體于65。C下 用0.1 mol/L HC1水解12h。用去離子水沖洗至中性，以每2. 0kg載體加 入100L 10°/ 的戊二醛酸性溶液的比例，在室溫下于反應(yīng)器中攪拌反應(yīng)12h。 用去離子水洗去戊二醛，所得載體置于4。C保存待用。
酶的固定化的具體反應(yīng)條件為按照酶液活力與載體質(zhì)量比為8000:1 (U/g)，把載體加入酶濃縮液中。在20-30。C、搖床反應(yīng)器80r/min轉(zhuǎn)速下、 孵育8-10h。吸去酶液，用pH8. 0 0. lmol/L的磷酸緩沖液清洗，直到洗液 以考馬斯亮藍法判斷不含蛋白、即不含脂肪酶為止。所得固化酶于4XM呆 存。
步驟四，酯交換反應(yīng)，即丙三醇與多不飽和脂肪酸乙酯在固化酶作用 下反應(yīng)，制得甘油三酯。
具體是指，在間歇式酶反應(yīng)器中加入質(zhì)量比1: 6-8: 0. 6-0. 7的丙三醇、 多烯酸乙酯與固化酶，并加入占丙三醇、多烯酸乙酯與固化酶總質(zhì)量8°/。的 油酸鉀作為均相化試劑，溫度為25-30°C，初始水活度為0. 40-0.50,反應(yīng) 時間為6-8h，根據(jù)以下反應(yīng)式制得甘油三酯
CH2—OH CH2"RJFA
3d-CHHWA +"H風(，—,+ 3CH3CH20H
te—OH 0H2—Pl)FA 。
步驟五，甘油三酯的提純。
具體是指，在酯交換反應(yīng)結(jié)束后，在攪拌狀態(tài)下滴加入占物料質(zhì)量 0. 96%的濃度為85%的濃1^04，維持攪拌35min。此時，加入的磷酸與油酸 鉀形成磷酸鹽析出，將上述反應(yīng)所得的混合物進行分子蒸餾，蒸餾條件為 著溫16(TC，真空度O. 5-0. 7Pa,蒸餾5-7h。殘留物加入2%的活性炭脫色， 在氮氣保護下加熱至110-120°C，攪拌維持30-40min后，冷卻至室溫。板 框抽濾除去活性炭、磷酸鹽后得到黃色澄清的多不飽和脂肪酸甘油三酯。
以下，例舉部分具體實施例，以對本發(fā)明生產(chǎn)方法的具體步驟做進一 步說明。實施例1
步驟一，酶的制備
菌種假絲酵母菌種(Candida sp. ) YGB03-02，北京禹光生物科學研 究中心保藏和提供；
斜面培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基(g L—1):酵母膏2,豆油5， K2HP04 1， MgSO, 7H20 0. 1, NaCl 0. 5。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g L—1):酵母膏3,豆油20, K2HP04 1, MgS04 7H20 0. 1, NaCl 0. 5。
斜面種子活化4小時后，以體積分數(shù)10%的接種量接種至裝有100mL種 子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，培養(yǎng)基初始pH為5. 0，培養(yǎng)溫度25。C， HYG-II 型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖并瓦枉，轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時間為20h。把種子培養(yǎng) 液按體積分數(shù)10%的接種量接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度 28°C,攪拌轉(zhuǎn)速300r/min,通氣量4. OL/min, pH為6. 0,發(fā)酵時間28h。
步驟二，發(fā)酵液的分離純化
發(fā)酵液經(jīng)5000rpra離心30min,室溫下，用截留分子量為20000的 PU-20K-PS管式超濾膜系統(tǒng)處理，膜面積為0. 186m2。調(diào)節(jié)膜前壓力為 1. 2MPa，膜后壓力為0. 15MPa， pH為6. 0。
步驟三，酶的固定化
3. 1載體的制備
稱取曱基丙烯酸縮水甘油酯，二乙烯基苯，曱苯和正庚烷，使它們的 體積比為1: 0. 4: 0. 7: 0. 7，稱取納米碳酸鈞(粒徑小于80 nm)，以10g/L的 比例與上述液體一起放于攪拌器中，反復(fù)攪拌混合后，置于65。C恒溫反應(yīng) 器中反應(yīng)12h。所得固體經(jīng)粉碎后，篩分收集O. 3隱粒徑的顆粒，用乙醇抽 提20h,然后用適量的0.1 mol/L HC1于常溫、攪拌狀態(tài)下浸泡70h，并且 每隔24h換l次HCl，以除去碳酸釣，最后用去離子水沖洗至中性，密封 濕態(tài)保存。
3. 2載體的活化
載體于65。C下用0.1 mol/L HC1水解12h，用去離子水沖洗至中性，以每2. Okg載體加入100L 10%的戊二醛酸性溶液，室溫下于反應(yīng)器中攪拌 反應(yīng)12h，用去離子水洗去戊二醛，所得載體置于4T保存。
3. 3酶的固定化
把載體加入酶濃縮液，室溫下，在搖床反應(yīng)器中80r/min轉(zhuǎn)速下，孵育 8h,吸去酶液，用pH8. O磷酸緩沖液(O. lmol/L)清洗固定化酶載體，直到洗 液中不含脂肪酶為止，所得固化酶于4。C保存。
其中，固定化條件為溫度20。C、固定化時間8h、酶液活力與載體質(zhì)量 比為8000:1 (U/g)。
步驟四，酯交換反應(yīng)
在間歇式酶反應(yīng)器中加入丙三醇、多烯酸乙酯與固化酶，質(zhì)量比為1: 6: 0. 6，再加入占物料質(zhì)量8%的油酸鉀作為均相化試劑，反應(yīng)時間為6h,溫 度為25'C，初始水活度為0. 40。
步驟五，甘油三酯的提純
酯交換反應(yīng)結(jié)束后，在攪拌狀態(tài)下滴加入85%的濃H3P04，維持攪拌 35min，此時，加入的磷酸與油酸鉀形成磷酸鹽析出，將上述反應(yīng)所得的混 合物進行分子蒸餾，蒸餾條件釜溫16(TC,真空度O. 5Pa,蒸餾5h,殘留 物加入2%的活性炭脫色，在氮氣保護下加熱至ll(TC，撹拌，維持30min， 冷卻至室溫。板框抽濾除去活性炭、磷酸鹽后得到黃色澄清的多不飽和脂 肪酸甘油三酯。
以下通過試驗測定本實施例制得產(chǎn)品的性能
(1)以甘油測定試劑盒測定丙三醇的含量，將本實施例制得的產(chǎn)品中 丙三醇的含量記為b，反應(yīng)前丙三醇的量記為a,才艮據(jù)爿>式v= (a-b)/a算得 甘油酯的轉(zhuǎn)化率為67. 6%，且產(chǎn)品多不飽和脂肪酸甘油三酯連續(xù)生產(chǎn)性能穩(wěn) 定。
(2 )以分子排阻色譜法測定多不飽和脂肪酸甘油三酯產(chǎn)品中單酸和二 酸甘油酯含量為43%。
(3)以多不飽和脂肪酸甘油三酯中EPA和DHA的氣相色i普測定方法，測 定二者總含量為52%。
實施例2步驟一，酶的制備
菌種假絲酵母菌種(Candida sp. ) YGB03-02，北京禹光生物科學研 究中心保藏和提供；
斜面培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基(g L—1):酵母膏2，豆油5， K2HP04 1， MgS04 7H20 0. 1， NaCl 0.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g l/1):酵母膏3，豆油20， K2HP04 1, MgS04 7H20 0. 1， NaCl 0.5。
斜面種子活化4小時后，以體積分數(shù)10%的接種量接種至裝有l(wèi)OOmL種 子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，培養(yǎng)基初始pH為5. 0，培養(yǎng)溫度28°C, HYG-II 型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖弁瓦拒，轉(zhuǎn)速220r/min,培養(yǎng)時間為20h。把種子培養(yǎng) 液按體積分數(shù)10%的接種量接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度 29°C,攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量4. 0L/min， pH為6. 0，發(fā)酵時間28h。
步驟二，酶的分離純化
發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心30min，室溫下，用截留分子量為20000的 PU-20K-PS管式超濾膜系統(tǒng)處理，膜面積為0. 186m2。調(diào)節(jié)膜前壓力為 1. 2MPa,膜后壓力為0. 15MPa， pH為6. 5。
步驟三，酶的固定化
3. 1載體的制備
稱取甲基丙烯酸縮水甘油酯，二乙烯基苯，曱苯和正庚烷，使它們的 體積比為1: 0. 45: 0. 75: 0. 75,稱取納米石灰酸4丐(粒徑小于80 nm)，以1%的 比例與上述液體一起放于攪拌器中，反復(fù)攪拌混合后，置于65。C恒溫反應(yīng) 器中反應(yīng)12h。所得固體經(jīng)粉碎后，篩分收集0. 3-0. 45mm粒徑的顆粒，用 乙醇抽提22h，然后用適量的0. lmol/LHCl于常溫、攪拌狀態(tài)下浸泡71h， 并且每隔24 h換1次HC1,以除去碳酸鈣，最后用去離子水沖洗至中性， 密封濕態(tài)保存。
3. 2栽體的活化
載體于65。C下用0.1 mol/L HC1水解12h,用去離子水沖洗至中性， 以每2. 0kg載體加入100L 10%的戊二醛酸性溶液，室溫下于反應(yīng)器中攪拌反應(yīng)12h，用去離子水洗去戊二醛，所得載體置于4'C保存。 3. 3酶的固定化
把載體加入酶濃縮液，室溫下，在搖床反應(yīng)器中80r/min轉(zhuǎn)速下，賻 育9h，吸去酶液，用pH8. O磷酸緩沖液(O. lmol/L)清洗固定化酶載體，直 到洗液中不含脂肪酶為止，所得固化酶于4 。C保存。
固定化條件為溫度25°C、固定化時間9h、酶液活力與載體質(zhì)量比為 8000:1 (U/g)。
步驟四，酯交換反應(yīng)
在間歇式酶反應(yīng)器中加入重量比1: 7: 0. 65的丙三醇、多烯酸乙酯與固 化酶，再加入占物料質(zhì)量8%的油酸鉀作為均相化試劑，反應(yīng)時間為7h,溫 度為28°C,初始水活度為0. 45。
步驟五，甘油三酯的提純
酯交換反應(yīng)結(jié)束后，在攪拌狀態(tài)下滴加入85%的濃H3P04，維持攪拌 35min，此時，加入的磷酸與油酸鉀形成磷酸鹽析出，將上述反應(yīng)所得的混 合物進行分子蒸餾，蒸餾條件釜溫16(TC,真空度O. 6Pa,蒸餾6h,殘留 物加入2%的活性炭脫色，在氮氣保護下加熱至U5。C，攪拌，維持35min， 冷卻至室溫。板框抽濾除去活性炭、磷酸鹽后得到黃色澄清的多不飽和脂 肪酸甘油三酯。
本次結(jié)果
(1)多不飽和脂肪酸甘油三酯連續(xù)生產(chǎn)性能穩(wěn)定，甘油酯轉(zhuǎn)化率達 69. 0%。
(2 )分子排阻色鐠法測定多不飽和脂肪酸甘油三酯產(chǎn)品中單酸和二酸 甘油酯含量為48. 3%;
(3)多不飽和脂肪酸甘油三酯中EPA和DM的氣相色譜測定方法，二 者總含量為45， 6%。
實施例3
步驟一，酶的制備
菌種假絲酵母菌種(Candida sp. ) YGB03-02,北京禹光生物科學研 究中心保藏和提供；斜面培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基(g L—1):酵母膏2,豆油5， K2HP04 1, MgS04 7H20 0. 1， NaCl 0.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g L-1):酵母膏3，豆油20， K2HP04 1， MgS04 7H20 0. 1， NaCl 0.5。
斜面種子活化4小時后，以體積分數(shù)10%的接種量接種至裝有l(wèi)OOmL種 子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，培養(yǎng)基初始pH為5. 0，培養(yǎng)溫度30。C， HYG-II 型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖并瓦拒，轉(zhuǎn)速220r/min,培養(yǎng)時間為20h。 4巴種子培養(yǎng) 液按體積分數(shù)10%的接種量接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度 30°C,攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量4. OL/min， pH為6. 0，發(fā)酵時間28h。
步驟二，酶的分離純化
發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心30min，室溫下，用截留分子量為20000的 PU-20K-PS管式超濾膜系統(tǒng)處理，膜面積為0.186m2。調(diào)節(jié)膜前壓力為 1. 2MPa，膜后壓力為0. 15MPa, pH為7. 0。
步驟三，酶的固定化
3. 1載體的制備
稱取甲基丙烯酸縮水甘油酯，二乙烯基苯，曱苯和正庚烷，使它們的 體積比為1: 0.5: 0.8: 0.8，稱取納米碳酸鍋(粒徑小于80 nm),以1%的 比例與上述液體一起放于攪拌器中，反復(fù)攪拌混合后，置于65。C恒溫反應(yīng) 器中反應(yīng)12h。所得固體經(jīng)粉碎后，篩分收集0. 3-0.45mm粒徑的顆粒，用 乙醇抽提24h,然后用適量的0.1 tnol/L HC1于常溫、攪拌狀態(tài)下浸泡72h， 并且每隔24 h換1次HC1,以除去石友酸鉤，最后用去離子水沖洗至中性， 密封濕態(tài)保存。 、
3. 2載體的活化
載體于65。C下用0.1 mol/L HC1水解12h，用去離子水沖洗至中性， 以每2.0kg載體加入100L 10°/ 的戊二醛酸性溶液，室溫下于反應(yīng)器中攪拌 反應(yīng)12h,用去離子水洗去戊二醛，所得載體置于4t:保存。
3. 3酶的固定化
把載體加入酶濃縮液，室溫下，在搖床反應(yīng)器中80r/min轉(zhuǎn)速下，孵
15育10h，吸去酶液，用pH8. O磷酸緩沖液(O. lmol/L)清洗固定化酶載體，直 到洗液中不含脂肪酶為止，所得固化酶于4。C保存。
固定化條件為溫度30。C、固定化時間10h、酶液活力與栽體質(zhì)量比為 8000: 1 (U/g)。
步驟四，酯交換反應(yīng)
在間歇式酶反應(yīng)器中加入重量比1: 8:0. 7的丙三醇、多烯酸乙酯與固 化酶，再加入占物料質(zhì)量8%的油酸鉀作為均相化試劑，反應(yīng)時間為8h,溫 度為30°C，初始水活度為0. 50。
步驟五，甘油三酯的提純
酯交換反應(yīng)結(jié)束后，在攪拌狀態(tài)下滴加入85%的濃H3P04,維持攪拌 35min，此時，加入的磷酸與油酸鉀形成磷酸鹽析出，將上述反應(yīng)所得的混 合物進行分子蒸鎦，蒸餾條件釜溫160。C,真空度0.7Pa，蒸餾7h，殘留 物加入2%的活性炭脫色，在氮氣保護下加熱至120°C,攪拌，維持40min， 冷卻至室溫。板框抽濾除去活性炭、磷酸鹽后得到黃色澄清的多不飽和脂 肪酸甘油三酯。
本次結(jié)果
(1)多不飽和脂肪酸甘油三酯連續(xù)生產(chǎn)性能穩(wěn)定，甘油酯轉(zhuǎn)化率達 64. 9%。
(2 )分子排阻色譜法測定多不飽和脂肪酸甘油三酯產(chǎn)品中單酸和二酸 甘油酯含量為45.6%;
(3)多不飽和脂肪酸甘油三酯中EPA和DHA的氣相色譜測定方法，二 者總含量為53. 3%。
由上述具體實施例可知，本發(fā)明一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn) 方法，工藝比較筒單，成本較低，并具有反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高、多不飽和脂肪酸 甘油三酯連續(xù)生產(chǎn)性能穩(wěn)定、產(chǎn)品有效含量高等優(yōu)點，適于業(yè)界廣泛推廣 使用。
'以上所迷，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式 上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù) 人員，當可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或^務(wù)飾為等同變化的等 效實施例，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟酶的制備，即對酵母菌培養(yǎng)、發(fā)酵獲得發(fā)酵液；發(fā)酵液的分離純化，獲得酶濃縮液；酶的固定化，即先將載體加入酶濃縮液中并進行孵育，再經(jīng)清洗獲得固化酶；酯交換反應(yīng)，即丙三醇與多不飽和脂肪酸乙酯在固化酶作用下反應(yīng)，制得甘油三酯；甘油三酯的提純。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 其特征在于所述的酯交換反應(yīng)是指在間歇式酶反應(yīng)器中加入質(zhì)量比1:6-8:0.6-0.7的丙三醇、多烯酸乙 酯與固化酶，并加入占丙三醇、多烯酸乙酯與固化酶總質(zhì)量8%的油酸鉀作 為均相化試劑，溫度為25-30°C，初始水活度為0.40-0.50,反應(yīng)6-8h制 得甘油三酯。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 其特征在于所述的酶的固定化包括按照酶液活力與栽體質(zhì)量比為8000: 1 U/g，把栽體加入酶濃縮液中；在20-30。C、搖床反應(yīng)器80r/min轉(zhuǎn)速下、孵育8-10h固定化；吸去酶液，用pH8. 0 0. lmol/L的磷酸緩沖液清洗，所得固化酶于4。C 保存。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 其特征在于所述的載體經(jīng)以下方法制得混合體積比為1: 0. 4-0. 5: 0. 7-0. 8: 0. 7-0. 8的甲基丙烯酸縮水甘油酯、 二乙烯基苯、曱苯和正庚烷，以10g/L的比例將粒徑小于80 nm的納米碳 酸鉤加入上述混合液中，并置于攪拌器中反復(fù)攪拌混合，再置于65。C恒溫反應(yīng)器中反應(yīng)12h;所得固體經(jīng)粉碎后，篩分收集0. 3-0. 45mm粒徑的顆粒，用乙醇抽提 20-24h,然后用0. lmol/L的HC1于常溫、攪拌狀態(tài)下浸泡70-72h,并且 每隔24 h換1次HC1;最后用去離子水沖洗至中性，制得的載體密封濕態(tài)保存。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 其特征在于所述的酶的固定化之前，還包括載體的活化步驟，即將載體于65。C下用0.1 mol/L HC1水解12h;用去離子水沖洗至中性，以每2. Okg載體加入100L 10%的戊二醛酸性 溶液的比例，在室溫下于反應(yīng)器中攪拌反應(yīng)12h;用去離子水洗去戊二醛，所得載體置于4。C保存。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 其特征在于所述的酶的制備包括以下步驟將酵母菌在斜面培養(yǎng)基上活化4小時；以體積百分比10%的接種量接種至裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶 中，種子培養(yǎng)基初始pH為5. 0,培養(yǎng)溫度25-3(TC，再置于HYG-II型回轉(zhuǎn) 式恒溫調(diào)速搖弁瓦拒中，轉(zhuǎn)速220r/min,培養(yǎng)時間為20h;把種子培養(yǎng)液按體積分數(shù)10%的接種量接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵 罐中，培養(yǎng)溫度28-30。C，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min,通氣量4. 0L/min， pH為 6. 0,發(fā)酵時間28h。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基的成分為2g/L的酵母膏、5g/L的豆油、1 g/l^々K2HP04、 0. 1 g/L的MgS04 7H20、以及0. 5 g/L的NaCl;發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為3g/L的酵母膏、20g/L的豆油、lg/L的lUIP04、 0. lg/L的MgS04 7H20、以及0. 5g/L的NaCl。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 其特征在于所述的發(fā)酵液的分離純化是指將發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心30min，室溫下，用截留分子量為20000的 PU-20K-PS管式超濾膜系統(tǒng)處理，膜面積為0. 186m2,膜前壓力為1. 2MPa， 膜后壓力為0. 15MPa， pH為6.0-7.0,分離獲得酶濃縮液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法， 其特征在于所述的甘油三酯的提純包括酯交換反應(yīng)結(jié)束后，在攪拌狀態(tài)下滴入占物料質(zhì)量O. 96%的濃度為85% 的濃H3P04,維持攪拌35min;所得的混合物在釜溫16(TC、真空度0. 5-0. 7Pa下分子蒸餾5-7h;殘留物加入2%的活性炭脫色，在氮氣保護下加熱至110-12(TC，攪拌 30-40min后，冷卻至室溫；板框抽濾除去活性炭、磷酸鹽后得到多不飽和脂肪酸甘油三酯。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求所述的一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的酵母菌為^fr支絲酵母菌種。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，包括以下步驟酶的制備，即對酵母菌培養(yǎng)、發(fā)酵獲得發(fā)酵液；發(fā)酵液的分離純化，獲得酶濃縮液；酶的固定化，即先將載體加入酶濃縮液中并進行孵育，再經(jīng)清洗獲得固化酶；酯交換反應(yīng)，即丙三醇與多不飽和脂肪酸乙酯在固化酶作用下反應(yīng)，制得甘油三酯；甘油三酯的提純。本發(fā)明一種多不飽和脂肪酸甘油三酯的生產(chǎn)方法，工藝比較簡單，成本較低且反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高。
文檔編號C12P7/64GK101638676SQ200910091709
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者劉汝萃, 劉錫潛, 牛祥臣, 范書琴 申請人:山東禹王實業(yè)有限公司;山東禹王制藥有限公司