專利名稱：誘導(dǎo)分泌表達(dá)生產(chǎn)重組葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在酵母系統(tǒng)高密度誘導(dǎo)分泌表達(dá)潷草花粉主要致敏蛋白的方法， 特別是一種在畢赤酵母(Pichia pastoris,KM71H)系統(tǒng)高密度誘導(dǎo)分泌表達(dá)潷草花粉主要 致敏蛋白的方法Hum j 3的方法以及工程菌。本發(fā)明屬于基因工程藥物和醫(yī)學(xué)診斷制劑領(lǐng) 域，該蛋白可能在潷草花粉過敏反應(yīng)疾病的臨床分子診斷、變應(yīng)原免疫治療、工業(yè)生產(chǎn)以及 質(zhì)控中發(fā)揮重要作用。
背景技術(shù)：
薔薇亞綱大麻科一年生纏繞草本植物潷草(Humulus japonicus或Humulus scandens)，原產(chǎn)我國，廣泛分布于遠(yuǎn)東地區(qū)，我國除新疆、青海以外的各省區(qū)均有分布，東 亞各國(朝鮮、日本、俄羅斯、越南)以及歐洲、美國西海岸地區(qū)亦有分布。上世紀(jì)八十年代 由北京協(xié)和醫(yī)院牽頭的第一次全國性氣傳致敏花粉調(diào)查中，在79個(gè)花粉收集點(diǎn)中有53個(gè) 點(diǎn)可收集到潷草花粉，僅次于蒿屬花粉，其分布范圍基本上覆蓋全國，播散高峰為八、九月。 北京協(xié)和醫(yī)院首次發(fā)現(xiàn)潷草花粉是我國夏秋季節(jié)僅次于蒿屬花粉的重要致敏原，是導(dǎo)致臨 床上出現(xiàn)變應(yīng)性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、花粉性皮炎、季節(jié)性哮喘等花粉癥癥狀的重要病因， 很大程度上影響了患者的生活質(zhì)量。現(xiàn)階段對于花粉癥的診斷和治療，依賴于特異性變應(yīng)原疫苗 (SpecificAllergenic Vaccines) 0變應(yīng)原疫苗是指包括變應(yīng)原提取物以及其它成分 的生物制劑，可有效用于人類過敏性疾病的診斷、預(yù)防和治療。變應(yīng)原特異的免疫治療 (Allergen-Specific Immunotherapy, SIT)通過調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì) 胞的免疫應(yīng)答以及調(diào)節(jié)介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞的功能和數(shù)量，從而減輕患者癥狀。WHO發(fā)布 指導(dǎo)文件指出，SIT是唯一能影響過敏性疾病自然病程、有效阻止變應(yīng)性鼻炎進(jìn)展為哮喘的 治療方法。由于重組技術(shù)的廣泛運(yùn)用，現(xiàn)階段有大量重組過敏原成功用于臨床變應(yīng)性疾病免 疫診斷和治療，從而避免了天然變應(yīng)原成分復(fù)雜、難于質(zhì)量控制、易誘發(fā)超敏反應(yīng)、產(chǎn)量受 限的缺點(diǎn)。由于潷草花粉由于地理分布廣、流行病學(xué)意義重大而倍受國內(nèi)外研究者重視。 在國內(nèi)李東棟等對武漢地區(qū)潷草花粉變應(yīng)原蛋白質(zhì)組分的進(jìn)行了雙向電泳分析，孫秀 珍等對潷草花粉變應(yīng)原致敏組分進(jìn)行了研究；劉昀等構(gòu)建潷草和初步鑒定了花粉cDNA 表達(dá)文庫，陶愛林等創(chuàng)建了潷草及豚草過敏原的嵌合基因，并對其抗原性作出評價(jià)等 等。而在國外，韓國人Park JW于1999首先發(fā)現(xiàn)了一分子量為IOkDa左右的潷草變應(yīng) 原主要致敏蛋白，潷草過敏患者血清SlgE結(jié)合率為72 %，并且測定該蛋白的N端序列為 NH4+-DNXFENGMKAXTSLYDXKYQ-C00_(X為未鑒定的未知氨基酸)，但該項(xiàng)研究并沒有得到該 蛋白的全序列。而在GeneBank數(shù)據(jù)庫中，Jin HS與Park JW注冊了編號為AY335187的一 段潷草致敏蛋白mRNA序列，但沒有公開發(fā)表的具體文獻(xiàn)說明該段序列是通過怎樣的技術(shù) 路線獲得的，也沒有血清免疫學(xué)試驗(yàn)證實(shí)該序列對應(yīng)的蛋白為潷草主要致敏蛋白(需要潷草過敏患者血清SlgE結(jié)合率大于50% )，不過由于該序列完整，國際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUIS) 下屬的變應(yīng)原命名委員會(huì)(www.allergen.org)仍然將該蛋白命名為Hum j 1，而且作為潷 草花粉變應(yīng)原主要致敏蛋白。北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科尹佳、程璇等純化了一個(gè)潷草花粉 致敏蛋白，其過敏患者血清slgE結(jié)合率約為74%，N端序列為MM+MDNPFENGMKA-COCr。該 序列在分子量、等電點(diǎn)、過敏患者血清slgE結(jié)合率、蛋白N端序列等方面均與1999年韓國 人Park JW發(fā)現(xiàn)的IOkDa的主要致敏蛋白極為接近，但仍沒有獲得全序列鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述不足，本發(fā)明人提供一種高密度誘導(dǎo)分泌表達(dá)潷草花粉主要致敏蛋白的 方法以及工程菌，通過對酵母系統(tǒng)篩選以及誘導(dǎo)表達(dá)、純化工序的選擇，生產(chǎn)了具有免疫學(xué) 和生物學(xué)活性的潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3重組蛋白。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明首先利用3' -RACE技術(shù)，設(shè)計(jì)簡并引物，首次在國際上 鑒定了該IOkDa主要致敏蛋白對應(yīng)的cDNA全序列，并依據(jù)IUIS的變應(yīng)原命名規(guī)則將該蛋 白命名為Hum j 3。本發(fā)明誘導(dǎo)分泌表達(dá)生產(chǎn)重組潷草主要致敏蛋白Hum j 3的方法，包括如下步 驟(1)構(gòu)建表達(dá)SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的重組表達(dá)載體；(2)線性化重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞；(3)篩選陽性克隆，得重組菌株，并擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)以及篩選Humj 3蛋白在酵母中以α-factor信號肽蛋 白引導(dǎo)分泌表達(dá)，篩選活性較高的重組菌；(5)以活性較高的重組菌株為種子菌進(jìn)行高密度的誘導(dǎo)表達(dá)重組Hum j 3蛋白；(6)收集培養(yǎng)上清并分離純化Humj 3。上述步驟1)可以根據(jù)SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列設(shè)計(jì)編碼該序列的核苷酸序 列，特別是根據(jù)宿主密碼子的偏愛性設(shè)計(jì)相應(yīng)的核苷酸序列，將該序列插入到適宜的表達(dá) 載體中，得到重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體通過如下方法構(gòu)建獲得根據(jù)潷草花 粉主要致敏蛋白Hum j 3的蛋白N端序列NH4+-MDNPFENGMKA-C00_，設(shè)計(jì)上游簡并引物 Fl 為 5, -ATG GA(C/T)AA(C/T) CC(A/G/C/T) TT(C/T) GA(A/G) AA(C/T) GG(A/G/C/T) ATGAA-3 ‘，其下游通用引物AUAP為5’_GGC CAC GCG TCG ACT AC_3’，潷草花粉總mRNA逆 轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，連接入pEASY-T3 載體， 進(jìn)行T-A克隆，在含有IPTG/X-gal的平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后，挑選白斑用菌落PCR篩選， 將陽性重組子用通用測序引物M13F/M13R測序，得到該cDNA序列全長，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，設(shè)計(jì)上游引物 F30 :5，-CGT CTC GAG AAA AGA ATGGAT AAT CCC TTC-3，；下 游引物 R30 5' -CGT CCG CGG TCA TCC TTGCAA ATC ACC ACA-3，，RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)柱純化后， T-A克隆連接入pCR4-TOPO 載體，重組質(zhì)粒經(jīng)Xhol I/Sac II雙酶切后，與經(jīng)過Xhol I/ Sac II雙酶切的pPICZ α A載體相連接，構(gòu)建成F30R30_pPICZ α A重組質(zhì)粒。將構(gòu)建好的F30R30-PPICZ α A重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切線性化，電穿孔轉(zhuǎn)化畢赤酵 母，以Zeocin 抗生素篩選得到轉(zhuǎn)化的重組菌株。所述畢赤酵母為巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)，KM71H 菌株，基因型為 arg4aoxl ARG4，表型為 Muts，Arg+，ZeocinK，得到的重組 菌株命名為 Hum j3-pPICZ α Α-ΚΜ71Η。具體所述步驟(3)陽性克隆的篩選方法是用含500，1000，2000μ g/mlZeocin 抗 生素的YPDS平板篩選，置于30°C培養(yǎng)2天，出現(xiàn)菌落者即為陽性克隆。此外還可進(jìn)一步挑 選Muts菌落進(jìn)行酶切鑒定或測序鑒定，所用上游引物5' AOXl 5' -GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3‘，下游引物 3' AOXl 5' -GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3‘，目的 PCR產(chǎn)物 大小為849bp，經(jīng)測序鑒定插入了目的片段。其中步驟(5)所述高密度誘導(dǎo)表達(dá)的方法是將重組菌株接種于BMGH液體培養(yǎng) 基中30°C /2500rpm搖瓶培養(yǎng)10 14h，作為一級種子；將此一級種子按接種量5%接種于 BMGH液體培養(yǎng)基中，300C /2500rpm搖瓶培養(yǎng)16_20h至0D_為4_6，作為二級種子；將此二 級種子離心，收集菌體，用原體積10%的液體BMMH培養(yǎng)基重懸，300C /2500rpm搖瓶誘導(dǎo)培 養(yǎng)，每隔20 28h添加甲醇至終濃度0. 5%，振蕩培養(yǎng)90 100h，其中搖瓶培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基 體積不超過培養(yǎng)瓶容積的1/10。其中步驟(6)收集培養(yǎng)上清并分離純化Hum j 3的方法是收集培養(yǎng)上清，用分 子截留量3. 5KDa的透析袋于去離子水中透析20 30h，用抗?jié)Р莼ǚ厶烊恢饕旅舻鞍?nHum j 3的單抗親和柱層析，所述單抗優(yōu)選為雜交瘤細(xì)胞(Hum j 3-#87_mAb，該細(xì)胞株已 于2009年7月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，分類命名為 小鼠雜交瘤細(xì)胞，保藏號為=CGMCC No. 3208)分泌的單抗。本發(fā)明還提供一種表達(dá)Hum j 3的基因工程菌，其是通過構(gòu)建表達(dá)SEQID NO. 1所 示氨基酸序列的重組表達(dá)載體，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的陽性 克隆。本發(fā)明還提供利用上述方法制備純化得到的潷草花粉主要致敏蛋白制備得到的 各種試劑，其包括含有純化的重組潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于診斷潷草花粉過 敏的診斷試劑；含有純化的重組潷草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于檢測潷草花粉主要 致敏蛋白含量的檢測試劑；含有純化的重組潷草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于免疫治 療潷草花粉主要致敏蛋白過敏病癥的藥物。對篩選得到的重組酵母菌株高密度分泌表達(dá)，以BMMH誘導(dǎo)培養(yǎng)，解決了本實(shí)驗(yàn)室 前期以大腸桿菌胞內(nèi)融合或非融合表達(dá)該蛋白不能成功的問題。隨后，我們對rHumj 3進(jìn) 行了親和純化，所用的單抗(編號#87)是用針對nHum j 3的單抗庫篩選而來，從而建立了 有效的純化路線。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明在國際上率先克隆了潷草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的 基因，分析測定了基因的序列，并成功進(jìn)行了酵母真核表達(dá)，本發(fā)明還提供了工程菌Hum j 3-pPICZ α Α-ΚΜ71Η，該菌株能分泌表達(dá)有免疫學(xué)活性的rHum j 3蛋白，粗蛋白表達(dá)量可以 達(dá)到100mg/L，且分離純化步驟簡單。本發(fā)明為潷草花粉過敏患者的分子診斷和臨床免疫治 療提供了全新的蛋白，為后期臨床試驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。因而重組潷草花粉主要致敏蛋 白rHum j 3具有巨大的應(yīng)用前景和市場。


圖1 :3’ -RACE法所得目的基因Hum j 3的特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(481bp左右)，M為分子量Marker，1為Hum j 3的特異性基因PCR產(chǎn)物。圖2 菌落PCR篩選Hum j 3_pEASY_T3重組質(zhì)粒。藍(lán)白斑篩選平板上提取白斑 1-11，藍(lán)斑12-13。其中2，6，9號菌插入了目的基因片段。圖3 :F30R30-pPICZaA與pPICZaA重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及Sac I酶切線性化過程，M 為分子量Marker，1為純化的Hum j 3PCR產(chǎn)物，2為F30R30-Humj3-pCR4-T0P0重組質(zhì)粒經(jīng) Xhol I/Sac II雙酶切后的F30R30-Humj3小片段切膠純化產(chǎn)物，3為pPICZ α A質(zhì)粒經(jīng)Xhol I/Sac II雙酶切后的大片段，4為重組F30R30-Hum j 3-pPICZ α A重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切線 性化片段，5為純化的F30R30-Hum j 3-pPICZ α A重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切線性化片段，導(dǎo)入 KM71H前的檢測，6為pPICZ α A質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切線性化片段，作為陰性對照導(dǎo)入KM71H。圖4 :F30R30-pPICZaA-KM71H重組菌與pPICZaA-KM71H陰性對照陽性的菌株篩選。 其中1-9為在含有ΙΟΟμ g/ml的Zeocin 抗生素YPDS平板上生長的F30R30-pPICZaA-KM71H 單菌落，10為在該篩選平板上生長的pPICZaA-KM71H單菌落。圖5 巴氏畢赤酵母高表達(dá)克隆菌株的Dot-ELISA方法快速篩選結(jié)果。圖示NC膜 上不同克隆的顯色強(qiáng)度，其中，6、7、8號克隆被認(rèn)為是高表達(dá)克隆菌株，其顯色強(qiáng)度明顯高 于其它克隆。圖6 SDS-PAGE示不同時(shí)間F30R30-pPICZaA_KM71H菌株分泌表達(dá)rHum j 3蛋白 情況，M為蛋白分子量Marker，1為w22潷草變應(yīng)原浸液，2為pPICZaA_KM71陰性質(zhì)控菌株 24h誘導(dǎo)后分泌表達(dá)蛋白上清液，3為pPICZaA-KM71陰性質(zhì)控菌株96h誘導(dǎo)后分泌表達(dá)蛋 白上清液，4為GS115/Albumin陽性質(zhì)控菌株96h誘導(dǎo)后分泌表達(dá)蛋白上清液，5_8分別為 重組菌株F30R30-pPICZaA-KM71H于BMMH誘導(dǎo)24h，48h，72h，96h表達(dá)蛋白上清液。其中 72h和96h誘導(dǎo)時(shí)，重組酵母菌株開始表達(dá)分子量約為9. 6kDa重組蛋白rHum j 3。圖7 =Tricine-SDS-PAGE示還原和非還原狀態(tài)下nHum j 3和rHum j 3的蛋白分 子量，M為蛋白分子量Marker (單位kDa)，1為pPICZaA_KM71陰性質(zhì)控菌株96h誘導(dǎo)后分泌 表達(dá)蛋白上清液(上樣緩沖液中加入DTT)，2為pPICZaA-KM71陰性質(zhì)控菌株96h誘導(dǎo)后分 泌表達(dá)蛋白上清液(上樣緩沖液中不加入DTT) ；3為GS115/Albumin陽性質(zhì)控菌株96h誘 導(dǎo)后分泌表達(dá)蛋白上清液(上樣緩沖液中加入DTT)，4為GS115/Albumin陽性質(zhì)控菌株96h 誘導(dǎo)后分泌表達(dá)蛋白上清液(上樣緩沖液中不加入DTT) ；5為F30R30-pPICZaA-KM71重組 菌株96h誘導(dǎo)后分泌表達(dá)蛋白上清液(上樣緩沖液中加入DTT)，6為F30R30-pPICZaA-KM71 重組菌株96h誘導(dǎo)后分泌表達(dá)蛋白上清液(上樣緩沖液中不加入DTT) ；7為潷草花粉變應(yīng) 原浸液可溶性蛋白(上樣緩沖液中加入DTT)，8為潷草花粉變應(yīng)原浸液可溶性蛋白(上樣 緩沖液中不加入DTT)。圖8 =Western Blotting分析nHum j 3和rHum j 3與潷草過敏患者血清結(jié)合的 情況。其中，A表示抗原為潷草花粉變應(yīng)原浸液，B為重組潷草花粉主要致敏原rHum j 3,M 為蛋白分子量Marker，Al為潷草花粉浸液Western Blotting后麗春紅染色結(jié)果，A2為潷 草花粉陰性血清池免疫印跡結(jié)果，A3-A9為7份潷草過敏患者陽性血清免疫印跡結(jié)果，均對 9. 6kDa蛋白有陽性反應(yīng)；AlO為小鼠單抗的陰性對照，不與潷草9. 6kDa蛋白反應(yīng)，A11-17， 分別是針對潷草nHum j 3獲得的單抗，編號分別為#50、#59、#66、#67、#68、#87、#92。Bl 為F30R30-pPICZaA-KM71H菌株表達(dá)的包含rHumj 3蛋白的上清分泌液Western Blotting 后麗春紅染色結(jié)果，B2是潷草花粉陰性血清池與rHum j 3免疫印跡結(jié)果，B3-B9為相同7份潷草過敏患者陽性血清與rHum j 3免疫印跡結(jié)果，B10為小鼠單抗的陰性對照，不與潷 草9. 6kDa蛋白反應(yīng)，B11-17分別是編號#50、#59、#66、#67、#68、#87、#92的小鼠單抗與 rHumj 3免疫印跡結(jié)果。結(jié)果顯示對潷草變應(yīng)原浸液9. 6kDa蛋白有免疫反應(yīng)的患者血清與 F30R30-pPICZaA-KM71H菌株表達(dá)的rHum j 3蛋白也有結(jié)合，而與天然n Hum j 3反應(yīng)的7 株小鼠單抗中，#66、#68、#87、#92四株單抗與rHum j 3蛋白也有結(jié)合。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不 用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件 如J.薩姆布魯克.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002)，或按照 EasySelect Pichia Expression Kit 手冊(invitrogen 公司，Version H，2005.)，以及相 關(guān)制造廠商所建議的要求。實(shí)施例11.潷草花粉總RNA的提取和cDNA的合成(1).潷草(Humulus japonicus)花粉總RNA的提取。在2007年9月采集北京郊 區(qū)新鮮潷草花粉，晴天晾曬干，9號分樣篩過濾，丙酮脫脂風(fēng)干后立即裝入瓶中，-80°C冷凍 保存。使用RNeasy Plant Mini kits(QIAGEN , Catalog No. 74903)試劑盒提取潷草花
粉總RNA，按照試劑盒操作程序提取。提取時(shí)將75mg左右的花粉投入液氮罐中反復(fù)研磨，使 用試劑盒中的Buffer RLT來破壞花粉組織。得到的總RNA量最后約20-60 u g/75mg花粉， A260/A80 = 1. 81，甲醛瓊脂糖凝膠電泳(1. 2%瓊脂糖)顯示rRNA有16S、18S、23S、25S等 清晰的條帶，顯示總RNA質(zhì)量完好，最后得到的總RNA濃度約為0. 9mg/ml。(2).潷草花粉cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成使用3，RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends 試劑盒(Invitrogen , CatalogNo. 18373-019)中 的superscript II RT逆轉(zhuǎn)錄酶，按照試劑盒操作程序完成潷草花粉cDNA的合成。簡述 如下:6u 1總RNA(0. 9mg/ml),5u 1 DEPC處理過的超純水，1 yl AP引物(10 uM,)加入 200 u 1 EP管，混勻，70°C lOmin ；置冰上冷卻至少lmin，然后加入10XPCR Buffer 2u 1, 25mM MgCl2 2 u 1,2. 5mM dNTP Mix 1 u 1,0. 1M DDT 2 u 1，混勻后離心，42°C平衡 5min ；加入 1 u 1 SuperScript II RT 逆轉(zhuǎn)錄酶使總體積達(dá)到 20 yl，42°C 水浴 50min ；然后 70 °C 15min 終止反應(yīng)，冰上預(yù)冷lmin后，加入1 y 1 RNase H，混勻離心后置37°C 20min以消化RNA， 于-20°C冷凍保存逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。該步驟中的AP引物序列為5' -GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTTTTT TTT TTT TTT T_3'。2. Hum j 3基因序列(cDNA)的獲得與驗(yàn)證(l).Hum j 3基因序列(cDNA)的獲得。該cDNA序列的獲得使用3，RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 試劑盒(Invitrogen , Catalog No. 18373-019) 完成。操作簡述如下建立3，RACE的PCR反應(yīng)體系，取2 ill上述合成的cDNA，10XPCR Buffer 5u l,25mM MgCl2 3 yl，滅菌雙蒸水 36. 5 yl，2. 5mM dNTP Mix lyl，所設(shè)計(jì)的簡并
引物F1(10UM )1UL，引 物 AUAP(10iiM)lii 1，Taq DNA polymerase (5units/u 1)0. 5u 1, 混勻離心，配成50iil反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為94 °C 3min變性；94°C 45s，55°C 30s， 72 V lmin, 30個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。取5 yl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測到490bp左右的PCR產(chǎn)物。該步驟中簡并引物Fl序列為5' -ATG GA(C/T) AA(C/T) CC(A/G/C/T) TT (C/T) GA (A/G) AA(C/T)GG(A/G/C/T)ATG AA_3'，下游通用引物AUAP序列為 5’-GGC CAC GCGTCGACTAC-3，。(2). Hum j 3基因(cDNA)的克隆測序與驗(yàn)證。將上述490bp左右的PCR產(chǎn)物用 QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN ，Catalog No. 28704)試劑盒切膠純化后進(jìn)行 T-A克隆測序。使用Transgen 的pEASY-T3 載體，進(jìn)行T-A克隆，在含有IPTG/X-gal的 平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后，挑選白斑用菌落PCR篩選，將陽性重組子用通用測序引物M13F/ M13R測序，得到該cDNA序列全長，序列信息見附圖。使用pEASY-T3 載體(Transgen ) 試劑盒進(jìn)行T-A克隆，所建立的克隆反應(yīng)體系和操作程序簡述如下上述PCR產(chǎn)物2μ 1，試 劑盒鹽溶液1μ 1，超純水2μ l，pEASY-T3 載體1μ 1，混勻離心該6μ 1反應(yīng)體系，室溫 (22-25V )反應(yīng)IOmin進(jìn)行載體和目的片段的連接，然后從中取2 μ 1與一管500 μ 1的化 學(xué)感受態(tài)One Shot T0P10 Ε. Coli菌株輕輕混勻，冰浴15min，然后42°C準(zhǔn)確熱激30s (禁 止搖晃)，立即置于冰上，然后加入250 μ 1平衡至室溫的S. 0. C.培養(yǎng)基，37°C/250rpm條件 下水平振蕩培養(yǎng)Ih后，取50 μ 1轉(zhuǎn)化的Τ0Ρ10 Ε. Coli菌株均勻涂布于含8 μ 1500mM IPTG 以及40 μ 1 40mg/ml X-gal于37°C 30min預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上，37 °C孵箱過夜培養(yǎng)。次日 挑選白斑克隆10個(gè)，用通用測序引物M13F、M13R做PCR篩選鑒定，選擇大小接近700bp的 片段，使用 EasyPure PCRPurification Kit (Transgen )進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物純化后，用 #2 號 克隆菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。所使用的引物M13F:5' -GTA AAA CGACGG CCA G-3 ‘ ；M13R 5 ‘ -CAG GAA ACA GCT ATG AC-3 ‘。PCR 篩選克隆的條件10 XPCR Buffer (Mg2+Plus) 5 μ 1, 2. 5mM dNTP Mix 4 μ 1，M13F(10 μ Μ) 1 μ 1，M13R(10 μ Μ) 1 μ 1，Taq DNA polymerase(5units/y 1)0. 5μ 1，滅菌雙蒸水38. 5μ 1，用槍頭挑取單克隆菌落，反 復(fù)吹吸于反應(yīng)體系中，混勻離心，配成50 μ 1反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為94°C 3min變性； 940C 30s, 550C 45s, 72°C lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0得到的全部序列圖見附表。3.含有Humj 3基因的分泌性酵母表達(dá)重組質(zhì)粒(Humj 3-pPICZ α Α)的構(gòu)建(1).引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增。根據(jù)測序得到的Hum j 3cDNA序列設(shè)計(jì)引物，在5’ 端加上Xhol I酶切位點(diǎn)，因此上游引物F30設(shè)計(jì)為5，-CGT CTCGAG AAA AGA ATG GAT AAT CCC TTC-3’(下劃線標(biāo)示的是Xhol I酶切位點(diǎn))；在3’端加上Sac II酶切位點(diǎn)， 因此下游引物 R30 設(shè)計(jì)為 5，-CGT CCGCGG ITCA I TCC TTG CAA ATC ACC ACA-3，(下劃線
標(biāo)示的是Sac II酶切位點(diǎn)，方框標(biāo)示的是引入終止密碼子)。使用QIAGEN 的HotStar HiFidelityPolymerase kit (Catalog No. 202602)進(jìn)行高保真的 PCR 擴(kuò)增，建立的反應(yīng) 體系為5 XHotStar HiFidelity PCR Buffer (包含 dNTPs) 10 μ 1，F(xiàn)30 (10 μ M) 1 μ 1， R30(10yM)ly 1, HotStar HiFidelity DNA Polymerase (2. 5units/μ 1) 1 μ 1，cDNA 模板 2 μ 1，滅菌雙蒸水35 μ 1，混勻離心，配成50 μ 1反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為95°C 5min變性； 940C 15s，52°C lmin，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0(2).目的基因的克隆擴(kuò)增與純化。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)EasyPure PCRPurification Kit (Transgen )柱純化后，T-A 克隆連接入 Invitrogen 的 pCR4-TOPO 載體(Τ0Ρ0 TA Cloning Kit for Sequencing試劑盒)。所建立的克隆反應(yīng)體系和操作程序簡述同步驟2。篩選鑒定陽性克隆后，擴(kuò)大培養(yǎng)含有F30R30-Hum j 3-pCR4-T0P0重組質(zhì)粒的T0P10 菌株，以QIAprep Spin Minipr印 kit (QIAGEN ，Catalog No. 27104)試劑盒提取純化質(zhì) 粒。操作詳見說明書。(3).含目的基因克隆載體的雙酶切。將含有目的基因的PCR4-T0P0重組質(zhì)粒 經(jīng) Xhol I/Sac II (New England BioLabs , Catalog No. R0146/R0157)雙酶切，建立如下 50 μ 1 酶切體系10 X NEB Buffer#45 μ 1，質(zhì)粒 DNA 40 μ 1, XholI (20000U/ml) 2 μ 1，Sac II (20000U/ml) 2 μ 1，H2O 1 μ 1 ；酶切條件為 37°C 2h 后，65°C 20min 滅活。1. 5% TAE 瓊月旨 糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收277bp的添加了 Xhol I/Sac II雙酶切位點(diǎn)的目的基因。(4) .pPICZ α A 穿梭質(zhì)粒的擴(kuò)增與雙酶切。使用 EasySelect PichiaExpression Kit (Invitrogen )中的pPICZ α A穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化T0P10F，化學(xué)感受態(tài)菌株，在含有25 μ g/ ml Zeocin 抗生素的LB低鹽平板上篩選。經(jīng)菌落PCR鑒定后，在含有25 μ g/ml Zeocin 抗生素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。然后用QIAprep Spin Miniprep kit (QIAGEN ) 提取純化質(zhì)粒pPICZ α A，酶切體系和條件同上。1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切 膠回收3522bp的載體片段。上述菌落PCR篩選含pPICZ α A質(zhì)粒菌株條件為10XPCR Buffer (Mg2+Plus) 5 μ 1,2. 5mM dNTP Mix 4 μ 1，5，AOXl 弓| 物(10 μ Μ) 1 μ 1，3，AOXl 弓| 物 (10μΜ)1μ 1，Taq DNApolymerase (5units/ μ 1)0. 5 μ 1，滅菌雙蒸水 38. 5 μ 1，用槍頭挑取 單克隆Ze0CinK菌落，反復(fù)吹吸于反應(yīng)體系中，混勻離心，配成50 μ 1反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條 件為 940C 3min 變性；94°C 30s, 55°C 45s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0(5).目的基因與pPICZ α A質(zhì)粒雙酶切片段的連接。建立目的基因和pPICZ α A 酶切片段的20μ 1連接體系10XNEB Buffer 2 μ 1，目的DNA (lOng/μ 1) 8 μ 1，目的 載體(20ng/y 1)8 μ 1，T4DNA 連接酶(400000U/ml，New England BioLabs , Catalog No. M0202) 2 μ 1，室溫連接 2h，65°C 20min 滅活。(6).含F(xiàn)30R30_Hum j 3-pPICZ α A重組質(zhì)粒陽性克隆的篩選與擴(kuò)大培養(yǎng)將連接 好的F30R30-Hum j 3-pPICZ α A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化T0P10F，化學(xué)感受態(tài)菌株，以5，A0X1/3，A0X1 為引物做菌落PCR篩選陽性克隆菌株，然后大量提取質(zhì)粒。菌落PCR和質(zhì)粒提取的方法同 上。(7).重組質(zhì)粒F30R30-Hum j 3-pPICZ α A與空質(zhì)粒pPICZ α A/的線性化將用 QIAprep Spin Miniprep kit試劑盒提取的質(zhì)粒用Sac I內(nèi)切酶線性化處理。50μ1酶 切體系和條件為10 X NEB Buffer 5 μ 1，空質(zhì)粒/重組質(zhì)粒DNA (lOng/μ 1) 35 μ 1，Sac I內(nèi) 切酶(400000U/ml，New England BioLabs , Catalog No. R0156)2y 1，H2O 8μ 1，37°C過夜 酶切，65°C 20min滅活。然后用乙醇沉淀法純化線性質(zhì)粒，以滅菌雙蒸水溶解沉淀的DNA，使 其濃度為l_2yg/y 1。4.制備酵母感受態(tài)細(xì)胞(Pichia pastoris，KM71H)將KM71H酵母菌株接種于裝有5ml YPD液體培養(yǎng)基的50ml離心管中30°C過夜培 養(yǎng)，取0. 5ml過夜培養(yǎng)菌液接種于裝有500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2000ml的搖瓶中過夜培養(yǎng) 直至OD600 = 1. 3-1. 5，然后40C 1500gX5min離心，棄上清，用500ml冰冷的(0°C )滅菌去 離子水重懸沉淀，4°C 1500gX5min再次離心后，用250500ml冰冷的(0°C )滅菌去離子水重 懸沉淀，4°C 1500gX5min第三次離心后，用20ml冰冷的(0°C ) IM的山梨醇重懸沉淀，4°C1500gX5min第四次離心，最后用Iml冰冷的(0°C ) IM的山梨醇重懸沉淀，此時(shí)總體積約為 1. 5-3ml，隨后立即進(jìn)行電擊操作。5.電穿孔將線性化空質(zhì)粒pPICZaA/重組質(zhì)粒F30R30-Hum j3_pPICZ a A導(dǎo)入酵 母感受態(tài)細(xì)胞。取80 μ 1感受態(tài)酵母細(xì)胞，加入10 μ 1 (1 μ g/ μ 1)的空質(zhì)粒/線性化重組質(zhì)粒，混 勻后，轉(zhuǎn)入冰冷(0°c )的0. 2cm的電穿孔杯中，冰浴5min，用Bio-RadGene Pulser電轉(zhuǎn)儀 進(jìn)行電擊，條件為電壓1500V，電容25 μ F，電阻400 Ω，> 5ms。然后立即往電轉(zhuǎn)杯中加入冰 冷(0°C )的IM山梨醇1ml，隨后轉(zhuǎn)移至15ml滅菌離心管中，30°C孵育l_2h，不振蕩；分別取 10，25，50，100，200 μ 1 涂布于含 100μ g/ml, 100 μ g/ml，250 μ g/ml，500 μ g/ml，1000 μ g/ ml的Zeocin 抗生素的YPDS平板上，置30°C孵箱培養(yǎng)3_4天直至陽性克隆出現(xiàn)。6.菌落PCR檢測目的基因的整合用槍頭挑去單克隆菌落懸浮于10 μ 1去離子水，加入2. 5μ 1 Lyticase (10U/μ 1， TIANGEN , Catalog No. RT410-01)，30°C孵育 IOmin 后置入 _80°C IOmin 以裂解酵母。建 立 50ul 篩選重組子的 PCR 反應(yīng)體系10 X PCRBuffer (Mg2+Plus) 5 μ 1,2. 5mM dNTP Mix 4μ 1，5，AOXl引物(10 μ Μ) 1 μ 1，3，AOXl引物(10 μ Μ) 1 μ 1，酵母裂解液5 μ 1，滅菌雙蒸水 33. 5 μ 1，混勻，置 PCR 儀 95°C 5min 后，加入 Taq DNApolymerase (5units/ μ 1)0. 5 μ 1。PCR 反應(yīng)條件為 94 °C 3min 變性；94°C 45s, 54°C lmin,72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72 °C IOmin0 取 5μ1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定。根據(jù)PCR產(chǎn)物分子量大小鑒定外源基 因的整合情況。對整合有外源基因的克隆PCR產(chǎn)物純化后直接用5’ AOXl引物/3’ AOXl引 物測序，驗(yàn)證其與PPICZ α A載體的α-factor信號肽同框。7.陽性克隆的誘導(dǎo)表達(dá)以及高表達(dá)克隆的篩選用無菌牙簽隨機(jī)挑取含Zeocin 抗生素的YPDS上的47個(gè)轉(zhuǎn)化子，接種到匪板上 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)1. 34% YNB,4X ΙΟ"5生物素、0. 5%甲醇和1. 5%瓊脂)，同時(shí)接種了不含目的片 段的pPICZ α A載體的KM71H空白菌株作為克隆對照。待長成直徑約2mm的克隆后，將滅菌 后的NC膜貼于匪板上，做好標(biāo)記，倒置30°C繼續(xù)培養(yǎng)。，待克隆位置被濕透后(約3 4d)， 揭下NC膜，37°C干燥，固相抗原斑點(diǎn)。經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%BSA封閉1. 5h，加入抗?jié)Р葜饕旅?蛋白 Hum j 3 的小鼠雜交瘤單抗(Hum j 3-#87-mAb, CGMCC No. 3208), 37 °C lh，洗滌 5 次， 加入1 1000酶標(biāo)羊抗鼠IgG 二抗，37°C lh,洗滌5次，加入DAB-H2O2底物顯色，觀察斑點(diǎn) 顏色深淺。從以上匪平板上挑選Dot-ELISA普通顯色強(qiáng)度的5株陽性克隆(編號1_5)和顯 色強(qiáng)度最深的3株菌株克隆(編號6、7、8)，經(jīng)PCR和測序鑒定的整合有Hum j 3基因后，分 別接種于5ml BMGH培養(yǎng)基，同時(shí)另外接種一株不插入任何外源基因的pPICZaA_KM71陰性 質(zhì)控菌株，30°C /2500rpm振搖12h，取4ml菌種分裝保存于含15%甘油的YPD培養(yǎng)基中。另 取Iml接種到100ml BMGH培養(yǎng)基中直至OD6tltl為4_6左右，1500gX 5min離心，棄上清，菌體 沉淀用10ml BMMH重懸，每24小時(shí)加100%甲醇至終濃度0. 5%，誘導(dǎo)4天。每天取樣Iml 室溫1500gX5min離心，將上清和菌體沉淀液氮速凍后，保存于_80°C。將上述9株菌株分泌的上清液以0. 5ug/孔包被于96孔酶標(biāo)板，4°C 12h ；5次洗板 后；加入100 μ 1以1 10稀釋的20位潷草過敏患者混合血清，37V反應(yīng)3h ；5次洗板后； 加入100 μ 1以1 2000稀釋的HRP標(biāo)記抗人IgE單抗；5次洗板后在0D492nm處顯色。顯示菌株#7分泌表達(dá)的rHum j 3的蛋白與潷草過敏患者血清中slgE顯色強(qiáng)度明顯優(yōu)于其它 菌株(見表1，編號1-8的菌株來自圖5所示的克隆?？梢?、7、8號克隆的rHum j 3蛋白表 達(dá)水平的確高于1-5號非高表達(dá)克隆)。故經(jīng)Dot-ELISA篩選得到的菌株#7是高分泌表達(dá) 的rHum j 3的菌株，將該株命名為F30R30_pPICZaA_KM71 (該菌株已于2009年07月28日 在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中 國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)， 保藏號為CGMCC No. 3215。)表IELISA顯示高表達(dá)克隆與普通克隆rHumj 3蛋白表達(dá)水平的差異
權(quán)利要求
一種誘導(dǎo)分泌表達(dá)生產(chǎn)重組葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)構(gòu)建表達(dá)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重組表達(dá)載體；(2)線性化重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞；(3)篩選陽性克隆，得重組菌株，并擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)以及篩選Humj 3蛋白在酵母中以α factor信號肽蛋白引導(dǎo)的分泌表達(dá)，篩選活性較高的重組菌；(5)以活性較高的重組菌株為種子菌進(jìn)行高密度的誘導(dǎo)表達(dá)重組Hum j 3蛋白；(6)收集培養(yǎng)上清并分離純化Hum j 3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下根據(jù)潷草 花粉主要致敏蛋白Hum j 3的蛋白N端序列NH4+-MDNPFENGMKA-C00—，設(shè)計(jì)上游簡并引物Fl 為5' -ATG GA(C/T)AA(C/T)CC(A/G/C/T)TT (C/T)GA(A/G)AA(C/T)GG(A/G/C/T)ATGAA-3‘， 其下游通用引物AUAP為5’ -GGC CAC GCG TCG ACT AC-3’，潷草花粉總mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到 的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，連接入pEASY-T3 載體，進(jìn)行T-A 克隆，在含有IPTG/X-gal的平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后，挑選白斑用菌落PCR篩選，將陽性重 組子用通用測序引物M13F/M13R測序，得到該cDNA序列全長，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，設(shè)計(jì)上游引物 F30 :5，-CGT CTC GAG AAAAGAATGGAT AAT CCC TTC-3，；下游引物 R30 5，-CGT CCG CGG TCA TCC TTGCAA ATC ACC ACA-3，，RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)柱純化后，T-A 克隆連 接入pCR4-TOPO 載體，重組質(zhì)粒經(jīng)Xhol I/Sac II雙酶切后，與經(jīng)過Xhol I/Sac II雙 酶切的PPICZ α A載體相連接，構(gòu)建成F30R30-pPICZ α A重組質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)，KM71H 菌株，基因型為 arg4 aoxl ARG4，表型為 Muts, Arg+, ZeocinK。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(3)陽性克隆的篩選 方法是用含500，1000, 2000 μ g/ml Zeocin 抗生素的YPDS平板篩選，置于30°C培養(yǎng)2天， 出現(xiàn)菌落者即為陽性克隆。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其中步驟(5)所述高密度誘導(dǎo) 表達(dá)的方法是將重組菌株接種于BMGH液體培養(yǎng)基中30°C /2500rpm搖瓶培養(yǎng)10 14h， 作為一級種子；將此一級種子按接種量5%接種于BMGH液體培養(yǎng)基中，30°C /2500rpm搖瓶 培養(yǎng)16-20h至0D_為4-6，作為二級種子；將此二級種子離心，收集菌體，用原體積10% 的液體BMMH培養(yǎng)基重懸，300C /2500rpm搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔20 28h添加甲醇至終濃度 0. 5%，振蕩培養(yǎng)90 100h，其中搖瓶培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基體積不超過培養(yǎng)瓶容積的1/10。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一所述的方法，其特征在于其中步驟(6)收集培養(yǎng)上清并分 離純化Hum j 3的方法是收集培養(yǎng)上清，用分子截留量3. 5KDa的透析袋于去離子水中透 析20 30h，用抗?jié)Р莼ǚ厶烊恢饕旅舻鞍譶Humj 3的單抗親和柱層析，所述單抗優(yōu)選為 雜交瘤細(xì)胞Hum j3-#87-mAb CGMCC No. 3208分泌的單抗。
7.表達(dá)Hum j 3的基因工程菌，其是通過構(gòu)建表達(dá)SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的 重組表達(dá)載體，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的陽性克隆，所述陽性 克隆優(yōu)選為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris) F30R30_pPICZ α A-KM71H保藏號為CGMCCNo.3215。
8.一種含有純化的重組潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于診斷潷草花粉過敏的 診斷試劑。
9.一種含有純化的重組潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于檢測潷草花粉主要致 敏蛋白含量的檢測試劑。
10.一種含有純化的重組潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于免疫治療潷草花粉主 要致敏蛋白過敏病癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在酵母系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)重組葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的方法，包括構(gòu)建表達(dá)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重組表達(dá)載體；線性化重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞；篩選陽性克隆，得重組菌株，并擴(kuò)大培養(yǎng)；重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)以及篩選Hum j 3蛋白在酵母中以α-factor信號肽蛋白引導(dǎo)的分泌表達(dá)；以高活性的重組菌株為種子菌進(jìn)行高密度的誘導(dǎo)表達(dá)重組Humj 3蛋白；收集培養(yǎng)上清并分離純化Humj 3。本發(fā)明首次在國際上確證了葎草主要致敏蛋白的全基因序列，并首次成功進(jìn)行了酵母分泌表達(dá)，且證實(shí)了該重組蛋白具有免疫活性，為葎草花粉過敏患者的分子診斷和臨床免疫治療提供了全新的蛋白。
文檔編號C12P21/02GK101993888SQ20091009176
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者周俊雄, 尹佳, 程璇 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院