專利名稱：一種抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的藥物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的篩選方法，具體地，涉及抗持留狀態(tài)結(jié)核 分枝桿菌藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌^6ercw/a^)引起的一 種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染性疾病。長期以來，人們對(duì)抗結(jié)核病 的主要手段就是運(yùn)用抗生素進(jìn)行化學(xué)治療，這種治療手段一度有效地 控制了結(jié)核病在世界范圍內(nèi)的傳播和蔓延。然而近年來，原本已被有 效控制的結(jié)核病大有卷土重來之勢(shì)，其發(fā)病率和死亡率均明顯回升， 已成為與艾滋病、瘧疾并稱的傳染病。結(jié)核病死灰復(fù)燃的原因很多， 包括人口流動(dòng)性加大、HIV感染者增多以及多重耐藥菌不斷出現(xiàn)等。 除此之外，結(jié)核病難以徹底治愈、容易復(fù)發(fā)，還與結(jié)核分枝桿菌能夠 以"持留"狀態(tài)長期存在有密切關(guān)系。
感染人體的病原菌根據(jù)其與宿主細(xì)胞的關(guān)系可以分為胞外感染 菌和胞內(nèi)感染菌兩類，結(jié)核分枝桿菌就屬于后者。當(dāng)其入侵機(jī)體后， 巨嗡細(xì)胞可以將其吞噬并形成"吞噬體"。 一般說來，吞P藍(lán)體形成后 會(huì)與溶酶體迅速融合，由溶酶體產(chǎn)生的各種酶將其消化。而結(jié)核分枝
桿菌在被巨噬細(xì)胞吞噬后，可以通過自身產(chǎn)生并分泌的一些物質(zhì)，阻 止吞噬體的成熟及其與溶酶體的融合，從而使其自身免遭轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶 體最終被降解的命運(yùn)，而在巨噬細(xì)胞內(nèi)長期存留下來。此時(shí)的結(jié)核分 技桿菌，代謝活動(dòng)降至最低，生長繁殖幾乎停止，不易被抗菌藥物殺 滅，這種類似于休眠的長期存活狀態(tài)被定義為"持留"狀態(tài)，這種狀 態(tài)的結(jié)核分枝桿菌被稱之為持留菌，這是結(jié)核分枝桿菌逃避宿主免疫 系統(tǒng)的進(jìn)攻和抵抗藥物作用的一種手段。當(dāng)機(jī)體免疫力下降，如被 HIV感染、服用抗炎藥物或免疫抑制劑后，持留狀態(tài)的細(xì)菌又可恢復(fù)結(jié)核桿菌之所以可以形成持留狀態(tài)長 期存活，其原因是復(fù)雜的，涉及多方面的機(jī)制。近年來的研究表明，
這種狀態(tài)的形成和維持，與其產(chǎn)生的蛋白激酶G(PknG)---種絲氨
酸/蘇氨酸蛋白激酶有密切關(guān)系。
結(jié)核分枝桿菌基因組共編碼11種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分別 命名為PknA B、 PknD L。它們與真核生物的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激 酶一樣可以催化底物蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化。其中， PknG可以介導(dǎo)結(jié)核菌持留狀態(tài)的形成和維持。巨噬細(xì)胞在吞噬外來 的病原微生物后形成初級(jí)吞噬體，初級(jí)吞噬體經(jīng)過與胞內(nèi)其他囊泡的 一系列融合過程，特別是與溶酶體融合后，最終形成吞噬溶酶體，通 過其中的水解酶類將吞入的病原菌消化，這一系列過程稱為吞噬體的 成熟。吞噬體的成熟過程涉及巨噬細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，每條 通路都受到胞質(zhì)內(nèi)的一些酶或者蛋白因子調(diào)控。PknG通過使胞質(zhì)內(nèi) 某些與吞噬體成熟有關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)磷酸化來阻斷吞噬體的成熟過 程，從而使被吞入的結(jié)核菌免遭降解的命運(yùn)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)長期存活 下來，而;^2G基因突變的菌株則不能以持留狀態(tài)在宿主細(xì)胞內(nèi)存活。
鑒于PknG對(duì)于結(jié)核分枝桿菌持留狀態(tài)的形成和維持有如此重要 的作用，若能找到針對(duì)PknG特異而有效的抑制劑，則可以抑制結(jié)核 分枝桿菌的持留，從而為解決結(jié)核長期潛伏性感染這一難題打下基 礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌 藥物的方法，具體地講是一種以PknG為靶點(diǎn)，通過體外篩選 PknG抑制劑來篩選抗持留狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌藥物的方法。
本發(fā)明通過將待測(cè)樣品與PknG接觸，篩選能夠抑制PknG 活性的待測(cè)樣品，即為抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的藥物。
具體地說，將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋后加入到如下反應(yīng)體系中作為樣反應(yīng)物
Hepes
ATP
PEP
NADH
PknG
丙酮酸激酶 乳酸脫氫酶
終濃度
50 150mM
25 75mM
0.5 1.5mM
0.5~1.5mM
l 3(ig/100(al
0.5 1.5U/100(xl
0.5~1.5U/100|il
同時(shí)以不添加待測(cè)樣品組作為陰性對(duì)照，與陰性對(duì)照組相比單位 時(shí)間內(nèi)OD34o值的變化越小，則對(duì)PknG的抑制率越高。待測(cè)樣品的 終濃度可以是25 75mg/ml，可以根據(jù)具體的檢測(cè)對(duì)象稀釋到不同的 濃度，例如可以設(shè)置多個(gè)濃度梯度來考察待測(cè)樣品對(duì)PknG的抑制。
優(yōu)選的所述反應(yīng)體系如下
反應(yīng)物終濃度
lOOmM
ATP50mM
PEPImM
NADHImM
PknG2嗎/100(xl
丙酮酸激酶lU/lOO^l
乳酸脫氫酶lU/100|il 。
步設(shè)置陽性對(duì)照組，所述陽性對(duì)照組添加等體積的ddH20代替PknG,抑制率設(shè)為100%。
待測(cè)樣品對(duì)PknG的抑制率可通過如下方法計(jì)算:
抑制率IR =
△N-AS AN-AP
Xl00%:
其中，AN是陰性對(duì)照平均每分鐘吸光值的變化量；AP是陽性對(duì) 照平均每分鐘吸光值的變化量；AS是樣品平均每分鐘吸光值的變化 量。
本發(fā)明具體可通過如下步驟進(jìn)行篩選由遺傳工程大腸桿菌生產(chǎn) 重組PknG —對(duì)重組PknG酶活性進(jìn)行檢測(cè)—PknG抑制劑的篩選1. 由遺傳工程大腸桿菌生產(chǎn)重組PknG:
(1) 將結(jié)核分技桿菌編碼蛋白激酶G的基因/ &G克隆到 原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-;^"G，測(cè)序確定 所構(gòu)建的質(zhì)?；蛐蛄泻筒迦敕较虻恼_性；
(2) 用質(zhì)粒pET-;^7G轉(zhuǎn)化大腸桿菌B121(入DE3),篩選可 以通過IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)重組PknG的工程菌株；
(3) 對(duì)步驟(2)篩選得到的工程菌株進(jìn)行大量培養(yǎng)，裂解 培養(yǎng)物，釆用Ni +親和層析柱，通過親和層析的方法純化目的 蛋白得到重組PknG的純酶。
2. 對(duì)步驟1得到的重組PknG酶活性進(jìn)行檢測(cè)
(1) 檢測(cè)的原理 由于PknG具有自我嫌酸化的功能，可以催化將ATP上的嫌
酸基團(tuán)添加到自身的絲氨酸/蘇氨酸殘基使之嫌酸化，因此檢
測(cè)其催化活性時(shí)無需加入外源的底物蛋白，反應(yīng)式如下
① 未磷酸化的PknG + ATP歸 > 磷酸化的PknG + ADP
② 后續(xù)檢測(cè)步驟如下
ADP +轔酸烯醇式丙酮酸目1^, >ATP +丙酮酸 丙酮酸+ NADH + lT乳酸脫氫酶> NAD、乳酸
伴隨著NADH到NAD +這一反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系在
340nm波長下的光吸收值會(huì)不斷降低，其數(shù)值可通過分光光
度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)得。因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)反應(yīng)體系在340nm
波長下的光吸收值變化來反映體系中ADP的生成量，進(jìn)而反
映出PknG的催化活性大小。
(2) 酶活測(cè)定的具體反應(yīng)體系及步驟
酶活測(cè)定體系
反應(yīng)物 終濃度
H印es ' 100mM ATP 50mM PEP lmM
7NADH ImM PknG 2|ig/100jal 丙酮酸激酶 lU/lOOjul 乳酸脫氫酶 lU/100^1
具體步驟如下
①酶活測(cè)定體系中的各組分混合后加入96孔板中，每孔反應(yīng)體系總 體積為lOOpl (不足100pl用ddH20補(bǔ)足);陽性對(duì)照組不加酶，以相 同體積的ddH20代替。
1 96孔板置于酶標(biāo)儀中，在25"C狀態(tài)下測(cè)定各孔在340nm處光吸 收值，每隔2min測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定20次(即反應(yīng)40min)。 (3)結(jié)果分析
反應(yīng)結(jié)東后，分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組(加酶)與陽性對(duì)照組(不加酶)在單位 時(shí)間(如lmin)內(nèi)OD34o變化量，計(jì)算式如下 AOQWmii^(反應(yīng)結(jié)東時(shí)的OE^o值-反應(yīng)開始時(shí)的OE^o值)/反應(yīng)時(shí)間 陽性對(duì)照組由于未加PknG,其反應(yīng)體系中ATP轉(zhuǎn)化為ADP的 量極少，所以其光吸收值變化量也很小。通過比較實(shí)驗(yàn)組(加酶)與陽 性對(duì)照組(不加酶)AOD34。/min值相差的倍數(shù)可以反映出PknG酶活 性的大小，相差倍數(shù)越多說明PknG酶活性越強(qiáng)。 3. PknG抑制劑的篩選流程 (1)樣品制備
① 化合物純品取純品化合物溶到DMSO中，加DMSO倍比稀 釋，取稀釋液作用于檢測(cè)。
② 發(fā)酵液樣品菌種發(fā)酵，從斜面上挑取一小塊培養(yǎng)物種入盛有 發(fā)酵培養(yǎng)基的瓶中，搖床培養(yǎng)4-5曰。所得發(fā)酵液可直接用于檢測(cè)， 亦可取發(fā)酵液用丙酮抽提，揮干后，用DMSO溶解。取溶液加DMSO 倍比稀釋，再取稀釋液作用于檢測(cè)。
(2)樣品活性檢測(cè) 依照步驟2(2)中的反應(yīng)體系配制，分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組 和實(shí)驗(yàn)組① 陽性對(duì)照組反應(yīng)體系中不加PknG，以等體積的ddH20代之。 抑制率設(shè)為100%,該組表征PknG的活性被完全抑制。
②
陰性對(duì)照組加DMSO代替樣品于反應(yīng)體系中，該組表征PknG 的正常催化反應(yīng)過程。
③C、樣品實(shí)驗(yàn)組加待篩選的樣品于反應(yīng)體系中，該組表征 待篩選樣品對(duì)PknG活性的抑制程度。 將上述各組反應(yīng)體系分別混勻后加入同 一塊96孔板中，置于25 'C下反應(yīng)。每隔2分鐘在酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔反應(yīng)體系在340nm波長處
的吸光值OD34o(若酶標(biāo)儀本身具備控溫功能，可直接在酶標(biāo)儀內(nèi)進(jìn)行
反應(yīng))，連續(xù)檢測(cè)々0min。 (3)檢測(cè)結(jié)果的分析
結(jié)果分析方法與步驟2(3)的"結(jié)果分析"相同，計(jì)算各反應(yīng)孔
的△ OD340/min。
抑制率計(jì)算抑制率1仗==><100%
△N-AP
其中
AN是陰性對(duì)照孔平均每分鐘吸光值的變化量。 AP是陽性對(duì)照孔平均每分鐘吸光值的變化量。 AS是樣品孔平均每分鐘吸光值的變化量。
本發(fā)明方法通過考察樣品對(duì)PknG的抑制作用來篩選獲得抗持留 狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌藥物。結(jié)果表明，利用本發(fā)明方法篩選得到的 16株陽性菌株，其發(fā)酵液樣品均對(duì)PknG具有抑制作用物質(zhì)。篩選還 得到陽性化合物1個(gè)，IMB2036F2對(duì)PknG的抑制率達(dá)64.0%其對(duì) BCG在巨噬細(xì)胞內(nèi)持留作用具有一定的抑制作用。。


圖1為實(shí)施例1中構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-; ^G。下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以結(jié)核分枝桿菌綺co6"c^7^m ^&n^/a^ H3 7Rv基因組DNA 為模板，用PCR法擴(kuò)增p^G基因全序列。引物序列為上游引物5，TGGACATATGGCCAAAGCGTCAGAG 3;下游引物5' TCGCTCGAGATAGAACGTGCTGG 3，(下劃線所示為Ndel和Xhol的酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系如下5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10|aldNTP Mixture (各2.5mM) 一Forward Primer (20pM) 1 (ilReverse Primer (20pM) 1模板(70ng&l) 1^1PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/jal) 0，無菌ddH20 32.5nl總體積 50^1PCR反應(yīng)程序如下 98 °C變性 10s 60°C復(fù)性 15s 「35個(gè)循環(huán) 72 °C延伸 3min 」擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)驗(yàn)證后，插入到原核表達(dá)載體pET30a (Novagen)的多克隆位點(diǎn)(Ndel和Xhol)，得到質(zhì)粒pET-pknG,測(cè)序驗(yàn)證所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。實(shí)施例2 ;^:"G基因的誘導(dǎo)表達(dá)將實(shí)施例1中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET卞^G轉(zhuǎn)化大腸桿菌 B121(XDE3)感受態(tài)細(xì)胞。將含有pET-;^nG的大腸桿菌B121接種于含 50嗎/ml Kan的LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液變渾濁10后，按1: 100的比例將上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于含50|ig/ml Kan的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)至OD60()=0.6左右。向培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為lmM，轉(zhuǎn)入28。C 200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3-5h,離心收獲誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體。實(shí)施例3 PknG蛋白的分離純化將實(shí)施例2中收獲的菌體用裂解緩沖液震蕩重懸，以400W功率 超聲波裂解菌體，15000g離心30min以除去細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。由于 誘導(dǎo)表達(dá)的重組PknG帶有His-tag,因此用HisTrap HP鎳離子親 和層析柱作為純化介質(zhì)，通過AKTA explorer系統(tǒng)對(duì)PknG蛋白進(jìn)行 分離純化。純化后的蛋白經(jīng)脫鹽后于-8(TC凍存。 實(shí)施例4 樣品制備化合物樣品10mg純品化合物溶到lml DMSO中，取10|ul加 10plDMSO倍比稀釋，取l)il作用于lOOjul反應(yīng)體系，使其終濃度為 50|ig/ml。發(fā)酵液樣品菌種發(fā)酵，從斜面上挑取一小塊培養(yǎng)物種入盛有 50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C、 l卯轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng) 4天。取10ml發(fā)酵液用10ml的丙酮抽提，揮干后，用lml的DMSO 溶解。取10pl加10pl DMSO倍比稀釋，取lpl作用于100pl反應(yīng)體系。實(shí)施例5 樣品活性檢測(cè)配制如下反應(yīng)體系(每孔反應(yīng)體系總體積為lOOpl)反應(yīng)物終濃度lOOmM50mMNADHPknG丙酮酸激酶 乳酸脫氫酶2|ig/100(allU/100^1lU/100(il按以下分組向反應(yīng)體系中添加組分A. 陰性對(duì)照組加入lplDMSO(若篩選發(fā)酵液樣品，此處以lyl抽提后的發(fā)酵培養(yǎng)基代之，抽提過程同"樣 品制備"中的發(fā)酵液樣品抽提過程)B. 陽性對(duì)照組添加等體積的ddH20代替PknG。C. 樣品實(shí)驗(yàn)組加入lpl待測(cè)樣品 將上述各組反應(yīng)體系分別混勻后加入同一塊96孔板中，置于BMG公司的Polarstar酶標(biāo)儀內(nèi)，開啟溫控為25。C進(jìn)行反應(yīng)。以反應(yīng) 起始時(shí)間為0時(shí)刻，每隔2分鐘檢測(cè)一次各孔反應(yīng)體系在340nm波 長處的吸光值OD34。，連續(xù)檢測(cè)40min(20次)。結(jié)果分析分別計(jì)算各孔的△ OD34Q/min，再依公式抑制率IR= ^^xl00%計(jì)算各孔的抑制率。AN-AP篩選結(jié)果為從組合化學(xué)庫、微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物庫以及天然產(chǎn) 物庫中共篩選4820個(gè)樣品，其中2300個(gè)化合物，2520個(gè)發(fā)酵液樣品， 初篩陽性率63/4820=1.3%,復(fù)篩陽性率16/4820=0.3%。(以抑制率大 于50%為篩選陽性標(biāo)準(zhǔn)。初篩和復(fù)篩均釆用上述方法，初篩篩選出全 部具有抑制作用的化合物，復(fù)篩以抑制率大于50%的為陽性。)活性 化合物1個(gè)為IMB2036F2,抑制率為64.0%。實(shí)施例6抗持留狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌藥物檢驗(yàn)(1)人單核巨噬細(xì)胞系THP-1的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化THP-1細(xì)胞復(fù)蘇后，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基 中，于37。C 5。/。C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳至2-3代后，取對(duì)數(shù)生長期 生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5xl()S個(gè)/m1,接種于24孔培 養(yǎng)板中，每孔0.5ml。加入終濃度為100ng/ml的佛波酯(PMA)誘導(dǎo)24h， 24h后可見細(xì)胞由懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁狀態(tài)，細(xì)胞有偽足伸出，表明(2) 卡介苗(BCG)的培養(yǎng)及菌懸液制備BCG在含有0.05% Tween-80的7H9液體培養(yǎng)基中，于37°C 200rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。離心收集菌體，加少量含0.05%Tween-80 的無菌生理鹽水，用研缽適度研磨使聚集生長的菌體分散，再加RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成菌懸液，計(jì)算細(xì)菌濃度。(3) BCG感染THP-1細(xì)胞按照細(xì)菌數(shù)細(xì)胞數(shù)=50: l的比例，向誘導(dǎo)分化后的THP-1細(xì) 胞中添加BCG菌懸液，于37。C 5。/。C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使BCG感 染巨嗟細(xì)胞。感染4h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，并用無菌PBS洗滌細(xì)胞 3遍，更換新鮮培養(yǎng)基并加入終濃度為100pg/ml的卡那霉素(此時(shí)設(shè) 為感染Oh)作用4h以除去未被吞噬的細(xì)菌。之后更換為含30(ig/ml 卡那霉素的培養(yǎng)基，并加入實(shí)施例5中篩選得到的陽性化合物或發(fā)酵 液樣品，繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)，以等量的DMSO代替樣品作為陰性對(duì)照。(4) BCG在THP-1細(xì)胞內(nèi)存活狀況的檢測(cè)分別于感染24h、 48h,以1%的Triton X-100裂解細(xì)胞10min。 取裂解物用PBS緩沖液以十倍梯度稀釋成適當(dāng)濃度，分別涂布于 7H11瓊脂平板上，37'C培養(yǎng)20d后計(jì)數(shù)每個(gè)平板的菌落數(shù)，從而計(jì) 算細(xì)胞裂解物中的BCG的CFU。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組24h、 48h 的細(xì)胞裂解物的CFU無明顯差異；而加入陽性樣品的實(shí)驗(yàn)組，48h 細(xì)胞裂解物的CFU明顯少于24h細(xì)胞裂解物的CFU,前者約為后者 的1/4 2/3，特別是抑制率大于50%的陽性樣品，前者約為后者的 1/2 3/4。由此可見，實(shí)施例5中篩選得到的陽性樣品確實(shí)有抑制BCG 在巨噬細(xì)胞內(nèi)持留的作用。<110〉中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 <120〉 一種抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的藥物篩選方法 <130> KHP09113071,2 <歸 2〈170> Patentln version 3. 5<210> 1<211〉 25〈212〉 DNA 〈213〉人工序列<400> 1tggacatatg gcc朋agcgt cagag 25<210> 2<211〉 23<212> DNA 〈213〉人工序列<400〉 2tcgctcgaga tagaacgtgc tgg 231權(quán)利要求
1、一種篩選抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌藥物的方法，其特征在于，將待測(cè)樣品與PknG接觸，篩選能夠抑制PknG活性的待測(cè)樣品，即為抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的藥物。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，將待測(cè)樣品適當(dāng)稀 釋后加入到如下反應(yīng)體系中作為樣品實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)物H6p6SATP PEP NADH PknG丙酮酸激酶 乳酸脫氫酶終濃度50 150mM25~75mM0.5 1.5mM0.5 1.5mMl 3|ig/100|il0.5~1.5U/100jil0.5~1.5U/100pl同時(shí)以不添加待測(cè)樣品組作為陰性對(duì)照，與陰性對(duì)照組相比單位時(shí)間內(nèi)OD34。值的變化越小，則對(duì)PknG的抑制率越高。
3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系如下 反應(yīng)物ATP PEP NADHPknG丙酮酸激酶 乳酸脫氫酶終濃度lOOmM50mMImMImMlU/100|il
4、如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，其還設(shè)置有陽性對(duì)照組，所述陽性對(duì)照組以等體積的ddH20代替反應(yīng)體系中的PknG，抑制率設(shè)為100%,待測(cè)樣品對(duì)PknG的抑制率的計(jì)算方法是抑制率111=^^><100%， AN-AP其中，AN是陰性對(duì)照孔平均每分鐘吸光值的變化量；AP是陽性對(duì)照孔平均每分鐘吸光值的變化量；AS是樣品孔平均每分鐘吸光值 的變化量。
5、 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品 的終濃度為25~75mg/ml。
6、 一種抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的藥物，其含有按照權(quán)利要求 1~5任一所述方法篩選得到的PknG抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌藥物的篩選方法，其通過將待測(cè)樣品添加至酶活測(cè)定體系中，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)體系光吸收值的變化來判斷樣品對(duì)蛋白激酶G活性的抑制作用，從而篩選出抗持留狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的藥物。本發(fā)明的篩選方法選擇蛋白激酶G作為靶點(diǎn)，與以往抗結(jié)核藥物主要針對(duì)于生長繁殖活躍的細(xì)菌不同，本發(fā)明針對(duì)的是以持留狀態(tài)在宿主細(xì)胞內(nèi)長期存在的細(xì)菌，目的是解決結(jié)核分枝桿菌長期潛伏性感染的難題。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK101643774SQ20091009216
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者余利巖, 山 岑, 張玉琴, 邵天舒, 彬 黃 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所