專利名稱：：一種甲烷氧化混合菌的保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種甲垸氧化混合菌的保存方法。
背景技術(shù)：
：甲垸氧化菌是自然界中一類特殊的微生物，以甲垸為唯一碳源及能源，廣泛存在于泥土、沼澤、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。甲垸氧化菌以其獨(dú)特的性質(zhì)和多樣的催化功能，在大宗化學(xué)品生產(chǎn)、新功能酶開發(fā)、瓦斯氣體治理以及環(huán)境污染物的生物修復(fù)方面都具有極大的應(yīng)用潛力。但甲烷氧化菌純培養(yǎng)生長極為緩慢，功能不穩(wěn)定，且甲垸氧化菌純菌資源較少。而甲烷氧化混合菌是以甲烷氧化菌為主體的不同共生菌體的組合，相比純菌更有利于工業(yè)應(yīng)用。羅明芳等人研究表明，甲烷氧化混合菌具有高效降解苯酚、高效積累環(huán)氧丙垸的能力(羅明芳，等.含有甲垸氧化菌的混合菌群特性研究.微生物學(xué)報，2007，47(1):103~109.)。在應(yīng)用混合菌時，其功能的穩(wěn)定性，取決于菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而在甲烷氧化混合菌的保存方法上，既不能使用純菌保存常用的平板傳代法，也不能采用通常的添加保水性有機(jī)物(如甘油等)的菌種冷凍保存方法，因?yàn)槠桨鍌鞔^程會丟失混合菌中的大量菌種，而添加保水性有機(jī)物很容易弓I入其他碳源從而改變菌群結(jié)構(gòu)。因此，迫切需要既簡便易行，且能有效保持甲烷氧化混合菌的菌群結(jié)構(gòu)和功能的高效保存方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種甲烷氧化混合菌的保存方法。本發(fā)明所提供的甲垸氧化混合菌的保存方法，包括如下步驟將甲垸氧化混合菌加入NMS培養(yǎng)基中，于密封瓶中2-6'C保存；初始時，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80)。所述保存方法中，初始時，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比具體可為5:(2.5-3.5):(15-18)。所述保存方法中，所述甲烷氧化混合菌具體可為處于對數(shù)生長期的甲烷氧化混合菌o所述保存方法中，初始時，所述NMS培養(yǎng)基中所述甲烷氧化混合菌的0D腳為0.3-1.5，若OD66。小于0.3則會影響保存效果，增加活化的難度。所述保存方法中，最好每隔10-60天重新向密封瓶中充入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80)。重新充入甲垸后，所述密封瓶中，麗S培養(yǎng)基、甲垸和空氣的體積比優(yōu)選為5:(2.5-3.5):(15-18)。為保證菌種特性，可定期進(jìn)行轉(zhuǎn)接活化，轉(zhuǎn)接間隔時間最好不超過一年。需要使用甲烷氧化混合菌時，直接將保存有所述甲垸氧化混合菌的的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)即可。所述甲垸氧化混合菌的制備方法可包括如下步驟1)采集煤礦或垃圾填埋場的土樣；2)將步驟1)的土樣加入醒S培養(yǎng)基中，于密封瓶中培養(yǎng)；初始時，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲垸和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80);每24-72小時向密封瓶中置換入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80);3)每8-12天接種步驟2)的培養(yǎng)液至新的NMS培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代；步驟2)的培養(yǎng)液與NMS培養(yǎng)基的體積比為(5-15):(95-85);傳至10代以上，得到甲垸氧化混合菌。所述步驟2)具體可為初始時，所述密封瓶中，麗S培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18);每48小時向密封瓶中置換入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲垸和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18)。所述步驟3)具體可為每10天接種步驟2)的培養(yǎng)液至新的NMS培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代；步驟2)的培養(yǎng)液與NMS培養(yǎng)基的體積比為10:90;傳至第10代，得到甲烷氧化混合菌。所述NMS培養(yǎng)基配制方法具體如下將100ml溶液A和lml溶液B混合并用水定容至1L，滅菌后加入10ml滅菌后的溶液C，得到NMS培養(yǎng)基；每升所述溶液A的配制方法為將腦310g，MgS04.7H2010g，CaCl2.2H202g，水定容至1L;每升所述溶液B的配制方法為Fe-EDTA0.38g，腿。040.26g，F(xiàn)eS040.5g，MnCl24H200.02g，CoCl2'6H200.05g，H3B030.015g，Na-EDTA0.25g，ZnS04'7H200.4g，NiCl2.6H200.Olg，CuS04'5H200.025g，水定容至1L;每升所述溶液C的配制方法為Na2HP04'12H2071.6g，KH2P0426g，水定容至1L，pH值調(diào)至6.8。由于甲垸氧化菌的生長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于其他細(xì)菌，當(dāng)有非甲垸的碳源存在時，很容易改變甲垸氧化混合菌的菌群結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致混合菌功能上的變化。本發(fā)明提供的保存甲垸氧化混合菌的方法沒有引入其他碳源，可以穩(wěn)定地保持混合菌群的結(jié)構(gòu)和功能，并且操作方便，再次使用時可以快速啟動。所采用的NMS培養(yǎng)基，無需加入任何添加物，隔一兩個月充入少量甲烷即可，簡單經(jīng)濟(jì)，將在甲烷氧化混合菌的保存及其工業(yè)化應(yīng)用中發(fā)揮巨大作用，應(yīng)用前景廣闊。圖l為甲垸氧化混合菌的變性梯度凝膠電泳圖。1:一直傳代培養(yǎng)的甲烷氧化混合菌；2:本發(fā)明的方法保存后的甲烷氧化混合菌。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。甲烷去除率的檢測方法如下在250ml的可密封的玻璃培養(yǎng)瓶中分裝50ml麗S液體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基中接種lmlOD6^1.0的甲烷氧化混合菌，加蓋密封橡膠塞，在上層空氣中置換入30ml甲烷(使瓶中空氣與甲烷的體積比約為5:1)。30°C、170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)，每24小時用氣相色譜檢測甲垸的剩余量(％，體積百分含量)。每次檢測完甲垸剩余含量之后，打開密封蓋，使內(nèi)部氣體與外部氣體流通，然后重新加蓋密封橡膠塞，并重新在上層空氣中置換入30ml甲烷(使瓶中空氣與甲烷的體積比約為5:1)，同時用氣相色譜檢測甲垸起始量(％，體積百分含量)。甲垸去除率=(甲垸起始量-甲烷剩余量)/甲垸起始量X100呢。實(shí)施例l、甲垸氧化混合菌的獲得一、土樣采集和培養(yǎng)基配制土壤樣品從河南省新峰礦物局的一個高瓦斯煤礦四礦采樣，樣品取自該煤礦排風(fēng)口處表層5cm深土壤，土壤樣品的基本性質(zhì)見表l。表1新峰煤礦土壤樣品性質(zhì)(取樣日期2006年10月9日)檢測參數(shù)樣品性質(zhì)煤礦參數(shù)CIi濃度(%v/v)0.3C02濃度(％v/v)0.1空氣流速(mVmin)3800土壤參數(shù)土壤含水量(％，質(zhì)量百分含量)31.46土壤溫度(°c)26-27土壤pH9.4甲垸吸收速度(wmol/每天每克土壤)3.0用于培養(yǎng)和篩選甲垸氧化混合菌的培養(yǎng)基為NMS培養(yǎng)基，配制方法如下:溶液A(每升):跳10g，MgS04.7H2010g，CaCl2'2H202g，去離子水定容至1L;溶液B(每升):Fe-EDTA0.38g，NaMo040.26g，F(xiàn)eS040.5g，MnCl2'4H200.02g，CoCl2.6H200.05g，H3B030.015g，Na-EDTA0.25g，ZnS04.7H200.4g，NiCl2'6H200.Olg，CuS04.5H200.025g，去離子水定容至IL;溶液C(每升):Na2HP04.12H2071.6g，KH2P0426g，去離子水定容至1L，pH值調(diào)至6.8，高溫(121°C)滅菌；NMS培養(yǎng)基lOOml溶液A，lml溶液B，去離子水定容至1L，高溫(12rC)滅菌；在高溫滅菌后的混合液中加入10ml滅菌后的溶液C(如配置固體培養(yǎng)基則加入15g瓊脂粉)。二、甲烷氧化混合菌的培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)采用250ml螺口搖瓶，裝50mlNMS液體培養(yǎng)基，加入5g土壤樣品，利用帶有聚四氟乙烯密封墊的瓶蓋密封，在上層空氣中置換入30ml甲垸(使瓶中空氣與甲烷的體積比約為5:1);3(TC，170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)；每48小時重新置換入30ml甲垸(使瓶中空氣與甲垸的體積比約為5:1)。三、甲垸氧化混合菌的傳代每10天接種10W的培養(yǎng)液至新的NMS培養(yǎng)基中，作為一次傳代，培養(yǎng)方法同步驟二。對傳至第10代的甲烷氧化混合菌進(jìn)行群落多樣性鑒定，方法為對穩(wěn)定菌群的部分變性梯度凝膠電泳(DGGE，DenaturingGradientGelElectrophoresis)條帶進(jìn)行測序，并使用RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)方法進(jìn)行克隆建庫分析，通過序列比對分析，表明甲垸氧化混合菌中包括的細(xì)菌至少包括下面的菌屬甲基單胞菌屬(臉t力77o/z朋as)、嗜甲基菌屬(ifez^^o/7/^7M)、甲基孢囊菌屬(fetA77ocy5"tJ'51)、ifet^r7o57'7W5"、甲基桿菌屬(ifez^K7o力acte/0、噬氫菌屬(^KO^^e"o;A3卵)、類芽胞桿菌屬(尸ae"i力acj77iAS)、鞘脂單胞菌屬(5^力/^v9/ff(m350、芽孢桿菌屬(5aci77〃s0。實(shí)施例2、甲烷氧化混合菌的保存和保存效果鑒定一、甲垸氧化混合菌的保存取50ml實(shí)施例1獲得的含有第10代的甲垸氧化混合菌(培養(yǎng)至對數(shù)生長期)的NMS液體培養(yǎng)基(0066。為1)，裝入250ml的可密封的已滅菌玻璃培養(yǎng)瓶中，加蓋密封橡膠塞。在上層空氣中置換入30ml甲烷，使瓶中空氣與甲垸的體積比約為5:1。置于4'C保存，每月置換培養(yǎng)瓶中的氣體，使密封瓶中含有30ml甲烷。二、保存效果鑒定1、甲烷氧化混合菌的活化甲烷氧化混合菌保存三個月后，進(jìn)行活化，具體如下向保存有甲垸氧化混合菌的密封瓶中充入甲烷(使瓶中含有30ml甲垸)，30°C、170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)4天，每48小時重新置換入甲烷。將活化后的甲烷氧化混合菌分別進(jìn)行以下步驟2、3、4的鑒定。同時，將實(shí)施例1獲得的第10代的甲垸氧化混合菌一直傳代培養(yǎng)，作為對照，進(jìn)行如下步驟2、3、4的鑒定。另外，將甘油保存(15%甘油，-S(TC凍存三個月)的實(shí)施例1獲得的第10代的甲烷氧化混合菌進(jìn)行同樣的活化，然后進(jìn)行如下步驟2和步驟3的實(shí)驗(yàn)。2、生長速度鑒定將步驟l的甲烷氧化混合菌接入50mlNMS培養(yǎng)基中，使初始濃度0D660為0.05，每天充入新的甲烷30ral，密封，30。C、170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后，本發(fā)明的方法保存后的甲烷氧化混合菌的OD腳達(dá)到l以上，與一直傳代培養(yǎng)的甲烷氧化混合菌的生長速度相當(dāng)，而甘油保存后的甲垸氧化混合菌的0De6。為0.3。結(jié)果說明，經(jīng)本發(fā)明的保存方法保存后，甲烷氧化混合菌仍能保持較快的生長速度。3、耗甲垸能力的鑒定檢測步驟l的甲烷氧化混合菌的甲垸去除率。試驗(yàn)設(shè)置3瓶重復(fù)，結(jié)果取平均值，結(jié)果見表2。表2甲烷氧化混合菌對甲烷的去除率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明保存方法保存后，甲烷氧化混合菌仍然具有高效的去除甲垸的能力。4、菌群結(jié)構(gòu)的鑒定分別提取步驟1的甲烷氧化混合菌的基因組DNA，通過PCR-DGGE的方法考察微生物群落的變化。PC財廣增所使用的引物如下341f—GC(序列表的序列l(wèi)):5'-cgcccgccgcgccccgcgcccgtcccgccgcccccgcccgCCTACGGGAGGCAGCAG-3';907r(序列表的序列2):5'-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3'。PCR的反應(yīng)條件為94"C預(yù)變性5min，循環(huán)過程為94t:lmin、退火溫度lmin、72°C3min(其中退火溫度從6555。C，每個溫度2個循環(huán))，72。C延伸7min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用l.0%瓊脂糖變性梯度凝膠電泳檢驗(yàn)。瓊脂糖凝膠電泳條件為6%的聚丙烯凝膠，40%-70%的變性劑梯度，85V恒壓，60°C，840min。走膠結(jié)束后，采用SYBRGold(MolecularProbesTM，InvitrogenCo.，CA)染色lh，用紫外檢測并照相。電泳圖見圖l。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法保存后的甲烷氧化混合菌的DNA指紋和一直傳代培養(yǎng)的甲烷氧化混合菌非常接近，說明本發(fā)明的保存方法能很好的保持菌群結(jié)構(gòu)的多樣性。序列表<110>清華大學(xué)〈120>—種甲烷氧化混合菌的保存方法〈130〉CGGNARY92526〈160〉2〈210〉1<211〉57〈212>靈〈213〉人工序列〈220〉<223〉<400>1cgcccgccgcgccccgcgcccgtcccgccgcccccgcccgcctacgggaggcagcag57<210>2<211〉20〈212〉腿<213>人工序列〈220〉<223><400>2ccgtcaattcmtttgagttt2010權(quán)利要求1、一種甲烷氧化混合菌的保存方法，包括如下步驟將甲烷氧化混合菌加入NMS培養(yǎng)基中，于密封瓶中2-6℃保存；初始時，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于初始時，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲垸和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18)。3、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述甲烷氧化混合菌為處于對數(shù)生長期的甲垸氧化混合菌。4、如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于初始時，所述醒S培養(yǎng)基中所述甲垸氧化混合菌的0D,為0.3-1.5。5、如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于每隔10-60天重新向密封瓶中充入甲烷，使所述密封瓶中，麗S培養(yǎng)基、甲垸和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80)。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于重新充入甲烷后，所述密封瓶中，醒S培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18)。7、如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述甲烷氧化混合菌的制備方法包括如下步驟1)采集煤礦或垃圾填埋場的土樣；2)將步驟l)的土樣加入NMS培養(yǎng)基中，于密封瓶中培養(yǎng)；初始時，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80);每24-72小時向密封瓶中置換入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80);3)每8-12天接種步驟2)的培養(yǎng)液至新的NMS培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代；步驟2)的培養(yǎng)液與NMS培養(yǎng)基的體積比為(5-15):(95-85);傳至10代以上，得到甲垸氧化混合菌。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，初始時，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18);每48小時向密封瓶中置換入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲垸和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18)。9、如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，每10天接種步驟2)的培養(yǎng)液至新的NMS培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代；步驟2)的培養(yǎng)液與NMS培養(yǎng)基的體積比為10:90;傳至第10代，得到甲垸氧化混合菌。10、如權(quán)利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述NMS培養(yǎng)基配制方法如下將100ml溶液A和lml溶液B混合并用水定容至lL，滅菌后加入10ml滅菌后的溶液C，得到NMS培養(yǎng)基；每升所述溶液A的配制方法為將KN0310g，MgS04'7H2010g，CaCl2'2H202g，水定容至1L;每升所述溶液B的配制方法為Fe-EDTA0.38g，NaMo040.26g，F(xiàn)eS040.5g，MnCl2'4H200.02g，CoCl2,6H200.05g，H3B030.015g，Na-EDTA0.25g，ZnS04-7H200.4g，NiCl2'6H20O.Olg，CuS04'5H200.025g，水定容至1L;每升所述溶液C的配制方法為Na2HP0,12H2071.6g，KH2P0426g，水定容至1L，pH值調(diào)至6.8。全文摘要本發(fā)明公開了一種甲烷氧化混合菌的保存方法。本發(fā)明提供的甲烷氧化混合菌的保存方法，包括如下步驟將甲烷氧化混合菌加入NMS培養(yǎng)基中，于密封瓶中2-6℃保存；初始時，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。本發(fā)明提供的方法沒有引入其他碳源，可以穩(wěn)定地保持混合菌群的結(jié)構(gòu)和功能，并且操作方便，可以快速啟動。將在甲烷氧化混合菌的保存及其工業(yè)化應(yīng)用中發(fā)揮巨大作用，應(yīng)用前景廣闊。文檔編號C12N1/20GK101638632SQ200910092358公開日2010年2月3日申請日期2009年9月7日優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日發(fā)明者昊吳,翀張,程楊,皓江,邢新會,冰韓申請人:清華大學(xué)