專(zhuān)利名稱(chēng)：用于降解黃曲霉毒素b1的粘球菌菌株及其活性蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及粘球菌，特別是，涉及一種用于降解黃曲霉毒素B1 的粘球菌菌株及其活性蛋白。
背景技術(shù)：
自從1960年黃曲霉毒素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，科學(xué)工作者便不斷地研究該 類(lèi)毒素的預(yù)防和去毒方法。目前對(duì)黃曲霉毒素解毒方法的研究大部分 集中在化學(xué)處理法，和物理脫毒法等。傳統(tǒng)的理化方法去毒都存在一 些問(wèn)題，如導(dǎo)致甸料中的營(yíng)養(yǎng)損失，影響飼料的感官品質(zhì)，有些方法 所需要的設(shè)備價(jià)格昂貴等等，從而限制了實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。利用微生物脫毒的報(bào)道，多集中在近十年。國(guó)內(nèi)研究不多，只有 劉大嶺發(fā)現(xiàn)一種真菌代謝產(chǎn)物具有降解毒素的作用。國(guó)外的研究報(bào)道 比較多的集中在乳酸菌，雙歧桿菌，酵母菌和白腐真菌等，還有橙色 黃桿菌，紅球菌，假密環(huán)菌，根霉菌等的報(bào)道。對(duì)于乳酸菌，雙歧桿 菌和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50%以下，而且最 關(guān)鍵的是這種去除機(jī)制是可逆的結(jié)合，而不是對(duì)毒素的降解。其他一 些細(xì)菌和真菌的解毒研究表明，大部分菌的降解效率不高，降解效率 受作用時(shí)間，溶液pH值，菌體數(shù)量，毒素濃度，金屬離子濃度等 影響，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種微生物能完全的不可逆的降解飼料中的黃曲霉 毒素。至今為止，還沒(méi)有關(guān)于粘細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素的 報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種粘球菌菌株及其活性蛋白，以解決現(xiàn)有 技術(shù)中存在的上述問(wèn)題。本發(fā)明提供一種能產(chǎn)生降解黃曲霉毒素B1的活性蛋白的粘球菌菌株M^:ococcw/"/v附ANSM068 CGMCC No. 3194。本發(fā)明還提供一種制備能降解黃曲霉毒素Bl的活性蛋白的方 法，包括利用上述粘球菌菌株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，用溶劑提取發(fā)酵液中 的活性蛋白。所述搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基包括下述組分酵母粉5-10g, CaCl2'2H20 0.5-1.5g， VB12 0.3-lmg,蒸餾水800-1200 mL; pH值為7.0-8.0。優(yōu)選 地，包括酵母粉7g, CaCl2'2H20 1 g, VB120.75 mg,蒸餾水1000mL, pH值為7.5。所述搖瓶發(fā)酵的條件為發(fā)酵溫度為20-35'C，發(fā)酵時(shí)間30-60h， pH值7.0-8.0，轉(zhuǎn)速100-200r/min。優(yōu)選地，所述發(fā)酵溫度30。C，發(fā)酵 時(shí)間50h, pH值7.5，轉(zhuǎn)速160r/min。搖瓶發(fā)酵結(jié)東后，過(guò)濾掉發(fā)酵液中的菌體得上清液，用冰預(yù)冷的 體積比為95%的乙醇溶液沉淀提取活性蛋白，沉淀時(shí)間可為30min。本發(fā)明還提供一種從粘球菌菌株Mjaoc0ccw /w/v^ ANSM068 CGMCC No. 3194中制備得到的能降解黃曲霉毒素B 1的活性蛋白(又 稱(chēng)解毒酶)。本發(fā)明進(jìn)一步提供降解黃曲霉毒素B1的方法，包括下述步驟取 粘球菌菌株M^wcocc^y^vw ANSM068 CGMCC No. 3194中得到的 發(fā)酵液或活性蛋白，加入黃曲霉毒素B1溶液，將反應(yīng)體系調(diào)整至pH 值為5.0-9.0,在20-40 °C反應(yīng)48-72h后即可去除溶液中的黃曲霉毒素。優(yōu)選地，將反應(yīng)體系調(diào)整至pH值7.5,在3(TC反應(yīng)72h后即可去除 溶液中的黃曲霉毒素。上述菌株是以特異性方法篩選得到的橙色粘球菌ANSM068,已 于2009年7月17日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，其簡(jiǎn)稱(chēng) 為CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 3194。粘球菌菌株ANSM068具有下述性質(zhì)l)形態(tài)特征營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀、兩端尖、細(xì)胞略屈；粘孢子球形、有折射性、直徑1.5微米；子實(shí)體為橙色球形孢囊、下端收縮、 并有一根明顯的柄、不分支；菌落橙色、滑動(dòng)生長(zhǎng)、成薄的擴(kuò)展菌落 群。2)理化特性表1試驗(yàn)項(xiàng)目試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目試驗(yàn)結(jié)果剛果紅吸附試驗(yàn)+淀粉水解+酵母菌消化試驗(yàn)+氧化酶-水解纖維素-接觸酶+水解酪素+本發(fā)明粘球菌菌株得到的活性蛋白及其解毒方法具有以下有益 效果1) 該活性蛋白添加在飼料中，能夠降低黃曲霉毒素對(duì)小鼠的毒 性，提高小鼠血清中蛋白含量及免疫能力，部分消除毒素其對(duì)免疫功能、抗氧化能力等的不良影響；2) 生物酶法降解黃曲霉毒素效率高，特異性強(qiáng)，對(duì)銅料和環(huán)境 沒(méi)有污染，有效地解決了傳統(tǒng)去毒方法存在的問(wèn)題。3) 本發(fā)明方法解毒活性高，作用專(zhuān)一，作用效果溫和，不會(huì)破 壞銅料中的營(yíng)養(yǎng)成分，適用于在飼料工業(yè)中黃曲霉毒素的去除。


圖l對(duì)照組黃曲霉毒素B1圖譜；圖2蛋白酶處理組黃曲霉毒素B1圖譜。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。 黃曲霉毒素B1為巿購(gòu)，購(gòu)于Sigma公司；PBS (0.01mol/L)的制備過(guò)程稱(chēng)取8g NaCl、 0.2g KC1、 1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.5，最后加蒸餾水定容至1L即可。 實(shí)施例1本發(fā)明活性蛋白的制備利用粘球菌菌株il^xococcws /w/v附 ANSM068 CGMCC No. 3194，搖瓶發(fā)酵做種子液，其發(fā)酵溫度為30 。C， pH值7.5，轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵時(shí)間50h。其中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分酵母粉7g， CaCl2*2H20 lg, VB12 0.75mg,蒸餾水1000ml; pH值為7.5。將種子液以20% (占總發(fā)酵培養(yǎng)基體積)的接種量接種到10L發(fā) 酵罐中，其發(fā)酵溫度為30。C， pH值7.5，溶氧量60%，轉(zhuǎn)速200r/min, 發(fā)酵時(shí)間30h，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后，用8層紗布過(guò)濾除去菌體，得到的上清液用3倍體積 冰預(yù)冷的乙醇(體積比為95% )溶劑沉淀，冷凍離心(轉(zhuǎn)速4000r/min， 離心15min)，得到粗酶液，溶于冰預(yù)冷的0.01mol/LPBS緩沖液中，凍 干濃縮得到活性蛋白。 實(shí)施例2本發(fā)明活性蛋白的制備利用粘球菌菌株M^cococc^ /w/v附 ANSM068 CGMCC No. 3194，搖瓶發(fā)酵做種子液，其發(fā)酵溫度為25 。C,發(fā)酵時(shí)間60h， pH值7.0，轉(zhuǎn)速100r/min;其中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分酵母粉5g, CaCl2'2H20 1.5， VB12 0.3mg，蒸餾水1000ml; pH值為7.0。將種子液以20% (占總發(fā)酵培養(yǎng)基體積)的接種量接種到10L發(fā) 酵罐中，其發(fā)酵溫度為35。C, pH值8.0，溶氧量60%,轉(zhuǎn)速200r/min， 發(fā)酵時(shí)間30h，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后，用8層紗布過(guò)濾除去菌體，得到的上清液用3倍體積 冰預(yù)冷的乙醇(體積比為95% )溶劑沉淀，冷凍離心(轉(zhuǎn)速4000r/min， 離心20min)，得到粗酶液，溶于冰預(yù)冷的0.01mol/LPBS緩沖液中，凍 干濃縮得到活性蛋白。實(shí)施例3本發(fā)明活性蛋白的制備利用粘球菌菌株M少jwcoccm >/vw ANSM068 CGMCC No. 3194，搖瓶發(fā)酵做種子液，其發(fā)酵溫度為35 °C， pH8.0值，轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時(shí)間30h。其中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分酵母粉10g, CaCl2'2H20 0.5g， VB12 l.Omg，蒸餾水1000ml; pH值為7.0。將種子液以20% (占總發(fā)酵培養(yǎng)基體積)的接種量接種到10L發(fā) 酵罐中，其發(fā)酵溫度為20。C, pH值7.0,溶氧量60%,轉(zhuǎn)速100r/min， 發(fā)酵時(shí)間60h，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后，用8層紗布過(guò)濾除去菌體，得到的上清液用3倍體積 冰預(yù)冷的乙醇(體積比為95% )溶劑沉淀，冷凍離心(轉(zhuǎn)速4000r/min， 離心15min)，得到粗酶液，溶于冰預(yù)冷的0.01mol/LPBS緩沖液中，凍 干濃縮得到活性蛋白。 實(shí)施例4本發(fā)明活性蛋白的制備利用粘球菌菌株Mjxococc船/w/vw ANSM068 CGMCC No. 3194，搖瓶發(fā)酵做種子液，其發(fā)酵溫度為30 。C， pH值7.5,轉(zhuǎn)速160r/min,發(fā)酵時(shí)間50h。其中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分酵母粉7g， CaCl2'2H20 lg, VB12 0.75mg,蒸餾水1000ml; pH值為7.5。將種子液以20% (占總發(fā)酵培養(yǎng)基體積)的接種量接種到10L發(fā) 酵罐中，其發(fā)酵溫度為30。C， pH值7.5，溶氧量60%，轉(zhuǎn)速200r/min, 發(fā)酵時(shí)間30h，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后，用8層紗布過(guò)濾除去菌體，得到的上清液用3倍體積 冰預(yù)冷的乙醇(體積比為95%)溶劑沉淀，冷凍離心(轉(zhuǎn)速4000r/min， 離心15min),得到粗酶液。 實(shí)施例5利用實(shí)施例1得到的活性蛋白降解黃曲霉毒素B 1:將凍干濃縮的蛋白酶稱(chēng)取0.01g,溶于lml PBS (0.01mol/L)緩沖液，吸取800ul與 200ul黃曲霉毒素Bl (500ppb)反應(yīng)；對(duì)照組為800ul PBS緩沖液中加 入200ul黃曲霉毒素Bl (500ppb);各處理在30。C反應(yīng)72h后，用高效 液相色譜柱后衍生測(cè)黃曲霉毒素B1的濃度。進(jìn)樣前，對(duì)樣品進(jìn)行前處 理，首先將各樣品離心5min,再用0.22um濾膜進(jìn)行過(guò)濾，上機(jī)。上機(jī) 檢測(cè)條件流動(dòng)相為甲醇水=1: 1，流速lml/min,激發(fā)波長(zhǎng)350nm, 發(fā)射波長(zhǎng)440nm,上樣量10ul，黃曲霉毒素的出峰時(shí)間為9.56s左右。 檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比蛋白酶處理組黃曲霉毒素B1的降解率為 83.5%，圖1為對(duì)照組黃曲霉毒素B1的檢測(cè)圖譜，圖2為蛋白酶處理組 黃曲霉毒素B1的檢測(cè)圖譜。 實(shí)施例6
利用實(shí)施例2得到的活性蛋白降解黃曲霉毒素B1:將凍干濃縮的 蛋白酶稱(chēng)取0.01g,溶于lml PBS (0.01mol/L)緩沖液，吸取800ul與 200ul黃曲霉毒素Bl (500ppb)反應(yīng)；對(duì)照組為800ul PBS緩沖液中加 入200ul黃曲霉毒素Bl (500ppb);各處理在35。C反應(yīng)48h后,用高效 液相色譜柱后衍生測(cè)黃曲霉毒素B1的濃度。進(jìn)樣前，對(duì)樣品進(jìn)行前處 理，首先將各樣品離心5min,再用0.22um濾膜進(jìn)行過(guò)濾，上機(jī)。上機(jī) 檢測(cè)條件流動(dòng)相為甲醇水=1: 1，流速lml/min，激發(fā)波長(zhǎng)350nm， 發(fā)射波長(zhǎng)440nm,上樣量10ul，黃曲霉毒素的出峰時(shí)間為9.56s左右。 檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比蛋白酶處理組黃曲霉毒素B1的降解率為 81.5%。 實(shí)施例7
利用實(shí)施例3得到的活性蛋白降解黃曲霉毒素B 1:將凍千濃縮的 蛋白酶稱(chēng)取0.01g,溶于lml PBS (0.01mol/L)緩沖液，吸取800ul與 200ul黃曲霉毒素Bl ( 500ppb)反應(yīng)；對(duì)照組為800ulPBS緩沖液中加 入200ul黃曲霉毒素Bl ( 500ppb);各處理在3(TC反應(yīng)56h后，用高效 液相色譜柱后衍生測(cè)黃曲霉毒素B1的濃度。進(jìn)樣前，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，首先將各樣品離心5min，再用0.22um濾膜進(jìn)行過(guò)濾，上機(jī)。上機(jī) 檢測(cè)條件流動(dòng)相為甲醇水=1: 1，流速lml/min，激發(fā)波長(zhǎng)350nm, 發(fā)射波長(zhǎng)440nm，上樣量10ul，黃曲霉毒素的出峰時(shí)間為9.56s左右。 檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比蛋白酶處理組黃曲霉毒素B1的降解率為 82.0%。 實(shí)施例8
利用實(shí)施例4得到的粗酶液降解黃曲霉毒素B1:將凍干濃縮的粗 酶液稱(chēng)取0.01g，溶于lmlPBS(0.01mol/L)緩沖液，吸取800ul與200ul 黃曲霉毒素B 1 ( 500ppb )反應(yīng)；對(duì)照組為800ul PBS緩沖液中加入200ul 黃曲霉毒素B1 ( 500ppb);各處理在3(TC反應(yīng)72h后，用高效液相色譜 柱后衍生測(cè)黃曲霉毒素B1的濃度。進(jìn)樣前，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，首先 將各樣品離心5min,再用0.22um濾膜進(jìn)行過(guò)濾，上機(jī)。上機(jī)檢測(cè)條件 流動(dòng)相為甲醇水=1: 1，流速lml/min,激發(fā)波長(zhǎng)350nm，發(fā)射波長(zhǎng) 440nm，上樣量10ul，黃曲霉毒素的出峰時(shí)間為9.56s左右。檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比粗酶液處理組黃曲霉毒素B 1的降解率為79.5%。
9
權(quán)利要求
1、一種能產(chǎn)生降解黃曲霉毒素B1的活性蛋白的粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068CGMCC No.3194。
2、 一種制備能降解黃曲霉毒素B1的活性蛋白的方法，其特征在 于，利用權(quán)利要求l所述粘球菌菌株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，用溶劑提取發(fā) 酵液中的活性蛋白。
3、 如權(quán)利要求2所述的活性蛋白的制備方法，其特征在于，所述 搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基包括下述組分酵母粉5-10g， CaCl2'2H2O0.5-1.5g， VB12 0.3-lmg，蒸餾水800-1200mL; pH值為7.0-8.0。
4、 如權(quán)利要求2所述的活性蛋白的制備方法，其特征在于，所述 搖瓶發(fā)酵的條件為發(fā)酵溫度為20-35。C,發(fā)酵時(shí)間30-60h, pH值 7.0-8.0，轉(zhuǎn)速100-200r/min。
5、 如權(quán)利要求2所述的活性蛋白的制備方法，其特征在于，搖瓶 發(fā)酵結(jié)東后，過(guò)濾掉發(fā)酵液中的菌體得上清液，用冰預(yù)冷的體積比為 95%的乙醇溶液沉淀提取活性蛋白。
6、 一種從粘球菌菌株M;;;cococcuy/w/vw ANSM068 CGMCC No. 3194中制備得到的能降解黃曲霉毒素B1的活性蛋白。
7、 一種降解黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括下述步驟: 取權(quán)利要求1所述菌株的發(fā)酵液或權(quán)利要求6所述的活性蛋白，加入黃 曲霉毒素B1溶液，將反應(yīng)體系調(diào)整至pH值為5.0-9.0,在20-4(TC反應(yīng) 48-72h后即可去除溶液中的黃曲霉毒素。
8、 如權(quán)利要求7所述的降解黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于， 將反應(yīng)體系調(diào)整至pH值7.5,在30'C反應(yīng)72h后即可去除溶液中的黃曲 霉毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于降解黃曲霉毒素B1的粘細(xì)菌菌株及其活性蛋白，該活性蛋白由粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068 CGMCCNo.3194產(chǎn)生。其降解黃曲霉毒素B1的方法，包括下述步驟取上述得到的活性蛋白，加入黃曲霉毒素B1溶液，將反應(yīng)體系調(diào)整至pH5.0-9.0，在20-40℃反應(yīng)48-72h后即可去除溶液中的黃曲霉毒素。本發(fā)明得到的活性蛋白解毒活性高，作用專(zhuān)一，作用效果溫和，不會(huì)破壞飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分，適用于在飼料工業(yè)中黃曲霉毒素的去除。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101659929SQ200910092920
公開(kāi)日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日
發(fā)明者舒 關(guān), 牛天貴, 成 計(jì), 趙麗紅, 馬秋剛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)