專(zhuān)利名稱：檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器的改進(jìn)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對(duì)檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器構(gòu)建的改進(jìn)技 術(shù)。細(xì)菌為大腸桿菌。該技術(shù)用于改進(jìn)生物傳感器信號(hào)強(qiáng)度不足及提高傳感器的靈敏度。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著工業(yè)化和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，大量使用合成物質(zhì)和化學(xué)農(nóng)藥 等產(chǎn)品，人類(lèi)不斷向環(huán)境中排放大量污染物物質(zhì)，這些都使人類(lèi)的健康乃至生命受到威 脅。甲苯類(lèi)有機(jī)物的廣泛使用，已經(jīng)嚴(yán)重污染環(huán)境。甲苯類(lèi)的有機(jī)物已經(jīng)被列為污染水 體，土壤的黑名單，必須進(jìn)行檢測(cè)控制。
監(jiān)測(cè)和檢測(cè)污染物主要有兩種方法一是物理化學(xué)分析法。其準(zhǔn)確度和靈敏度 都很高，但需要成套昂貴的精密分析儀器和專(zhuān)業(yè)化實(shí)驗(yàn)室，并且這種方法在一些污染物 檢測(cè)中無(wú)法實(shí)現(xiàn)on-site檢測(cè)。另一種方法是直接利用生物體對(duì)特定污染物的響應(yīng)進(jìn)行檢 測(cè)，也就是近幾年內(nèi)引起關(guān)注的全細(xì)胞生物監(jiān)測(cè)。但是目前構(gòu)建生物傳感器存在信號(hào)強(qiáng) 度表較差，靈敏度不夠嚴(yán)重制約了微生物傳感器的應(yīng)用。本發(fā)的細(xì)胞傳感器構(gòu)建的改進(jìn) 技術(shù)明顯提高了發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器的改進(jìn)技術(shù)提出了一種可以 效改進(jìn)微生物細(xì)胞傳感器的信號(hào)強(qiáng)度以及靈敏度的方法。
本發(fā)明檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器的改進(jìn)技術(shù)是在利用惡臭假 單胞菌中的能夠特異的降解甲苯類(lèi)有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋白基因與商業(yè)化質(zhì) 粒中信號(hào)強(qiáng)度高的Luc報(bào)告基因一起構(gòu)建出的一種有效檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物 細(xì)胞傳感器的基礎(chǔ)上利用T7噬菌體GlO蛋白的前導(dǎo)序列，包括SD序列以及增強(qiáng)子序列 來(lái)改進(jìn)細(xì)胞傳感器信號(hào)強(qiáng)度弱，靈敏度低等問(wèn)題。
本發(fā)明檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器的具體操作步驟為
1、擴(kuò)增載體片斷
首先利用DELNot-Spe I引物以商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc為模板擴(kuò)增得到線性 化片斷，DEL Not I-Spe I 上游 gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATG CACTAGTTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC ； DEL Not I-Spe I 下游GACTGAGCTC GGAAATTGTAAGCGTTAATAT ；分別用Not I與Spe I進(jìn)行酶切處理，并進(jìn)行純化處理；
2、擴(kuò)增終止子片斷；
禾Ij用 下 列 弓 I 物 R R N B Spe 1:5 ‘ ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3 ‘ RRNB NOT 1:5' ATTAGCGGCCGC GAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3 ‘以大腸桿菌基因組為模版進(jìn)行擴(kuò)增得到RRNB終止子序列片斷，利用Not I與Spe I進(jìn)行酶切處理，并進(jìn)行純化處理；
3、終止子載體重組質(zhì)粒構(gòu)建
將上述兩步構(gòu)建好的片斷按照摩爾比為一比三的比例混合后利用T4連接酶在 16°C下進(jìn)行連接；利用大腸桿菌作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到重組質(zhì)粒一；
4、利用PCR方法擴(kuò)增惡臭假單胞菌中降解甲苯類(lèi)有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào) 控蛋白基因?qū)拿绹?guó)菌種保藏管理中心購(gòu)得的惡臭假單胞菌(編號(hào)為ATCC 33015) 接種于#1271Broth 苯甲酸鈉培養(yǎng)基25mL中，30°C振蕩培養(yǎng)M至48小時(shí)。當(dāng)細(xì)菌 生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期時(shí)，分別利用引物Pu-Not I ATTAGCGGCCGCCCCGGGAA AGCGCGATGAAC ； Pu-BamH I ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG ； XylR-Luc Xho I CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT XylR-Luc Sac I GTACGAGCTC TTTTCACACAACCTGGGGCG擴(kuò)增惡臭假單胞菌中降解甲苯類(lèi)有機(jī)物基 因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋白基因；
5、含有降解甲苯類(lèi)有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋白基因的重組質(zhì)粒的構(gòu) 建；利用相應(yīng)引物的酶分別酶切上步操作得到的片斷，回收純化；利用相應(yīng)的酶酶切重 組質(zhì)粒一中；連入啟動(dòng)子Pu的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒二；在質(zhì)粒二的基礎(chǔ)上連入調(diào)控蛋白基因 XylR命名為質(zhì)粒三；
6、得到檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的基本型微生物細(xì)胞傳感器
利用商業(yè)化宿主感受態(tài)細(xì)胞為宿主，將質(zhì)粒三轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞得到甲苯類(lèi)有機(jī)污 染物的微生物細(xì)胞傳感器；
7、檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的基本型微生物細(xì)胞傳感器的改進(jìn)技術(shù)
提取上述質(zhì)粒三，利用BamH I與Xho I酶切上述質(zhì)粒，舍棄Luc片段回收剩余 的大片斷作為載體片段；
8、含有T7噬菌體SD序列以及增強(qiáng)子的Luc基因片段獲得
利用引物 EHSDIUC ACTGGGATCCTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG GAAGACGCCAAAAACATAAAG 以及引物 Lucthreeterminator CGATCTCGAGCTATCA TTACAATTTGGACTTTCCGCCC以商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得含有T7噬菌體SD序列以及增強(qiáng)子的Luc基因片段。利用BamH I與Xho I酶切上述片段，并 回收純化；
9、增強(qiáng)型的檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器重組質(zhì)粒的構(gòu)建
將第七步與第八步獲得的片段按照摩爾比為一比三的比例混合，用W連接酶16 度連接；
10、獲得增強(qiáng)型的檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器
將上述連接液轉(zhuǎn)化至商業(yè)化宿主大腸桿菌DH5 α中，利用氨芐青霉素進(jìn)行篩 選；經(jīng)過(guò)驗(yàn)證程序，獲得增強(qiáng)型的檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器。
以下通過(guò)具體實(shí)事例詳細(xì)說(shuō)明發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā) 明的實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1 :第一步接種單菌落(載體細(xì)胞空白同時(shí)接種)于50ml三角瓶中； 氨芐青霉素終濃度為ΙΟΟμ g/ml ； 37°C過(guò)夜培養(yǎng)
第二步5ml的LB培養(yǎng)基加入設(shè)定濃度的誘導(dǎo)物(如二甲苯濃度500 μ m)；
第三步菌體培養(yǎng)至OD6OO = 1.2 ；
第四步稀釋到OD600 = 0.4，取5ml的稀釋好的培養(yǎng)液加入第二步準(zhǔn)備好的培 養(yǎng)液中；M度誘導(dǎo)；
第五步對(duì)于細(xì)菌，將40 μ 1未轉(zhuǎn)化細(xì)胞(載體細(xì)胞)與50 μ 1轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物混 合。(細(xì)胞濃度相同)加入10 μ 1 IM IC2HPO4 (ρΗ 7.8)，20mM EDTA (—個(gè)溶液)。用-70 度冰箱快速冷凍混合物(凍融)(IOmin)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至室溫并置于室溫水浴中(23°C 或置于室溫下平衡30分鐘)。加入300 μ 1新鮮配制的裂解混合物(見(jiàn)附錄)?；旌喜⒂?室溫孵育10分鐘；
第五步檢測(cè)；每個(gè)九十六空板中加入20 μ 1的裂解液后，加入100 μ 1熒光素 酶檢測(cè)液，立刻檢測(cè)；
第六步數(shù)據(jù)處理，得到數(shù)據(jù)與空白對(duì)照的差值，然后改差值乘以400得到即 為每毫升菌液對(duì)應(yīng)的數(shù)值了；對(duì)甲苯的最低檢測(cè)濃度為20微摩爾/升，最高濃度為1000微摩爾/升。
10毫升裂解混合物配方
5.5ml 水
2ml 5 X CCLR
加入25mg BSA
2.5ml 溶菌酶混合液(配 5ml 配方0.5ml IM K2HPO4 (PH 7.8)，20mM EDTA+4.5ml無(wú)菌水然后加入25mg溶菌酶)混合均勻。
權(quán)利要求
1.一種微生物傳感器改進(jìn)技術(shù)，由大腸桿菌作基本材料，通過(guò)基因工程手段構(gòu)建用 來(lái)改進(jìn)檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的細(xì)胞傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生生物傳感器改進(jìn)技術(shù)，其特征在于材料為商業(yè)化質(zhì) 粒 pEGMluc ；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生生物傳感器改進(jìn)技術(shù)，其特征在于基因來(lái)源為商業(yè) 化菌株惡臭假單胞菌；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生生物傳感器改進(jìn)技術(shù)，其特征在于增強(qiáng)子以及SD序 列來(lái)源為T(mén)7噬菌體基因組；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物細(xì)胞傳感器改進(jìn)技術(shù)，其制備方法a、擴(kuò)增載體片斷首先利用DELNot-Spe I引物以商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc為模板擴(kuò)增得到線性化片 斷，DEL Not I-Spe I 上游 gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATGCA CTAGTTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC ； DEL Not I-Spe I 下游GACTGAGCTC GGAAATTGTAAGCGTTAATAT ；分別用Not I與Spe I進(jìn)行酶切處理，并進(jìn)行純化處理；b、擴(kuò)增終止子片斷；利用下列引物 RRNB Spe I 5 ‘ ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3' RRNB NOT 1:5' ATTAGCGGCCGCGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3‘以大腸桿菌基因組為模版進(jìn)行擴(kuò)增得到RRNB終止子序列片斷，利用Not I與Spe I進(jìn)行酶切處 理，并進(jìn)行純化處理；C、終止子載體重組質(zhì)粒構(gòu)建將上述兩步構(gòu)建好的片斷按照摩爾比為一比三的比例混合后利用T4連接酶在16°C下 進(jìn)行連接；利用大腸桿菌作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到重組質(zhì)粒一；d、利用PCR方法擴(kuò)增惡臭假單胞菌中降解甲苯類(lèi)有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋 白基因?qū)拿绹?guó)菌種保藏管理中心購(gòu)得的惡臭假單胞菌(編號(hào)為ATCC 33015)接種 于#1271Broth:苯甲酸鈉培養(yǎng)基25mL中，30°C振蕩培養(yǎng)24至48小時(shí)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期時(shí)，分別利用引物Pu-Not I ATTAGCGGCCGCCCCGGGAAAGCGCGA TGAAC ； Pu-BamH I ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG ； XylR-Luc Xho I CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT ； XylR-Luc Sac I GTACGAGCTC TTTTCACACAACCTGGGGCG擴(kuò)增惡臭假單胞菌中降解甲苯類(lèi)有機(jī)物基因的調(diào)控序列以 及調(diào)控蛋白基因；e、含有降解甲苯類(lèi)有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋白基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建；利 用相應(yīng)引物的酶分別酶切上步操作得到的片斷，回收純化；利用相應(yīng)的酶酶切重組質(zhì)粒 一中；連入啟動(dòng)子Pu的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒二；在質(zhì)粒二的基礎(chǔ)上連入調(diào)控蛋白基因XylR 命名為質(zhì)粒三；f、得到檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器利用商業(yè)化宿主感受態(tài)細(xì)胞為宿主，將質(zhì)粒三轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞得到甲苯類(lèi)有機(jī)污染物 的微生物細(xì)胞傳感器g、檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的基本型微生物細(xì)胞傳感器的改進(jìn)技術(shù)提取上述質(zhì)粒三，利用BamH I與Xho I酶切上述質(zhì)粒，舍棄Luc片段回收剩余的大片斷作為載體片段；h、含有T7噬菌體SD序列以及增強(qiáng)子的Luc基因片段獲得利 用引物 EHSDIuc ACTGGGATCCTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGAA GACGCCAAAAACATAAAG 以及引物 Lucthreeterminator CGATCTCGAGCTATCATTAC AATTTGGACTTTCCGCCC以商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得含有T7噬菌體SD序列以及增強(qiáng)子的Luc基因片段。利用BamH I與Xho I酶切上述片段，并回收 純化；i、增強(qiáng)型的檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器重組質(zhì)粒的構(gòu)建將第七步與第八步獲得的片段按照摩爾比為一比三的比例混合，用T4連接酶16°C連接；j、獲得增強(qiáng)型的檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器 將上述連接液轉(zhuǎn)化至商業(yè)化宿主大腸桿菌DH5 α中，利用氨芐青霉素進(jìn)行篩選；經(jīng) 過(guò)驗(yàn)證程序，獲得增強(qiáng)型的檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器。k接種單菌落(載體細(xì)胞空白同時(shí)接種)于50ml三角瓶中；氨芐青霉素終濃度為 100ug/ml ； 37 °C 過(guò)夜培養(yǎng).1 5ml的LB培養(yǎng)基加入設(shè)定濃度的誘導(dǎo)物(如二甲苯濃度500 μ Μ)； m 菌體培養(yǎng)至OD600 = 1.2 ；η稀釋到OD600 = 0.4，取5ml的稀釋好的培養(yǎng)液加入第二步準(zhǔn)備好的培養(yǎng)液中； 23°C誘導(dǎo)；O 對(duì)于細(xì)菌，將40 μ 1未轉(zhuǎn)化細(xì)胞(載體細(xì)胞)與50 μ 1轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物混合。(細(xì) 胞濃度相同)加入10 μ 1 IM K2HPO4 (ρΗ 7.8)，20mM EDTA ( 一個(gè)溶液)。用_70°C冰箱 快速冷凍混合物(凍融)(IOmin)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至室溫并置于室溫水浴中(23°C或置于 室溫下平衡30分鐘)。加入300 μ 1新鮮配制的裂解混合物(見(jiàn)附錄)?；旌喜⒂谑覝胤?育10分鐘；P 檢測(cè)；每個(gè)九十六空板中加入20 μ 1的裂解液后，加入100 μ 1熒光素酶檢測(cè)液， 立刻檢測(cè)；q數(shù)據(jù)處理，得到數(shù)據(jù)與空白對(duì)照的差值，然后改差值乘以400得到即為每毫升菌 液對(duì)應(yīng)的數(shù)值了；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物細(xì)胞傳感器改進(jìn)技術(shù)的制備方法，其特征在于所 述LB養(yǎng)基為25mL，振蕩培養(yǎng)的溫度為37°C，酶切在37°C條件下進(jìn)行；
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物細(xì)胞傳感器改進(jìn)技術(shù)的制備方法，其特征在于從 美國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)得的惡臭假單胞菌(編號(hào)為ATCC33015)在含有苯 甲酸鈉的培養(yǎng)基中經(jīng)誘導(dǎo)，促進(jìn)其甲苯類(lèi)有機(jī)物降解基因表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物細(xì)胞傳感器改進(jìn)技術(shù)的制備方法，其特征在于微 生物傳感器培養(yǎng)溫度為37°C，微生物傳感器誘導(dǎo)溫度為23°C，檢測(cè)數(shù)據(jù)采集利用發(fā)光檢 測(cè)儀檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器改進(jìn)技術(shù)及其檢測(cè)方法涉及一種基于利用惡臭假單胞菌降解基因的調(diào)控序列及調(diào)控蛋白基因跟商業(yè)化報(bào)告基因質(zhì)粒序列而構(gòu)建檢測(cè)甲苯類(lèi)有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器進(jìn)行改進(jìn)創(chuàng)新的技術(shù)。細(xì)菌宿主為大腸桿菌，使用于甲苯類(lèi)有機(jī)物的檢測(cè)。對(duì)甲苯的最低檢測(cè)濃度為20微摩爾/升，最高濃度為1000微摩爾/升。信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于基本型號(hào)提高60倍。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102021220SQ20091009324
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者于清, 呼慶, 莊國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心