專利名稱：：一種檢測hla-b27基因的方法及其專用引物與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測HLA-B27基因的方法及其專用引物與試劑盒。
背景技術(shù)：
：HLA-B27是人類白細(xì)胞抗原(HLA)B座上的一組重要等位基因，HLA-B27作為MHCI類分子，位于人類第6號染色體的短臂上，其主要的生理功能是提呈內(nèi)源性抗原肽給CD8T細(xì)胞，通常被認(rèn)為參與T細(xì)胞的限制性識別。HLA-B27與強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)、Reiters綜合征、關(guān)節(jié)炎性銀屑病、葡萄膜炎等都有相關(guān)性。強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)是一種病因尚不明確的自身免疫型疾病，主要累及骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨軟組織及四肢關(guān)節(jié)，也可累及內(nèi)臟和其他組織，具有慢性、進(jìn)行性和炎性等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人體健康。目前AS的診斷主要按照1966年的紐約標(biāo)準(zhǔn)和1984年的紐約修訂標(biāo)準(zhǔn)，除要求存在X線^2級骶髂關(guān)節(jié)炎外，還要求存在腰椎活動受限、胸椎活動降低等損害?；颊咴缙谟捎谑芾坳P(guān)節(jié)尚未發(fā)生明顯改變，容易出現(xiàn)誤診和漏診。一般患者在發(fā)病后4-10年左右才能被診斷，但診斷時多已發(fā)生局限性骨侵蝕、硬化，即形態(tài)學(xué)變化，從治療角度講，此時已失去最佳的治療時機(jī)，因此早期診斷成為爭取良好預(yù)后的關(guān)鍵。多年來，人們一直在尋找AS早期診斷的標(biāo)志物，直到1973年Brewerton首次報道AS與HLA-B27抗原的表達(dá)相關(guān)后，大量AS與HLA-B27的相關(guān)性研究證實(shí)，HLA-B27與AS的發(fā)生密切相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)使早期診斷AS成為可能。目前，HLA-B27檢測己經(jīng)成為臨床診斷AS的常規(guī)手段，但是，用何種方法才能準(zhǔn)確檢測HLA-B27成為人們研究和關(guān)注的焦點(diǎn)。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展大大推動了方法學(xué)的進(jìn)步，從最初的補(bǔ)體依賴性微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)、ELISA檢測法，過渡到現(xiàn)在的流式細(xì)胞法以及PCR法。補(bǔ)體依賴性微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)是目前應(yīng)用最廣泛的檢測HLA-B27的方法。但其準(zhǔn)確性受諸多因素影響，如細(xì)胞純度、補(bǔ)體的活性和差異、抗體的純度和效價、HLA的高度多態(tài)性、細(xì)胞表面B27抗原分子的表達(dá)數(shù)目以及抗原交叉性、操作者的主觀性影響等，都容易造成假陽性或假陰性的結(jié)果。4臨床上較為常用的流式細(xì)胞技術(shù)是一種集生物技術(shù)、計算機(jī)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、單克隆抗體等于一體的檢測手段，以其快速、簡便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)迅速被臨床檢驗(yàn)所接受，但其儀器昂貴，對操作人員及待測樣本的質(zhì)量要求較高，這在很大程度上限制了該技術(shù)的推廣。因此，將簡單、快捷、高靈敏、高特異和低污染的熒光定量PCR方法，應(yīng)用于AS的早期診斷、鑒別診斷、個體化的有效治療和控制將具有極其重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測HLA-B27基因的引物。本發(fā)明所提供的檢測HLA-B27基因的引物，由用于擴(kuò)增保守基因的引物對和用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對組成。所述保守基因具體可為肌動蛋白基因、細(xì)胞色素C-l基因或D甘油醛-3-磷酸脫氫酶等基因。當(dāng)所述保守基因?yàn)榧拥鞍谆驎r，用于擴(kuò)增肌動蛋白基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。當(dāng)所述保守基因?yàn)镈甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因時，用于擴(kuò)增D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測HLA-B27基因的試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測HLA-B27基因的試劑盒，包括用于擴(kuò)增保守基因和HLA-B27基因的引物對。上述試劑盒中，所述保守基因具體可為肌動蛋白基因、細(xì)胞色素C-1基因或D甘油醛-3-磷酸脫氫酶等基因。當(dāng)所述保守基因?yàn)榧拥鞍谆驎r，用于擴(kuò)增肌動蛋白基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。當(dāng)所述保守基因?yàn)镈甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因時，用于擴(kuò)增D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所不。上述試劑盒中還包括雙鏈特異性熒光染料，所述雙鏈特異性熒光染料為SybrGreen、EvaGreen或SuperGreen等。具體應(yīng)用時，上述試劑盒中還包括PCR擴(kuò)增試劑，所述PCR擴(kuò)增試劑包括HotstarTaq、dNTP和MgCl2。本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測HLA-B27基因的方法。本發(fā)明所提供的檢測HLA-B27基因的方法，是將待測DNA樣品用上述試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線出現(xiàn)兩個峰，則待測DNA樣品中含有HLA-B27基因；若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線出現(xiàn)一個峰，則待測DNA樣品中不含有HLA-B27基因。為了降低人為視覺因素造成的誤差，還可以利用已知HLA-B27陽性樣本和/或陰性樣本，使用上述試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測；將已知HLA-B27陽性樣本和/或陰性樣本中保守基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與該HLA-B27陽性樣本和/或陰性樣本中HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)峰值相比，所得比值使用R0C方法進(jìn)行統(tǒng)計，得出該HLA-B27擴(kuò)增體系的參考值；通過對待測DNA樣品中保守基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與該待測DNA樣品中HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值相比，所得比值與參考值進(jìn)行比較，得出待測DNA樣品中是否含有HLA-B27基因的結(jié)論。具體的，當(dāng)所述保守基因?yàn)榧拥鞍谆驎r，本發(fā)明所提供的檢測HLA-B27基因的方法，是將待測DNA樣品用上述包括序列3和序列4的試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，若待測DNA樣品中肌動蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與該待測DNA樣品中HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值的比值小于參考值2.9，則待測DNA樣品中含有HLA-B27基因；若待測DNA樣品中肌動蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與該待測DNA樣品中HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值的比值大于參考值2.9，則待測DNA樣品中不含有HLA-B27基因。當(dāng)所述保守基因?yàn)镈甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因時，本發(fā)明所提供的檢測HLA-B27基因的方法，是將待測DNA樣品用上述包括序列5和序列6的試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，若待測DNA樣品中D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與該待測DNA樣品中HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值的比值小于參考值2.7，則待測DNA樣品中含有HLA-B27基因；若待測DNA樣品中D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與該待測DNA樣品中HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值的比值大于參考值2.7，則待測DNA樣品中不含有HLA-B27基因。本發(fā)明的試劑盒具有操作簡便、判定速度快、對儀器要求低和費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，在強(qiáng)直性脊柱炎的早期診斷和鑒別診斷方面將具有廣泛的應(yīng)用前景。圖1為使用肌動蛋白基因作為內(nèi)參基因檢測HLA-B27陰性和陽性樣本的熔解曲線峰圖圖2為使用D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為內(nèi)參基因檢測HLA-B27陰性和陽性樣本的熔解曲線峰圖具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1、人類HLA-B27基因與非HLA-B27基因的判別根據(jù)肌動蛋白(ACTB)編碼基因設(shè)計引物對甲，引物對甲由引物1和引物2組成，引物1的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，引物2的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。根據(jù)HLA-B27基因設(shè)計引物對乙，引物對乙由引物3和引物4組成，弓l物3的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，引物4的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。分別以200例HLA-B27陽性及200例HLA-B27陰性志愿者血液DNA為模板(血液樣本來源于臨床開展HLA-B27基因檢測的醫(yī)院的志愿者)，利用引物對甲和引物對乙用ABI7700實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體PCR反應(yīng)體系如表1所示-表1PCR反應(yīng)fl;系試劑名稱2(^1體系10xPCRbufferlxMgCl22mM20xSuperGreen染料<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR反應(yīng)條件為先96°C15min;然后96°C25sec、62°C30sec、72°C30sec，共40個循環(huán)，隨后進(jìn)行熔解曲線分析。PCR擴(kuò)增過程中會產(chǎn)生大量的DNA雙鏈分子，反應(yīng)體系中的熒光染料可以與產(chǎn)生的雙鏈DNA分子特異性結(jié)合而發(fā)出熒光，使用熒光染料激發(fā)所需波長的光源進(jìn)行實(shí)時檢測，收集在PCR產(chǎn)物合成期熒光染料發(fā)射的特定波長的熒光信號。以溫度和發(fā)射光的熒光信號作圖，可得到一條曲線，稱為熔解曲線。由于PCR產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物會在不同的特定溫度點(diǎn)解鏈。對熔解曲線進(jìn)行微分處理，繪制出熔解曲線峰圖，其峰值所對應(yīng)的溫度即為PCR產(chǎn)物的退火溫度(Tm)。熔解峰可以反映體系中擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的特異性。熒光信號采集點(diǎn)在72°C30sec，在PCR反應(yīng)結(jié)束后，逐漸升溫，進(jìn)行熔解曲線分析程序(96°C10sec、72°C10sec、96°C10sec，在升溫過程中，在每個溫度點(diǎn)檢測并記錄熒光信號)。HLA-B27陰性和陽性樣本的熔解曲線峰圖如圖1所示，其中，A為HLA-B27陽性樣本的熔解曲線峰圖，B為HLA-B27陰性樣本的熔解曲線峰圖。圖1中，縱坐標(biāo)-d(Fyd(t)表示熒光信號對溫度求負(fù)一階導(dǎo)數(shù)。從圖1中可以看出，以HLA-B27陽性樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，產(chǎn)生兩種PCR產(chǎn)物，其熔解曲線峰圖出現(xiàn)退火溫度不同的兩個熔解峰，分別為保守基因擴(kuò)增產(chǎn)物和HLA-B27基因擴(kuò)增產(chǎn)物；而以HLA-B27陰性樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，產(chǎn)生一種PCR產(chǎn)物，其熔解曲線峰圖只有一個熔解峰，為保守基因擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，根據(jù)保守基因(ACTB)和HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值進(jìn)行結(jié)果判斷。保守基因(ACTB)和HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值如表2所示，表2中數(shù)值為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。表2保守基因和HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果表明，HLA-B27陽性樣本的保守基因(ACTB)與HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值小于參考值2.9，判讀結(jié)果為陽性；而HLA-B27陰性樣本的保守基因與HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值大于參考值2.9，判讀結(jié)果為陰性。以上結(jié)果說明本發(fā)明檢測方法的結(jié)果是正確、可信的。實(shí)施例2、人類HLA-B27基因與非HLA-B27基因的判別根據(jù)D甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)編碼基因設(shè)計引物對丙，引物對丙由引物5和引物6組成，弓l物5的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所示，引物6的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列6所示。根據(jù)HLA-B27基因設(shè)計引物對乙，弓l物對乙由引物3和引物4組成，弓l物3的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，引物4的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。分別以200例HLA-B27陽性及200例HLA-B27陰性的DNA為模板(血液樣本來源于臨床開展HLA-B27基因檢測的醫(yī)院的志愿者)，利用引物對丙和引物對乙用ABI7700實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體PCR反應(yīng)體系如表3所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>引物31(xM引物41|iMdNTP0.2mMddH20加水至20|ilPCR反應(yīng)條件為先96°C15min;然后96°C25sec、62。C30sec、72。C30sec，共40個循環(huán)，隨后進(jìn)行熔解曲線分析。PCR擴(kuò)增過程中會產(chǎn)生大量的DNA雙鏈分子，反應(yīng)體系中的熒光染料可以與產(chǎn)生的雙鏈DNA分子特異性結(jié)合而發(fā)出熒光，使用熒光染料激發(fā)所需波長的光源進(jìn)行實(shí)時檢測，收集在PCR產(chǎn)物合成期熒光染料發(fā)射的特定波長的熒光信號。以溫度和發(fā)射光的熒光信號作圖，可得到一條曲線，稱為熔解曲線。由于PCR產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物會在不同的特定溫度點(diǎn)解鏈。對熔解曲線進(jìn)行微分處理，便可繪制出熔解曲線峰圖，其峰值所對應(yīng)的溫度即為PCR產(chǎn)物的退火溫度(Tm)。熔解峰可以反映體系中擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的特異性。熒光信號采集點(diǎn)在72°C30sec，在PCR反應(yīng)結(jié)束后，逐漸升溫，進(jìn)行熔解曲線分析程序(96°C10sec、72°C10sec、96°C10sec，在升溫過程中，在每個溫度點(diǎn)檢測并記錄熒光信號)。HLA-B27陰性和陽性樣本的熔解曲線峰圖如圖2所示，其中，A為HLA-B27陽性樣本的熔解曲線峰圖，B為HLA-B27陰性樣本的熔解曲線峰圖。圖2中，縱坐標(biāo)-d(Fyd(t)表示熒光信號對溫度求負(fù)一階導(dǎo)數(shù)。從圖2中可以看出，以HLA-B27陽性樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，產(chǎn)生兩種PCR產(chǎn)物，其熔解曲線峰圖出現(xiàn)退火溫度不同的兩個熔解峰，分別為保守基因擴(kuò)增產(chǎn)物和HLA-B27基因擴(kuò)增產(chǎn)物；而以HLA-B27陰性樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，產(chǎn)生一種PCR產(chǎn)物，其熔解曲線峰圖只有一個熔解峰，為保守基因擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，根據(jù)保守基因(GAPDH)和HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值進(jìn)行結(jié)果判斷。保守基因(GAPDH)和HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值如表4所示，表4中數(shù)值為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。表4保守基因GAPDH和HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值比值(保守基因/HLA-B27基因)0.6819193.43熔解溫度(保守基因/HLA-B27基因)76.6°C/86.41°C76.9°C/87.30°C判讀結(jié)果陽性(小于參考值2.7)陰性(大于參考值2.7)10結(jié)果表明，HLA-B27陽性樣本的保守基因(GAPDH)與HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值小于參考值2.7，判讀結(jié)果為陽性；而HLA-B27陰性樣本的保守基因與HLA-B27基因的熔解峰熒光信號峰值的比值大于參考值2.7，判讀結(jié)果為陰性。以上結(jié)果說明本發(fā)明檢測方法的結(jié)果是正確、可信的。序列表〈110〉博奧生物有限公司清華大學(xué)<120〉一種檢測HLA-B27基因的方法及其專用引物與試劑盒〈130〉CGGNARZ92556<160〉6〈210〉1<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220〉〈223〉〈400〉1cgttgacatccgtaaagacc20<210>2<211〉19<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223><400>2agccagggcagtaatctcc19〈210〉3〈211〉20〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<223><400〉3catgtggtatttccacacct20〈210〉4<211〉20〈212〉腿〈213〉人工序列<220〉<223〉<400〉4acaaccagagcgaggccggt20<210〉5<211>22<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉<400>5ctccctctttctttgcagcaat22〈210〉6〈211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉<400〉6cagctctcataccatgagtcct2權(quán)利要求1、一種檢測HLA-B27基因的引物，由用于擴(kuò)增保守基因的引物對和用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對組成。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的引物，其特征在于所述保守基因?yàn)榧拥鞍谆?、?xì)胞色素C-l基因或D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物，其特征在于所述保守基因?yàn)榧拥鞍谆?，用于擴(kuò)增肌動蛋白基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物，其特征在于所述保守基因?yàn)镈甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因，用于擴(kuò)增D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。5、一種檢測HLA-B27基因的試劑盒，包括用于擴(kuò)增保守基因和HLA-B27基因的引物對。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述保守基因?yàn)榧拥鞍谆?、?xì)胞色素C-l基因或D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因。7、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述保守基因?yàn)榧拥鞍谆?，用于擴(kuò)增肌動蛋白基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。8、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述保守基因?yàn)镈甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因，用于擴(kuò)增D甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，用于擴(kuò)增HLA-B27基因的引物對的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。9、根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括雙鏈特異性熒光染料，所述雙鏈特異性熒光染料為SybrGreen、EvaGreen或SupcrGrecru10、根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括PCR擴(kuò)增試劑，所述PCR擴(kuò)增試劑包括HotstarTaq和MgCl2。11、一種檢測HLA-B27基因的方法，包括將待測DNA樣品用權(quán)利要求5-10中任一所述試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線出現(xiàn)兩個峰，則待測樣品中含有HLA-B27基因；若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線出現(xiàn)一個峰，則待測樣品中不含有HLA-B27基因。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述方法還包括將已知HLA-B27陽性樣本和/或陰性樣本用權(quán)利要求5-10中任一所述的試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，將已知HLA-B27陽性樣本和/或陰性樣本中保守基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與已知HLA-B27陽性樣本和/或陰性樣本中HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)峰值相比，所得比值經(jīng)統(tǒng)計計算得到參考值；將待測DNA樣品用權(quán)利要求5-10中任一所述的試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，將待測DNA樣品中保守基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與待測DNA樣品中HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值相比，所得比值與參考值進(jìn)行比較。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測HLA-B27基因的方法及其專用引物與試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測HLA-B27基因的方法，是將待測樣品用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，若熔解曲線出現(xiàn)兩個峰，則待測樣品中含有HLA-B27基因；若熔解曲線出現(xiàn)一個峰，則待測樣品中不含有HLA-B27基因。為了降低人為視覺因素造成的誤差，還可以利用已知HLA-B27陰性和/或陽性樣本計算出參考值；將待測DNA樣品中保守基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值與HLA-B27基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線對應(yīng)的峰值相比，所得比值與參考值進(jìn)行比較。本發(fā)明的試劑盒具有操作簡便、判定速度快、對儀器要求低和費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，在強(qiáng)直性脊柱炎的早期診斷和鑒別診斷方面將具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號C12Q1/68GK101665833SQ20091009392公開日2010年3月10日申請日期2009年9月23日優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日發(fā)明者偉侯,高華方,魯紅麗申請人:博奧生物有限公司;清華大學(xué)