專利名稱：固體發(fā)酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用廉價固體原料通過固體發(fā)酵生產固體纖維 素酶、木聚糖酶、纖維二糖酶復合酶的方法。
背景技術：
纖維質原料中纖維素、半纖維素、木質素分別占30-40% 、 15-30 %、 10-20%。纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產物，是地球上
最為豐富的可再生性天然資源。據(jù)估計，地球上纖維素中所蘊藏的能 量大約相當于6400億咱的石油所含的能量，而且纖維素的可再生性 是石油等礦質能源所不可比擬的。充分利用纖維素酶處理纖維素，有 可能從根本上解決人類所面臨的能源與糧食問題，其深遠影響是不可 低估的。然而，目前約80%纖維素未被開發(fā)利用，具有極為誘人的 前景。
木聚糖在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素，是半纖維素中含量 最豐富的一種。木聚糖是由D-木糖主鏈(以P-1，4鍵相連)和L-阿拉伯 糖分枝(a-l,2和a-l，3相連)所組成的聚合物。半纖維素木聚糖在木質 組織中占總量的50%,它結合在纖維素微纖維的表面，并且相互連接， 這些纖維構成了堅硬的細胞相互連接的網(wǎng)絡。這種堅硬的網(wǎng)絡阻礙了 纖維素酶對纖維素吸附，從而影響了纖維素的降解速率。
在天然纖維素水解成葡萄糖的過程中，必須依靠3種組分的協(xié)同 作用才能完成。纖維素大分子首先在C1酶和C x酶的作用下逐步降 解成纖維二糖，而纖維二糖酶則進一步將纖維二糖水解成2個葡萄 糖。由于高濃度的纖維二糖對C1酶和Cx酶活力有強烈的抑制作用， 而在低濃度時則是纖維素酶的誘導物，如果纖維素酶復合組分中缺乏纖維二糖酶組分就會嚴重影響纖維素的降解速率。
由于所使用的黑曲霉是高產木聚糖酶和纖維二糖酶的菌株，而綠 色木霉生產木聚糖酶和纖維二糖酶的能力較弱。故在發(fā)酵過程中，通 過木聚糖酶對木聚糖的水解可以降低其和纖維素的連接，從而增加了 纖維素酶對纖維素吸附。而纖維二糖酶則水解產生的纖維二糖，使纖
維二糖的含量在發(fā)酵過程中處于低濃度水平，從而誘導纖維素酶降解 纖維素。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對纖維質原料發(fā)酵時利用率低、酶組成單一的 不足，提供一種操作簡便，成本低，酶活力高，酶組分配比合理的固 體發(fā)酵生產纖維素酶、木聚糖酶、纖維二糖酶的固體復合酶的方法。
一種固體發(fā)酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的方法，采 用綠色木霉、黑曲霉為生產菌種，分別培養(yǎng)得到綠色木霉液體種子和 黑曲霉麩曲種子，然后將綠色木霉液體種子接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)
3-8天后，再將黑曲霉麩曲種子的孢子洗下后接入正在培養(yǎng)的固體發(fā) 酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8-12天，得同時含有纖維素酶、木聚糖酶和纖維 二糖酶的固體復合酶。
本發(fā)明所用綠色木霉(Trichodermaviride)，優(yōu)選保藏號為ACCC 30206的綠色木霉，可從中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心獲得；也 可以使用其它產纖維素酶的綠色木霉或里氏木霉；黑曲霉(Aspergillus niger)優(yōu)選保藏號為CGMCC 3.3147的黑曲霉，也可以使用其它產 木聚糖酶和纖維二糖酶的黑曲霉。以綠色木霉菌株在玉米芯等農林廢 棄物上進行培養(yǎng)， 一段時間后接入黑曲霉進行混菌培養(yǎng)。
本發(fā)明的方法，其中用于培養(yǎng)所述綠色木霉液體種子的種子培養(yǎng) 基按重量計為葡萄糖1-3%、玉米漿1-3%、尿素1-3%、硫酸銨0.5-2%、 磷酸二氫鉀0.2-2%,硫酸鎂0.2-1%,其余為水；用于培養(yǎng)所述黑曲 霉麩曲種子的麩曲瓶培養(yǎng)基按重量計為麩皮35-45%、玉米芯50-65%、尿素1-3%、硝酸銨1-3%、磷酸二氫鉀0.5-2%。
本發(fā)明的方法，其中所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基含麩皮、玉米芯、尿素、 硝酸銨或硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈷。優(yōu)選配方為重量 百分比的玉米芯60-70%;麩皮25-40%;硫酸銨1-8%;尿素1-5%; 磷酸二氫鉀1-5%;碳酸鉤1-5%;硫酸鎂0,1-0.5%;氯化鈷0.01-0.1%; 初始pH5.0-7.0。
本發(fā)明的方法，其中將綠色木霉先接入種子培養(yǎng)基中，在20-30 'C下條件培養(yǎng)48小時，再接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基；將黑曲霉先接入麩 曲瓶中，在20-3(TC下條件培養(yǎng)4-8天，待綠色木霉接種培養(yǎng)3-8天 時再以營養(yǎng)鹽水洗下孢子接入正在培養(yǎng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)8-12天。
本發(fā)明的方法，其中用于洗黑曲霉孢子的營養(yǎng)鹽水為重量百分 比的硫酸銨5~15%;尿素1~10%;磷酸二氫鉀1~10%;硝酸鈉1~10%; 硫酸鎂0.1~5%;其余為水。
本發(fā)明充分利用了廉價固體原料如麩皮、玉米芯作為菌種的碳 源來源，變廢為寶，降低生產成本，同時采用綠色木霉、黑曲霉混菌 固態(tài)發(fā)酵，兩種菌的發(fā)酵產物之間互相制約，并有協(xié)同作用，使得本 方法對纖維質原料發(fā)酵時利用率高、所得酶系豐富，各酶之間相互協(xié) 同作用，促進酶活增加。該方法生產的固體復合酶活力高、組分配比 合理、生產周期短、成本低、質量穩(wěn)定。
具體實施例方式
以下實施例用于進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、 步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。下面實施例 中所使用的方法如無特殊說明均為常規(guī)實驗方法。 實施例l
選擇長勢良好的生產用黑曲霉菌種CGMCC3.3147斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有麩皮35%、玉米芯50%、尿素1%、硝酸銨1%、 磷酸二氬鉀0.5%的麩曲瓶培養(yǎng)基中，塞上棉塞并包扎好牛皮紙，用力 搖勻麩曲瓶使孢子在培養(yǎng)基中分散均勻，將麩曲瓶搬到培養(yǎng)間中，置 30。C下培養(yǎng)。待7天后孢子長滿整個培養(yǎng)基時移入冷藏室備用。選擇 長勢良好的生產用綠色木霉菌種ACCC 30206斜面，輕輕挑取斜面孢 子接入含葡萄糖1%、玉米漿1%、尿素1%、硫酸銨0.5%、磷酸二氫鉀 0.2%，硫酸鎂0.2%的液體種子瓶中，扎好8層紗布，30'C下190轉經(jīng) 48h搖床培養(yǎng)。將培養(yǎng)結東后的綠色木霉液體種子按100%接種量接入 12rC高壓滅菌60分鐘的淺盤固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基為玉米芯 60%;麩皮25%;硫酸銨1%;尿素1%;磷酸二氫鉀1%;碳酸錦1%; 硫酸鎂0.1%;氯化鈷0.01%，攪拌均勻，4天后用營養(yǎng)鹽硫酸銨5%; 尿素1%;磷酸二氫鉀1%;硝酸鈉1%;硫酸鎂0.1%，其余為水，洗下 黑曲霉孢子，均勻接入正在培養(yǎng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中。3(TC培養(yǎng)10 天。得到纖維素酶活為230IU/g，木聚糖酶酶活為8000IU/g,纖維二 糖酶酶活為800IU/g。 實施例2
選擇長勢良好的生產用黑曲霉菌種CGMCC 3.3147斜面，輕輕挑 取斜面孢子接入含有麩皮40%、玉米芯55%、尿素1.1%、硝酸銨1.1%、 磷酸二氫鉀0.6%的麩曲瓶培養(yǎng)基中，塞上棉塞并包扎好牛皮紙，用力 搖勻麩曲瓶使孢子在培養(yǎng)基中分散均勻，將麩曲瓶搬到培養(yǎng)間中，置 3(TC下培養(yǎng)。待7天后孢子長滿整個培養(yǎng)基時移入冷藏室備用。選擇 長勢良好的生產用綠色木霉菌種ACCC 30206斜面，輕輕挑取斜面孢 子接入含甜萄糖2%、玉米漿2%、尿素2%、硫酸銨0.6%、磷酸二氫鉀 0.3%，硫酸鎂0.3%的液體種子瓶中，扎好8層紗布，3(TC下190轉經(jīng) 48h搖床培養(yǎng)。將培養(yǎng)結束后的綠色木霉液體種子按100%接種量接入 12rC高壓滅菌60分鐘的淺盤固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基為玉米芯 62%;麩皮32%;硫酸銨3%;尿素3%;磷酸二氫鉀3%;碳酸鉤3%;
6硫酸鎂0.3%;氯化鈷0.02%,攪拌均勾，4天后用營養(yǎng)鹽硫酸銨10%; 尿素3%;磷酸二氫鉀3%;硝酸鈉3%;硫酸鎂1%，其余為水，洗下 黑曲霉孢子，均勻接入正在培養(yǎng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中。3(TC培養(yǎng)10 天。得到纖維素酶活為240IU/g，木聚糖酶酶活為8500IU/g,纖維二 糖酶酶活為850IU/g。 實施例3
選擇長勢良好的生產用黑曲霉菌種CGMCC3.3147斜面，輕輕挑 取斜面孢子接入含有麩皮45%、玉米芯65%、尿素1.1%、硝酸銨1.1%、 磷酸二氫鉀0.6%的麩曲瓶培養(yǎng)基中，塞上棉塞并包扎好牛皮紙，用力 搖勻麩曲瓶使孢子在培養(yǎng)基中分散均勻，將麩曲瓶搬到培養(yǎng)間中，置 3(TC下培養(yǎng)。待7天后孢子長滿整個培養(yǎng)基時移入冷藏室備用。選擇 長勢良好的生產用綠色木霉菌種ACCC 30206斜面，輕輕挑取斜面孢 子接入含葡萄糖2%、玉米漿2%、尿素2%、硫酸銨0.6%、磷酸二氫鉀 0.3%,硫酸鎂0.3。/。的液體種子瓶中，扎好8層紗布，31'C下190轉經(jīng) 48h搖床培養(yǎng)。將培養(yǎng)結束后的綠色木霉液體種子按100%接種量接入 12rC高壓滅菌60分鐘的淺盤固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基為玉米芯 65%;麩皮30%;硫酸銨5%;尿素5%;磷酸二氫鉀5%;碳酸鈣5%; 硫酸鎂0.5%;氯化鈷0.08%,攪拌均勻，4天后用營養(yǎng)鹽硫酸銨15%; 尿素9%;磷酸二氫鉀9%;硝酸鈉9%;硫酸鎂4%,其余為水，洗下 黑曲霉孢子，均勾接入正在培養(yǎng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中。30。C培養(yǎng)10 天。得到纖維素酶活為250IU/g，木聚糖酶酶活為9000IU/g，纖維二 糖酶酶活為900IU/g。
權利要求
1、一種固體發(fā)酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的方法，其特征在于采用綠色木霉、黑曲霉為生產菌種，分別培養(yǎng)得到綠色木霉液體種子和黑曲霉麩曲種子，然后將綠色木霉液體種子接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)3-8天后，再將黑曲霉麩曲種子的孢子洗下后接入正在培養(yǎng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8-12天，得同時含有纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的固體復合酶。
2、 如權利要求l所述的方法，其特征在于用于培養(yǎng)所述綠色木 霉液體種子的種子培養(yǎng)基按重量計為葡萄糖1-3%、玉米漿1-3%、尿 素1-3%、硫酸銨0.5-2%、磷酸二氫鉀0.2-2%,硫酸鎂0.2-1%,其余 為水；用于培養(yǎng)所述黑曲霉麩曲種子的麩曲瓶培養(yǎng)基按重量計為麩皮 35-45%、玉米芯50-65%、尿素1-3%、硝酸銨1-3%、磷酸二氫鉀0.5-2%。
3、 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述固體發(fā)酵培 養(yǎng)基含麩皮、玉米芯、尿素、硝酸銨或硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、 氯化鈷。
4、 如權利要求3所述的方法，其特征在于所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基 為重量百分比的玉米芯60-70%;麩皮25-40%;硫酸銨1-8%;尿素 1-5%;磷酸二氫鉀1-5%;碳酸鈣1-5%;硫酸鎂0.1-0.5%;氯化鈷 0.01-0.1%;初始pH5.0-7.0。
5、 如權利要求1所述的方法，其特征在于將綠色木霉先接入種 子培養(yǎng)基中，在20-3(TC下條件培養(yǎng)48小時，再接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基； 將黑曲霉先接入麩曲瓶中，在20-30'C下條件培養(yǎng)4-8天，待綠色木 霉接種培養(yǎng)3-8天時再以營養(yǎng)鹽水洗下孢子接入正在培養(yǎng)的固體發(fā)酵 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8-12天。
6、 如權利要求5所述的方法，其特征在于用于洗黑曲霉孢子的 營養(yǎng)鹽水為重量百分比的硫酸銨5~15%;尿素1~10%;磷酸二氫鉀 1~10%;硝酸鈉1~10%;硫酸鎂0.1~5%;其余為水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固體發(fā)酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的方法，采用綠色木霉、黑曲霉為生產菌種，分別培養(yǎng)得到綠色木霉液體種子和黑曲霉麩曲種子，然后將綠色木霉液體種子接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)3-8天后，再將黑曲霉、麩曲種子的孢子洗下后接入正在培養(yǎng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8-12天，得同時含有纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的固體復合酶。該方法生產的固體復合酶活力高、組分配比合理、生產周期短、成本低、質量穩(wěn)定。
文檔編號C12N9/42GK101671661SQ20091009393
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權日2009年9月23日
發(fā)明者尚海濤, 李維理, 李榮杰, 穆曉玲, 薛培儉 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司