專利名稱：一種發(fā)酵生產輔酶q10的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領域，涉及一種發(fā)酵生產輔酶Q10(CoQ10)的方法。
背景技術：
CoQ10，又稱泛醌，是生物體內廣泛存在的脂溶性醌類化合物，作為細胞代謝和細 胞呼吸激活劑，還是重要的抗氧化劑和非特異性免疫增強劑，具有抗心肌缺血、抗心衰、抗 心律失常作用。能激活人體細胞和細胞能量的營養(yǎng)，具有提高人體免疫力、增強抗氧化、延 緩衰老和增強人體活力，是人類健康不可缺少的重要因子之一。 目前，CoQlO的主要生產方法有動植物提取法、植物細胞培養(yǎng)法、化學合成法和 微生物發(fā)酵法。 動植物組織提取法有原料價格高、來源有限、CoQlO含量低等缺點，故不利于工業(yè) 化生產。 植物細胞培養(yǎng)法生產周期長，培養(yǎng)條件苛刻，產率低，技術尚不成熟。 而目前工業(yè)上廣泛使用的化學合成法具有反應步驟多、最終轉化率低、副產品多、
分離過程復雜、手性物質分離困難以致產品活性低等缺點。在人體內只有全反式的CoQlO
才有效，但目前文獻報道的合成方法中，CoQ10多為順反異構體的混合物(全反式一般在
80%左右)，且異構體分離極為困難。 而微生物發(fā)酵法生產CoQlO則具有不受原料限制，分離過程相對簡單，不存在手 性問題等優(yōu)點，成為最有發(fā)展?jié)摿Φ腃oQlO生產方法。 目前，已經有許多菌種用于發(fā)酵法生產CoQ10，但都由于生產成本高等原因未能大 規(guī)模生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵法生產輔酶Q10的方法。 本發(fā)明的研究人員通過大量地研究發(fā)現(xiàn)，通過采用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)實現(xiàn)高密度發(fā)酵，從而能夠以較低的成本規(guī)?；aCoQlO，并能夠大幅度 提高發(fā)酵CoQ10的發(fā)酵水平。 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種發(fā)酵生產輔酶Q10的方法，其包括以下步驟
1)先將根癌土壤桿菌以5 15%的接種量，進行高密度好氧發(fā)酵60 84小時，發(fā) 酵培養(yǎng)基組分為葡萄糖12 20%，硫酸銨0. 5 1. 5%，磷酸二氫鉀0. 1 0. 5%，硫酸鎂 0. 01 0. 05%，玉米槳0. 5 2. 5%，磷酸氫二銨0. 2 l%，pH6 7. 5，發(fā)酵溫度為28 31°C ; 2)然后將獲得的發(fā)酵液進行分離，得分離菌體； 3)最后將所述分離菌體重懸后，經回流、萃取，得CoQ10。 其中，所述根癌土壤桿菌菌株可采用現(xiàn)有根癌土壤桿菌進行發(fā)酵，優(yōu)選的采用 ATCC4452、ATCC2182或ATCC2337。
步驟1)中發(fā)酵的通風比為1 : 0. 3 1 : 0. 8，攪拌轉速為300 600轉/min。 根癌土壤桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)前，進行種子培養(yǎng)時，所用的種子培養(yǎng)基葡萄糖1
3%，蛋白胨0. 5 1. 5%，酵母膏0. 5 1. 5%，氯化鈉0. 2 1. 0%， pH6 7. 5。 步驟2)中所述分離采用4000 5000轉/min，離心10 20分鐘。 步驟3)中所述重懸所采用的重懸溶液為8 10% (g/100ml)NaOH甲醇溶液。 回流溫度為85 95°C ，回流時間30 60分鐘。 所述萃取采用石油醚進行萃取。 本發(fā)明采用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens，)進行高密度發(fā)酵生產 CoQ10，其含量可達800mg/1 2000mg/l。其工藝簡單，發(fā)酵液菌體濃度高，生產成本低，適 用于大規(guī)模生產。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 將根癌土壤桿菌ATCC2182進行搖瓶培養(yǎng)，以10 %的接種量再接種到具有以下 組成的種子培養(yǎng)基中葡萄糖1 %，蛋白胨1. 5%，酵母膏0. 5%，氯化鈉0. 2%， pH6. 5， 50ml/500ml的三角瓶，250轉/min，溫度30°C ，培養(yǎng)18h。 以10%的接種量將根癌土壤桿菌ATCC2182接種到具有以下組成的發(fā)酵培養(yǎng)基 中葡萄糖20 % ，硫酸銨1.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.05%，玉米漿2.5%，磷酸氫二 銨l^，pH6. 5±0.2。然后在以下控制條件下進行發(fā)酵溫度3(TC，通風比1 : 0.5，攪拌轉 速為500轉/min， pH控制在6. 5，發(fā)酵72小時。 取發(fā)酵液5000轉/min，離心15分鐘收集菌體，把收集到的上述菌體用10% NaOH 甲醇溶液重懸，轉移至盛有5X焦性沒食子酸的圓底燒瓶中，9(TC回流40分鐘，取下立即冷 卻，用石油醚萃取，萃取液用液相測CoQlO含量達2000mg/l。
實施例2 將根癌土壤桿菌ATCC2337進行搖瓶培養(yǎng)，再接種到具有以下組成的種子培養(yǎng)基 中葡萄糖3%，蛋白胨0. 5%，酵母膏1. 5%，氯化鈉1.0%，pH7. 5，培養(yǎng)條件50ml/500ml的 三角瓶，250轉/min，溫度30°C ，培養(yǎng)20h。 以10X的接種量將根癌土壤桿菌ATCC2337接種到具有以下組成的培養(yǎng)基中 葡萄糖18 % ，硫酸銨1.2%，磷酸二氫鉀0. 4 % ，硫酸鎂0. 04 % ，玉米漿2 % ，磷酸氫二銨 0.8%，pH6.6±0.2。然后在以下控制條件下進行發(fā)酵溫度3(TC，通風比1 : 0.4，攪拌轉 速為600轉/min， pH控制在6. 5，發(fā)酵60小時。 取發(fā)酵液5000轉/min，離心15分鐘收集菌體，把收集到的上述菌體用10% NaOH 甲醇溶液重懸，轉移至盛有焦性沒食子酸的圓底燒瓶中，90°C回流40分鐘，取下立即冷卻， 用石油醚萃取，萃取液用液相測CoQlO含量達1700mg/l。
實施例3 將根癌土壤桿菌ATCC4452進行搖瓶培養(yǎng)，再接種到具有以下組成的種子培養(yǎng)基 中葡萄糖2 % ，蛋白胨1. 0 % ，酵母膏1.5%，氯化鈉0.8%， pH7. 0，培養(yǎng)條件50ml/500ml的 三角瓶，250轉/min，溫度28 °C ，培養(yǎng)16h。
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以15%的接種量將根癌土壤桿菌ATCC4452接種到具有以下組成的培養(yǎng)基中葡 萄糖15 % ，硫酸銨0. 8 % ，磷酸二氫鉀0. 3 % ，硫酸鎂0. 03 % ，玉米漿1.5%，磷酸氫二銨 0.5%，pH6.6±0.2。然后在以下控制條件下進行發(fā)酵溫度3(TC，通風比1 : 0.3，攪拌轉 速為300轉/min， pH控制在7. 5，發(fā)酵80小時。 取發(fā)酵液5000轉/min，離心10分鐘收集菌體，把收集到的上述菌體用8% NaOH 甲醇溶液重懸，轉移至盛有焦性沒食子酸的圓底燒瓶中，95°C回流30分鐘，取下立即冷卻， 用石油醚萃取，萃取液用液相測CoQlO含量達1500mg/l。
實施例4 將根癌土壤桿菌ATCC2337進行搖瓶培養(yǎng)，再接種到具有以下組成的種子培養(yǎng)基 中葡萄糖3 % ，蛋白胨0. 5 % ，酵母膏1.0%，氯化鈉1.0%， p朋.0，培養(yǎng)條件50ml/500ml的 三角瓶，200轉/min，溫度30。C，培養(yǎng)18h。 以5X的接種量將根癌土壤桿菌ATCC2337接種到具有以下組成的培養(yǎng)基中葡萄 糖12 % ，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.01%，玉米漿1 % ，磷酸氫二銨0.2%， p朋.6士0.2。然后在以下控制條件下進行發(fā)酵溫度3(TC，通風比l : 0.8，攪拌轉速為600 轉/min， pH控制在6. 0，發(fā)酵84小時。 取發(fā)酵液4000轉/min，離心20分鐘收集菌體，把收集到的上述菌體用10 %的 NaOH甲醇溶液重懸，轉移至盛有焦性沒食子酸的圓底燒瓶中，85°C回流60分鐘，取下立即 冷卻，用石油醚萃取，萃取液用液相測CoQlO含量達1200mg/l。 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
一種發(fā)酵生產輔酶Q10的方法，其特征在于，其包括以下步驟1)先將根癌土壤桿菌以5～15％的接種量，進行高密度好氧發(fā)酵60～84小時，發(fā)酵培養(yǎng)基組分為葡萄糖12～20％，硫酸銨0.5～1.5％，磷酸二氫鉀0.1～0.5％，硫酸鎂0.01～0.05％，玉米漿0.5～2.5％，磷酸氫二銨0.2～1％，pH6-7.5，發(fā)酵溫度為28～31℃；2)然后將獲得的發(fā)酵液進行分離，得分離菌體；3)最后將所述分離菌體重懸后，經回流、萃取，得輔酶Q10。
2. 根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟l)中發(fā)酵的通風比為l : 0.3 1 : 0. 8，攪拌轉速為300 600轉/min。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，根癌土壤桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)前，進行種 子培養(yǎng)時，所用的種子培養(yǎng)基葡萄糖1 3%，蛋白胨0. 5 1. 5%，酵母膏0. 5 1. 5%， 氯化鈉0. 2 1. 0%， pH6 7. 5。
4. 根據(jù)權利要求1 3任意一項所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述分離采用 4000 5000轉/min，離心10 20分鐘。
5. 根據(jù)權利要求1 4任意一項所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述重懸時，所采 用的重懸溶液為8 10% NaOH甲醇溶液。
6. 根據(jù)權利要求1 5任意一項所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述回流溫度為 85 95°C，回流時間30 60分鐘。
7. 根據(jù)權利要求1 6任意一項所述的方法，其特征在于，所述萃取采用石油醚進行萃取。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產輔酶Q10的方法，其包括以下步驟先將根癌土壤桿菌以5～15％的接種量，進行高密度好氧發(fā)酵60～84小時，發(fā)酵培養(yǎng)基組分為葡萄糖12～20％，硫酸銨0.5～1.5％，磷酸二氫鉀0.1～0.5％，硫酸鎂0.01～0.05％，玉米漿0.5～2.5％，磷酸氫二銨0.2～1％，pH6～7.5，發(fā)酵溫度為28～31℃；然后將獲得的發(fā)酵液進行分離，得分離菌體；最后將所述分離菌體重懸后，經回流、萃取，得輔酶Q10。其工藝簡單，發(fā)酵液菌體濃度低，生產成本低，適用于大規(guī)模生產。
文檔編號C12P7/66GK101705258SQ20091009396
公開日2010年5月12日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權日2009年9月30日
發(fā)明者尚海濤, 李榮杰, 薛培儉, 鄭輝 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司