專(zhuān)利名稱(chēng)：：16SrRNA基因?yàn)榘谢虻腡aqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種以動(dòng)物源性嗜衣原體的16SrRNA為靶基因的TaqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立方法。
背景技術(shù)：
：衣原體是專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生病原體，不同于其它革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，表現(xiàn)在其獨(dú)特的雙向生存周期，即一個(gè)細(xì)胞外的生存形式——原生小體和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的形式——網(wǎng)狀體，二者之間可相互轉(zhuǎn)化。1999年，衣原體科被分成2個(gè)屬9個(gè)種。其中，衣原體屬有3個(gè)種，包括沙眼衣原體、豬衣原體和鼠肺炎沙眼衣原體；嗜衣原體屬有6個(gè)種，即豬流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體、貓嗜衣原體、獸類(lèi)嗜衣原體、肺炎嗜衣原體和鸚鵡熱嗜衣原體。這些微生物是許多人畜共患病的病原體，如沙眼衣原體可導(dǎo)致性傳播疾病和沙眼；肺炎衣原體會(huì)導(dǎo)致人體引起諸如肺炎、支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病，也被認(rèn)為是哮喘和動(dòng)脈粥樣硬化等慢性疾病的病因之一；豬流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體、貓嗜衣原體、獸類(lèi)嗜衣原體和鸚鵡熱嗜衣原體廣泛分布于各種動(dòng)物中，可寄生于哺乳類(lèi)動(dòng)物宿主引起流產(chǎn)、腸炎、肺炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及生殖道、消化道疾??；鸚鵡熱嗜衣原體可感染禽鳥(niǎo)類(lèi)與哺乳動(dòng)物引起非典型性肺炎和流產(chǎn)，它也可通過(guò)隱性感染或患病動(dòng)物傳播給人體，引發(fā)嚴(yán)重的非典型肺炎。眾所周知，血清學(xué)試驗(yàn)、微量免疫熒光法(MIF)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是檢測(cè)衣原體感染的常規(guī)診斷方法。由于這些方法存在交叉反應(yīng)從而使其缺乏特異性，而聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)已成為檢測(cè)動(dòng)物衣原體感染的一種確實(shí)有效的方法。該方法具有易使用，能快速獲得結(jié)果，同時(shí)適合于處理大量的檢體樣本等諸優(yōu)點(diǎn)，但是它無(wú)法避免后PCR的交叉污染。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種理想的替代方法，由于它無(wú)需進(jìn)行后PCR處理從而不易引起交叉污染，而且雜交探針也可提高檢測(cè)的特異性，因此它已被證實(shí)是一種更確實(shí)有效的微生物檢測(cè)方法。編碼16SrRNA小亞基的基因經(jīng)常被當(dāng)作PCR檢測(cè)的靶基因位點(diǎn)，因?yàn)樗写罅康臄?shù)據(jù)庫(kù)，在臨床檢測(cè)診斷中具有探索和利用價(jià)值。由于動(dòng)物源性嗜衣原體可引起動(dòng)物和人類(lèi)的多種疾病，動(dòng)物以流產(chǎn)、肺炎、腸炎、結(jié)膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及腦脊髓炎等多種病癥為主，而人類(lèi)以發(fā)熱、頭痛和非典型性肺炎為主要癥狀，同時(shí)有報(bào)道稱(chēng)與人類(lèi)的動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病也有關(guān)。許多人和動(dòng)物在感染后常呈隱性經(jīng)過(guò)和無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，反復(fù)感染和與其他病原菌的混合感染也較為多見(jiàn)，這增加了臨床診斷工作的難度。目前，國(guó)外學(xué)者已成功應(yīng)用嗜衣原體的主要外膜蛋白、熱休克蛋白、脂多糖、16S和23SrRNA基因的全長(zhǎng)序列為靶基因序列，通過(guò)運(yùn)用PCR、DNA雜交技術(shù)及Real-timePCR等技術(shù)實(shí)施衣原體的檢測(cè)。而國(guó)內(nèi)主要依據(jù)病原體分離和血清學(xué)檢查對(duì)衣原體進(jìn)行檢測(cè)。病原分離主要包括雞胚接種、細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，其操作程序復(fù)雜，而且費(fèi)時(shí)，且結(jié)果判定常帶有主觀(guān)性從而使這些方法在檢測(cè)時(shí)受到限制。尤其當(dāng)由這些病原體引起的爆發(fā)3時(shí)，常由于缺乏快速、準(zhǔn)確、敏感的檢測(cè)方法而貽誤疾病的控制，給人類(lèi)的健康與經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的損失。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是確立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的基于動(dòng)物源性嗜衣原體16SrRNA的TaqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)體系。在對(duì)其與鸚鵡熱嗜衣原體的常用PCR檢測(cè)體系進(jìn)行了敏感性和特異性比較的同時(shí)，證實(shí)該方法可在臨床上應(yīng)用。該方法系一種基于嗜衣原體16SrRNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物及探針，并以嗜衣原體標(biāo)準(zhǔn)菌株由來(lái)的DNA作為模板而確立的TaqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，并在檢測(cè)特異性與敏感性等方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)，最后應(yīng)用該檢測(cè)體系對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，以期評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系在臨床檢測(cè)方面的應(yīng)用可能性。本發(fā)明的目的是通過(guò)下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的一種TaqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的確立，以動(dòng)物源性嗜衣原體的16SrRNA為靶基因，包括標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)和DNA的分離純化、TaqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系與檢測(cè)步驟的確立。標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)步驟是選用動(dòng)物衣原體和嗜衣原體的標(biāo)準(zhǔn)菌株用HeLa229和H印-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后使用PuregeneDNA分離純化試劑盒(Funakoshi，Japan)從沒(méi)感染力的衣原體EB中分離純化基因組DNA。TaqManprobe檢測(cè)體系確立的步驟包括(1)根據(jù)鸚鵡熱嗜衣原體C.psittaci6BC(AccessionNo.AB001778)的16SrRNA片段序列，利用Primerexpress.2.0設(shè)計(jì)如下序列的引物和探針AC89F16S:5’-GGCGGAAGGGTTAGTAATACATAGATAA-3’AC218R16S:5’-AAGGTCCGAAGATCCCCTTCT-3，；Probe5，(FAM)-CCGCTAATACCGAATGTGGTATGTTTAGGC-(TAMRA)3'；(2)TaqManprobereal-timePCR檢測(cè)體系確立時(shí)所進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)均由7500real-timePCR儀實(shí)施完成，包括反應(yīng)體系、反應(yīng)條件，反應(yīng)體系是經(jīng)過(guò)對(duì)上下游引物和探針的濃度優(yōu)化后確定建立25yl反應(yīng)體系；反應(yīng)條件是由引物和探針的Tm值確立并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。TaqManprobereal-timePCR檢測(cè)體系的檢測(cè)包括檢測(cè)體系的特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)，同時(shí)將該檢測(cè)體系與一步法PCR檢測(cè)方體系進(jìn)行特異性與敏感性比較；特異性試驗(yàn)是將10pg的從動(dòng)物源性嗜衣原體的沒(méi)有感染力的EB中分離純化的DNA加入反應(yīng)體系中進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將同量的其他衣原體和相關(guān)菌株作為對(duì)照，根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)圖，以判定其檢測(cè)特異性；敏感性試驗(yàn)是將計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株C.psittaciNJ-1的濃度作梯度稀釋?zhuān)t<38設(shè)為該檢測(cè)體系的下限進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)；隨后，將該檢測(cè)體系與一步法PCR檢測(cè)體系進(jìn)行特異性與敏感性的比較。本發(fā)明的方法是基于動(dòng)物源性嗜衣原體16SrRNA的Real-timePCR檢測(cè)體系的確立，可概括為以下步驟1)以嗜衣原體16SrRNA序列為靶基因序列進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)；2)標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)和DNA的分離純化；3)TaqManprobereal-timePCR檢測(cè)體系的確立；4)特異性試驗(yàn)；5)該檢測(cè)體系對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)敏感性的確定，以及與常用一步法PCR檢測(cè)體系的比較。圖1為鸚鵡熱嗜衣原體C.psittaci6BC(AccessionNo.AB001778)的16SrRNA片段序列，AlignmentofconservedDNAsequenceson16SrRNAregionofChlamydophilaandChlamydia；圖2為本發(fā)明Real-timePCR檢測(cè)體系特異性試驗(yàn)，Specificitytestofthereal-timePCR；1.C.psittaciNJ-12.C.caviae0KM-23.C.felisFe/C-564.C.pecorumMaeda5.C.psittaciHelajika6.C.abortusB577；圖3為本發(fā)明Real-timePCR檢測(cè)體系敏感性試驗(yàn)，SensitivitytestoftheReal-timePCRdetectionsystem，①lOOpg②lOpg③lpg@0.lpg0.01pg。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不以此來(lái)限定本發(fā)明。實(shí)施例11.相關(guān)菌株DNA的提取1.1本發(fā)明所應(yīng)用到的衣原體和嗜衣原體的標(biāo)準(zhǔn)菌株如下所示C.psittaciCallO，C.psittaciHelajika，C.psittaciBud_l，C.psittaciNJ1，C.abortusB577,C.caviae0KM-2，C.felisFe/C-56,C.muridarumMoPn，C.pecorumIPA，C.pecorumMaeda，C.pneumoniaeTW183,C.pneumoniaeKkpn—1，C.pneumoniaeAR39，C.pneumoniaeTWAR,C.suisCS0301，C.trachomatisA/G，trachomatisB/Tw，C.trachomatisBa/Ap，C.trachomatisC/TW，C.trachomatisDa/UW，C.trachomatisD/UW,C.trachomatisE/UW,C.trachomatisF/UW,C.trachomatisG/UW,C.trachomatisH/UW,C.trachomatisI/UW,C.trachomatisIa/UW,C.trachomatisJ/UW,C.trachomatisK/UW,C.trachomatisLI,C.trachomatisL2,C.trachomatisL2a,C.trachomatisL30以上標(biāo)準(zhǔn)菌株均使用Hela229和H印_2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。除此之外還有非衣原體菌株作為陰性對(duì)照，具體如下Acinetobacterbaumannii，Acinetobacterlwoffi，Alcaligenesfaecalis，Alcaligenesxylosoxydans,Bacillussubti1is，Chryseobacteriumindologenes，Ehrlichiacanis，Ehrlichiachaffeensis，Escherichiacoli，F(xiàn)lavobacteriumodoratum，Haemophilusinfluenzae,Klebsiellapneumoniae，Legionellapneumophila，Listeriamonocytogenes,Pseudomonasaeruginosa，Pseudomonasfluorescens，Psudomonasstutzeri，Rickettsiaconorii，Rickettsiajaponica，Rickettsiaprowazekii,Rickettsiatyphii,Salmonellaarizonae,Salmonellacholeraesuis,Salmonellaenteritidis,Salmonellatyphimurium,Staphylococcusaureus,Staphylococcusspidermidis,Streptcoccuspyogenes,Streptococcuspneumoniae,Yersiniaenterocolitica.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的提取嗜衣原體和衣原體相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA是使用PuregeneDNA分離純化試劑盒(Fimakoshi，Japan)從沒(méi)有感染力的EB中分離純化得到。具體提取方法按制造商提供的說(shuō)明書(shū)所列的操作步驟進(jìn)行即可。1.3臨床樣本用于本檢測(cè)體系的臨床樣本為鳥(niǎo)類(lèi)的糞便樣本共239例，由以下單位提供鳥(niǎo)園135例，鳥(niǎo)類(lèi)寵物店104例。1.4臨床樣本的DNA分離純化，按QIAampDNAstoolMinikit(Qiagen,Germany)說(shuō)明要求進(jìn)行，其具體步驟如下1)將180_220mg糞便加入2ml的離心管中，置于冰上。1)加入1.6mlASL,震蕩數(shù)分鐘直至糞便充分混勻。2)將混勻的樣本置于70°C加熱5min，在加熱的同時(shí)隨時(shí)震蕩混勻，隨后以15，OOOrpm轉(zhuǎn)速離心2min；3)吸取1.4ml上清液加入至另一2ml離心管。4)加入InhibitEX片，持續(xù)震蕩一分鐘，直至藥片被充分混勻。在室溫中放置Imin,使PCR抑制劑被充分吸附。5)以15，OOOrpm轉(zhuǎn)速離心4min，將糞便顆粒和被吸附的PCR抑制劑被充分沉淀。6)離心結(jié)束后，吸取上清置于另一個(gè)新的1.5ml的離心管中，隨后高速離心數(shù)分鐘7)將20μ1的蛋白酶K加入另一個(gè)新的1.5ml離心管中，8)從7中吸取300μ1上清加入蛋白酶K的離心管中。9)隨后加入300μIAL緩沖液震蕩數(shù)秒鐘(不可以直接將蛋白酶K加入AL緩沖液中)10)置于70°C孵育IOmin。11)將10的混合液充分混勻后進(jìn)行微量離心，隨后再加入300μ1乙醇(96-100%)，震蕩混勻，再次微量離心。12)將QIAamp柱進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)將11步中的裂解液加入QIAamp柱，不可將邊緣弄濕。蓋上蓋子，高速離心2min。將QIAamp柱轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml離心管，將有濾液的離心管丟棄。13)打開(kāi)蓋子加入500μ1Aff1緩沖液，高速離心1分鐘。將QIAmap柱轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml離心管，將有過(guò)濾液的離心管丟棄。14)打開(kāi)蓋子加入500μ1Aff2緩沖液。高速離心3分鐘。將QIAmap柱轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml離心管，將有過(guò)濾液的離心管丟棄。再將QIAamp柱轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管以甩干QIAmap柱，將有過(guò)濾液的離心管丟棄。15)將QIAmap柱轉(zhuǎn)移至一新的并已作標(biāo)記的1.5ml離心管，向QIAmap柱的膜上小心添加25μ1AE緩沖液，室溫放置1分鐘，然后高速離心1分鐘，洗脫所得的DNA供分子生物學(xué)檢測(cè)備用。注糞便樣本采集后需用10%SPG緩沖液進(jìn)行預(yù)處理；最后進(jìn)行DNA洗脫時(shí)將說(shuō)明書(shū)中的100μ1AE改用25μ1進(jìn)行；并將溫浴時(shí)間延長(zhǎng)。2.TaqManprobereal-timePCR檢測(cè)體系的建立2.ITaqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物與探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)鸚鵡熱嗜衣原體C.psittaci6BC(AccessionNo.AB001778)的16SrRNA片段序列(附圖1所示)，利用Primerexpress.2.0設(shè)計(jì)引物和探針，目的片段長(zhǎng)度130bp。序列情況如下AC89F16S:5，-GGCGGAAGGGTTAGTAATACATAGATAA-3，AC218R16S:5，-AAGGTCCGAAGATCCCCTTCT-3，；Probe5，(FAM)-CCGCTAATACCGAATGTGGTATGTTTAGGC-(TAMRA)3，。2.2Taqmanprobereal-timePCR檢測(cè)體系的建立在該檢測(cè)體系確立過(guò)程中所進(jìn)行的Real-timePCR反應(yīng)均由ABI7500real-timePCR儀實(shí)施完成。2.2.ITaqManprobereal-timePCR反應(yīng)體系的確立經(jīng)過(guò)對(duì)上下游引物和探針的濃度優(yōu)化后確立了25μ1反應(yīng)體系900ηΜ的上下游引物AC89F16S/AC218R16S，12.5μ1的2XTaqManuniversalPCR反應(yīng)混合液，TaqManprobe250nM，模板DNA2.5μ1，最后用滅菌超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)足25μ1。2.2.2TaqManprobereal-timePCR反應(yīng)程序的確定由引物和探針的Tm值，確立并對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化(數(shù)據(jù)略)該反應(yīng)過(guò)程的退火溫度溫度為62°C，其反應(yīng)過(guò)程為50°C2min，95°C預(yù)變性lOmin，然后40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增95°C15s,62°CImin。3.TaqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)和評(píng)價(jià)3.1該檢測(cè)體系的特異性試驗(yàn)該檢測(cè)體系以嗜衣原體和衣原體的標(biāo)準(zhǔn)菌株和其他相關(guān)菌株進(jìn)行特異性檢測(cè)評(píng)價(jià)。具體是將IOpg從動(dòng)物源性嗜衣原體的沒(méi)有感染力的EB中分離純化的DNA加至實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)體系中進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以衣原體和其他菌株作為對(duì)照，從所得到的擴(kuò)增曲線(xiàn)圖，確定其檢測(cè)特異性，結(jié)果表明該檢測(cè)體系的probe能檢出Chlamydophilapsittaci、C.abortus、C.caviae、C.pecorum、C.felis種動(dòng)物源性嗜衣原體(如圖2所示)。3.2該檢測(cè)體系的敏感性試驗(yàn)將計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株C.psittaciNJ-I的濃度作十倍梯度稀釋?zhuān)Y(jié)果將每個(gè)反應(yīng)體系的鸚鵡熱嗜衣原體的DNA量分別確定為0.01，0.1，1，10，IOOpg,隨后進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，以Ct<38個(gè)循環(huán)為檢測(cè)下限作為該檢測(cè)體系的檢測(cè)極限。通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)圖可知本檢測(cè)體系可檢測(cè)到0.Olpg相當(dāng)?shù)柠W鵡熱嗜衣原體基因組DNA(如圖3與表1所示)，與一步法PCR的檢測(cè)敏感度相比高出10倍。3.3臨床樣本的檢測(cè)利用上述確立的檢測(cè)體系對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)(臨床樣本的來(lái)源、數(shù)目及DNA的提取按上述方法)，并與常規(guī)的一步法PCR進(jìn)行比較，其結(jié)果如表2所示，該檢測(cè)體系檢測(cè)到4例陽(yáng)性樣本，而常規(guī)PCR檢測(cè)體系則均為陰性，表明該檢測(cè)體系明顯優(yōu)于普通PCR檢測(cè)體系。表1.該實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系與一步法PCR檢測(cè)限度的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2.該實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系與一步法PCR在鳥(niǎo)類(lèi)臨床糞便樣本檢測(cè)上的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種建立TaqManprobe實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的方法，以動(dòng)物源性嗜衣原體的16SrRNA為靶基因，包括標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)和DNA的分離純化、TaqManprobe檢測(cè)體系的確立，TaqManprobe檢測(cè)體系的檢測(cè)步驟。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)步驟是選用動(dòng)物衣原體和嗜衣原體的標(biāo)準(zhǔn)菌株用HeLa229和!fep-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后使用PuregeneDNA分離純化試劑盒(Funakoshi，Japan)從沒(méi)感染力的衣原體EB中分離純化基因組DNA。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于TaqManprobe檢測(cè)體系的確立步驟包括(1)根據(jù)鸚鵡熱嗜衣原體C.psittaci6BC(AccessionNo.AB001778)的16SrRNA片段序列，利用Primerexpress.2.O設(shè)計(jì)如下序列的引物和探針AC89F16S:5’-GGCGGAAGGGTTAGTAATACATAGATAA-3’AP218R16S:5’-AAGGTCCGAAGATCCCCTTCT-3’；Probe5，(FAM)-CCGCTAATACCGAATGTGGTATGTTTAGGC-(TAMRA)3，；(2)TaqManprobereal-timePCR檢測(cè)體系的建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)均由7500real-timePCR儀實(shí)施完成，包括反應(yīng)體系、反應(yīng)條件，反應(yīng)體系是經(jīng)過(guò)對(duì)上下游引物和探針的濃度優(yōu)化后確定為25μ1反應(yīng)體系；反應(yīng)條件是由引物和探針的Tm值確立并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于TaqManprobereal-timePCR檢測(cè)體系的檢測(cè)包括檢測(cè)體系的特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)，同時(shí)將該兩試驗(yàn)與一步法PCR檢測(cè)體系進(jìn)行比較；特異性試驗(yàn)是將IOpg從動(dòng)物源性嗜衣原體的沒(méi)有感染力的EB中分離純化的DNA加入實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以同量的其他衣原體和相關(guān)菌株的DNA作為對(duì)照，得到擴(kuò)增曲線(xiàn)圖，以確定其檢測(cè)特異性；敏感性試驗(yàn)是將計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株C.psittaciNJ-I的濃度作梯度稀釋?zhuān)訡t值<38個(gè)循環(huán)為下限檢測(cè)該體系的靈敏性。全文摘要本發(fā)明是應(yīng)用新興分子生物學(xué)技術(shù)之一的Real-timePCR對(duì)動(dòng)物源性嗜衣原體(Chlamydophilapsittaci、C.abortus、C.caviae、C.pecorum、C.felis)實(shí)施的快速檢測(cè)與診斷方法。本檢測(cè)體系采用以動(dòng)物源性嗜衣原體的16SrRNA的保守區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物及相應(yīng)的TaqMan探針。該體系能對(duì)來(lái)自動(dòng)物的糞便和泄殖腔的棉拭子及人的氣管洗脫液中存在的動(dòng)物源性嗜衣原體基因進(jìn)行檢測(cè)，并且檢測(cè)敏感度比普通的PCR高出10倍。Real-timePCR具有無(wú)需進(jìn)行后PCR的處理，可避免因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳而可能造成的交叉污染，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率和可信度。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101812505SQ200910094279公開(kāi)日2010年8月25日申請(qǐng)日期2009年3月31日優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日發(fā)明者吳少雄,張忠華,柳陳堅(jiān),龔福明申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)