專(zhuān)利名稱(chēng)：新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及果糖基轉(zhuǎn)移酶新型固定化方法。
背景技術(shù)：
固定化酶技術(shù)在生物化工中應(yīng)用可使酶重復(fù)使用，易于與底物、產(chǎn)物分離，減少工藝環(huán) 節(jié)，同時(shí)還有助于酶促反應(yīng)的連續(xù)和自動(dòng)化操作，從而降低生產(chǎn)成本，因此，該技術(shù)在實(shí)際 生產(chǎn)中扮演著非常重要的角色。
低聚果糖，如蔗果三糖、蔗果四糖及蔗果五糖等，具有調(diào)節(jié)人體血脂及腸道有益菌群功 能，是對(duì)人體健康非常有益的一類(lèi)功能性糖類(lèi)化合物。目前，低聚果糖生產(chǎn)主要是通過(guò)液態(tài) 果糖基轉(zhuǎn)移酶催化來(lái)實(shí)現(xiàn)，為降低其生產(chǎn)成本，促進(jìn)低聚果糖生產(chǎn)，對(duì)其固定化酶技術(shù)^f究 引起了人們廣泛關(guān)注。
選擇一種合適載體通過(guò)交聯(lián)法固定化酶可使酶與載體連接更為牢固，穩(wěn)定性更好。基于 對(duì)殼聚糖無(wú)毒性、良好凝膠性及生物兼容性等物化性能充分認(rèn)識(shí)，吸附性能強(qiáng)的殼聚糖微球 為載體的固定化酶研究近年來(lái)備受關(guān)注。廣西大學(xué)魏遠(yuǎn)安課題組通過(guò)向殼聚糖酸性溶液中加 入強(qiáng)堿溶液制備殼聚糖無(wú)定形顆粒，然后向經(jīng)過(guò)處理得到的殼聚糖中性顆粒中加入交聯(lián)劑和 相應(yīng)的酶，得到固定化的果糖基轉(zhuǎn)移酶；上海大學(xué)雍克嵐課題組用三氯氧磷作交聯(lián)劑，將a-葡萄糖苷酶固定于殼聚糖上；浙江大學(xué)屠幼英課題組將多酚氧化酶包埋在殼聚糖、海藻酸鹽 和瓊脂材料上，然后用戊二醛和無(wú)水丁烯二酸-乙烯進(jìn)行交聯(lián)。
目前，我國(guó)大多采用一步交聯(lián)法固定化酶，即同一體系中交聯(lián)劑與酶和載體反應(yīng)，此外， 載體形狀不規(guī)則性，這些都將導(dǎo)致有機(jī)大分子物質(zhì)作為固定化酶載體的機(jī)械強(qiáng)度低，反應(yīng) 過(guò)程易碎，酶負(fù)載量較少，固定化酶的利用率低等缺點(diǎn)，從而限制固定化酶的使用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明的目的是提出一種新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化
方法，通過(guò)滴丸機(jī)將含有粘合劑聚乙烯吡咯烷酮的殼聚糖醋酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的
NaOH溶液中，制備得到顆粒形狀均一、機(jī)械強(qiáng)度好的殼聚糖球形顆粒，并以此為載體，通
過(guò)與交聯(lián)劑兩步反應(yīng)，固定了果糖基轉(zhuǎn)移酶，提高了殼聚糖作為固定化酶載體的機(jī)械強(qiáng)度，
提高了酶負(fù)載量。采用此方法制備的固定化酶，可多次重復(fù)使用。
3本發(fā)明設(shè)計(jì)思路是要求提高果糖基轉(zhuǎn)移酶被固定化的載體的機(jī)械強(qiáng)度，增加固定化酶酶 活，提高重復(fù)使用率。
本發(fā)明按以下步驟進(jìn)行操作
A、 利用機(jī)械法對(duì)菌絲體進(jìn)行處理，制備得果糖基轉(zhuǎn)移酶菌液；
B、 向濃度2%的殼聚糖醋酸溶液中按體積比加入0.01%~0.05%粘合劑聚乙烯吡咯垸酮；
C、 用滴丸機(jī)將B步驟得到的殼聚糖乙酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的氫氧化鈉溶液中，制 備顆粒形狀均一，直徑為2.5mm 3.5mm、機(jī)械強(qiáng)度好的殼聚糖球形顆粒，并將其洗至中性；
D、 將中性殼聚糖球形顆粒浸泡在磷酸緩沖液中，向含有中性殼聚糖球形顆粒的磷酸緩 沖液中按體積比0.1%~0.3%加入戊二醛交聯(lián)劑，使之鍵合在殼聚糖球形顆粒上，輕輕振動(dòng)2 個(gè)小時(shí)后，用去離子水充分洗滌至除去未鍵合戊二醛交聯(lián)劑；
E、 將鍵合了戊二醛的殼聚糖球形顆粒置于pH:7磷酸緩沖液，然后向其中加入果糖基 轉(zhuǎn)移酶菌液進(jìn)行固定化。
本發(fā)明所述步驟A中機(jī)械法處理菌絲體為取發(fā)酵菌絲體用自來(lái)水沖洗三次以去除培養(yǎng) 基中的色素等雜物。該歩驟如果是發(fā)酵罐中的菌絲體，在離心的時(shí)候可以用三倍體積的水進(jìn) 行沖洗；如果己經(jīng)取出的菌絲體，可以用二倍體積的水重懸之后，再進(jìn)行抽濾；加入pH為 7.0， 0.02M磷酸緩沖液，比例為l: 4，利用機(jī)械，如膠體磨、球磨機(jī)、雷蒙磨等處理菌絲體， 充分混勻。將研磨后的菌絲體利用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)。壓力大于0.5 1.5MPa，期間溫度保 持為0 5 °C。將破碎的細(xì)胞液進(jìn)行收集得到果糖基轉(zhuǎn)移酶菌液，測(cè)定其酶活，將菌液離心， 1000 4000r/min， 10 30分鐘，取上清，測(cè)酶活及體積。測(cè)離心沉淀的酶活及重量。
本發(fā)明所述步驟B為稱(chēng)取0.01%~0.05%聚乙烯吡咯垸酮加入到2%殼聚糖醋酸溶液中。
本發(fā)明所述步驟C為用滴丸機(jī)將含0.01%~0.05%聚乙烯吡咯垸酮的2%殼聚糖醋酸溶 液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的1M氫氧化鈉溶液中，調(diào)節(jié)后乙醇質(zhì)量百分含量為25%~35%。將獲得 的殼聚糖球形顆粒過(guò)濾并用蒸餾水充分洗滌直至中性。
本發(fā)明所述步驟D為將固定化酶載體利用pH為7.0的磷酸緩沖液重懸，其中作為濕載 體的殼聚糖球形顆粒與磷酸緩沖液的比例為質(zhì)量比為1:8。濕載體的活化通過(guò)加入0.1%~0.3% 的戊二醛交聯(lián)劑，輕輕振動(dòng)2個(gè)小時(shí)，然后用去離子水將多余的戊二醛交聯(lián)劑洗掉。
本發(fā)明所述步驟E為將殼聚糖球形顆粒以l: IO質(zhì)量比重懸于濃度介于12 50U/ml果 糖基轉(zhuǎn)移酶液中，16'C固定10小時(shí)，得固定化酶顆粒，利用去離子水洗滌以除去游離酶，得 到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明與現(xiàn)有方法技術(shù)相比，具有如下實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)
1. 本發(fā)明向殼聚糖醋酸溶液中加入了 0.01%~0.05%粘合劑聚乙烯吡咯烷；
2. 本發(fā)明充分利用了滴丸機(jī)及乙醇調(diào)節(jié)了 NaOH堿液，此條件下制備的殼聚糖顆粒形狀均 一，直徑在2.5mm 3.5mm,機(jī)械強(qiáng)度好；
3. 交聯(lián)和固定分階段進(jìn)行，大大提高了果糖基轉(zhuǎn)移酶的負(fù)載量，增加了酶活。 本發(fā)明以殼聚糖球形顆粒為載體，通過(guò)與交聯(lián)劑兩步反應(yīng)，固定了果糖基轉(zhuǎn)移酶，克服
了傳統(tǒng)一步法固定化酶不足，其顆粒形狀均一，直徑在2.5mm 3.5mm，機(jī)械強(qiáng)度好，表面積 大，大幅度提高了酶負(fù)載量，增強(qiáng)了酶活，酶活力回收率平均達(dá)到了 85%，殼聚糖球形顆粒 固定化酶循環(huán)使用次數(shù)達(dá)到50次以上，降低了游離酶的反應(yīng)成本。此外，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單， 生產(chǎn)設(shè)備投資少；在低聚果糖生產(chǎn)過(guò)程中能有效提高低聚果糖生產(chǎn)效能，降低低聚果糖生產(chǎn) 成本。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體實(shí)施實(shí)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于此。
實(shí)施例一
用滴丸機(jī)將含0.01%粘合劑聚乙烯吡咯烷酮的2%殼聚糖醋酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的 1M氫氧化鈉溶液中，將獲得的殼聚糖球形顆粒過(guò)濾并用去離子水充分洗滌直至中性。
將固定化酶載體利用pH為7.0的磷酸緩沖液重懸，其中濕載體與緩沖液的比例為質(zhì)量比 為h 8。載體的活化通過(guò)加入0.1%的交聯(lián)劑，輕輕振動(dòng)2個(gè)小時(shí)，然后用去離子水將多余的 交聯(lián)劑洗掉。
將殼聚糖球形顆粒以l: IO質(zhì)量比重懸于濃度介于12U/ml果糖基轉(zhuǎn)移酶液中，16'C固定 IO小時(shí)，得固定化酶顆粒，利用去離子水洗滌以除去游離酶，得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。測(cè) 其活力為40U/g，按lkg 52。/。蔗糖溶液與40g固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶比例進(jìn)行酶化反應(yīng)，在50 'C反應(yīng)8h，得到低聚果糖溶液用過(guò)濾法回收固定化果糖基酶，低聚果糖溶液經(jīng)板框壓濾后， 再經(jīng)濃縮，得到復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)的低聚果糖。
實(shí)施例二-
用滴丸機(jī)將含0.03。/。聚乙烯吡咯垸酮的2。/。殼聚糖醋酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的lM氫氧 化鈉溶液中，將獲得的殼聚糖球形顆粒過(guò)濾并用去離子水充分洗滌直至中性。
將固定化酶載體利用pH為7.0的磷酸緩沖液重懸，其中濕載體與緩沖液的比例為質(zhì)量比 為l: 8。載體的活化通過(guò)加入0.15%的交聯(lián)劑，輕輕振動(dòng)2個(gè)小時(shí)，然后用去離子水將多的交聯(lián)劑洗掉。
將殼聚糖球形顆粒以l: 10質(zhì)量比重懸于濃度30U/ml果糖基轉(zhuǎn)移酶液中，16。C固定10 小時(shí)，得固定化酶顆粒，利用去離子水洗滌以除去游離酶，得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。測(cè)其 活力為80U/g，按lkg 52%蔗糖溶液與20g固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶比例進(jìn)行酶化反應(yīng)，在5(TC 反應(yīng)10h，得到低聚果糖溶液用過(guò)濾法回收固定化果糖基酶，低聚果糖溶液經(jīng)板框壓濾后， 再經(jīng)濃縮，得到復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)的低聚果糖。
實(shí)施例三
用滴丸機(jī)將含0.05n/。聚乙烯吡咯烷酮的2。/。殼聚糖醋酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的lM氫氧 化鈉溶液中，將獲得的殼聚糖球形顆粒過(guò)濾并用去離子水充分洗滌直至中性。
將固定化酶載體利用pH為7.0的磷酸緩沖液重懸，其中濕載體與緩沖液的比例為質(zhì)量比 為l: 8。載體的活化通過(guò)加入0.3%的交聯(lián)劑，輕輕振動(dòng)2個(gè)小時(shí)，然后用去離子水將多余的 交聯(lián)劑洗掉。
將殼聚糖球形顆粒以l: 10質(zhì)量比重懸于濃度介于50U/ml果糖基轉(zhuǎn)移酶液中，16。C固定 IO小時(shí)，得固定化酶顆粒，利用去離子水洗滌以除去游離酶，得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。測(cè) 其活力為50U/g，按lkg 52y。蔗糖溶液與25g固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶比例進(jìn)行酶化反應(yīng)，在50 'C反應(yīng)8h，得到低聚果糖溶液用過(guò)濾法回收固定化果糖基酶，低聚果糖溶液經(jīng)板框壓濾后， 再經(jīng)濃縮，得到復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)的低聚果糖。
權(quán)利要求
1、一種新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，其特征在于包括下列步驟(1)向殼聚糖醋酸溶液中加入0.01％～0.05％粘合劑聚乙烯吡咯烷酮；(2)將上述殼聚糖醋酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的NaOH溶液中，制備殼聚糖球形顆粒，并將殼聚糖球形顆粒用蒸餾水洗滌至中性；(3)將中性殼聚糖球形顆粒置于pH＝7的磷酸緩沖液中，加入戊二醛交聯(lián)劑，使之鍵合在殼聚糖球形顆粒上，并充分洗滌，以除掉未鍵合的戊二醛；(4)將鍵合了戊二醛的殼聚糖球形顆粒置于pH＝7磷酸緩沖液，然后向其中加入果糖基轉(zhuǎn)移酶，使之固定化。
2、 如權(quán)利要求書(shū)1所述的新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，其特征在于向濃度為2%殼聚糖醋酸溶液中加入0.01%~0.05%粘合劑聚乙烯吡咯烷酮。
3、 如權(quán)利要求書(shū)1所述的新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，其特征在于所述殼聚糖球形顆粒的制備是通過(guò)滴丸機(jī)將含0.01% 0.05%粘合劑聚乙烯吡咯烷酮的殼聚糖醋酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的1MNaOH溶液，調(diào)節(jié)后的乙醇質(zhì)量百分含量為25%~35%。
4、 如權(quán)利要求書(shū)1所述的新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，其特征在于所述殼聚糖球形顆粒直徑在2.5mm ~3.5mm。
5、 如權(quán)利要求書(shū)1所述的新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，其特征在于所述殼聚糖球形顆粒有利于戊二醛交聯(lián)反應(yīng)和果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化。
6、 如權(quán)利要求書(shū)1所述的新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，其特征在于所述步驟(3)的反應(yīng)是，向含有中性殼聚糖球形顆粒的pH = 7磷酸緩沖液中，加入質(zhì)量百分含量為0.1%~0.3%的戊二醛交聯(lián)劑，將戊二醛固定在殼聚糖球形顆粒上，此條件下制備的殼聚糖顆粒可鍵合較大量的戊二醛。
7、 如權(quán)利要求書(shū)1所述的新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，其特征在于所述步驟(4)的反應(yīng)是，向含有鍵合了戊二醛的殼聚糖pHz7磷酸緩沖液中，加入濃度介于12~50U/ml果糖基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)行酶固定化，16°C，固定10h。
8、 如權(quán)利要求書(shū)1所述的新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，其特征在于通過(guò)戊二醛交聯(lián)和固化分階段反應(yīng)，將果糖基轉(zhuǎn)移酶固定在殼聚糖球形顆粒上。
全文摘要
一種新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，包括下列步驟(1)向殼聚糖醋酸溶液中加入0.01％～0.05％粘合劑聚乙烯吡咯烷酮；(2)將上述殼聚糖醋酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過(guò)的NaOH溶液中，制備殼聚糖球形顆粒，并將殼聚糖球形顆粒用蒸餾水洗滌至中性；(3)將中性殼聚糖球形顆粒置于pH＝7的磷酸緩沖液中，加入戊二醛交聯(lián)劑，使之鍵合在殼聚糖球形顆粒上，并充分洗滌，以除掉未鍵合的戊二醛；(4)將鍵合了戊二醛的殼聚糖球形顆粒置于pH＝7磷酸緩沖液，然后向其中加入果糖基轉(zhuǎn)移酶，使之固定化；本發(fā)明固定了果糖基轉(zhuǎn)移酶，提高了殼聚糖作為固定化酶載體的機(jī)械強(qiáng)度，提高了酶負(fù)載量；采用此方法制備的固定化酶，可多次重復(fù)使用。
文檔編號(hào)C12N11/10GK101538565SQ200910094419
公開(kāi)日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日
發(fā)明者別松濤, 唐石榮, 李世平, 段進(jìn)軍, 毛淑紅, 牟云青, 路福平 申請(qǐng)人:云南健生生物科技有限公司;天津科技大學(xué)