專利名稱：：一種y染色體微缺失的基因檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種用于檢測Y染色體微缺失的方法。
背景技術(shù)：
：根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization,WHO)的1997年的研究報(bào)告指出，在發(fā)達(dá)國家中不育夫婦占已婚育齡夫婦的15%，其中男性不育又占不育夫婦總數(shù)的50%。對于這50%的男性不育癥患者，從臨床資料統(tǒng)計(jì)來看，可將其不育的病因大體分為以下四類生精障礙、輸精管道梗阻、性腺器官附屬異常、及性功能異常。其中又以精子發(fā)生障礙最為常見。引起精子發(fā)生障礙的因素主要包括兩個(gè)方面遺傳因素和非遺傳因素。遺傳因素導(dǎo)致生精障礙而不育的比率約占不育癥患者的30%,因此有關(guān)原發(fā)性無精子癥及嚴(yán)重少精子癥的遺傳因素日益受到重視。Tiepolo和Zuffardi在1976年對6個(gè)無精子患者在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)長臂1區(qū)1帶(Yqll.l)遠(yuǎn)端缺失，因而推測在Yqll區(qū)上存在著Y染色體精子生成基因，提出了與精子生成密切相關(guān)的無精子因子區(qū)(azoospermiafactorregion,AZF)的概念。Vogt等人1996年的研究進(jìn)一步將AZF區(qū)分為AZFa、AZFb和AZFc。Y染色體上AZF的微缺失可以造成生精障礙，導(dǎo)致無精癥或嚴(yán)重少精子癥。臨床上利用PCR擴(kuò)增的序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)技術(shù)來檢測Y染色體AZF微缺失，用于診斷因基因缺陷導(dǎo)致的無精癥或嚴(yán)重少精子癥，檢出率在1%~55%之間不等。由于AZF區(qū)的部分缺失的不育男性可以通過"試管嬰兒"技術(shù)生育后代，造成男性后代更為嚴(yán)重的Y染色體微缺失及不育，所以目前男科學(xué)要求Y染色體微缺失基因檢測作為男性不育的常規(guī)檢查，特別是在實(shí)行卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)和其他入工輔助生殖治療時(shí)必須做該項(xiàng)檢查。因此，建立一種簡單、穩(wěn)定的分子遺傳學(xué)檢測方法，對明確男性不育的病因和釆取相應(yīng)的治療方案，具有重要的臨床價(jià)值。AZF區(qū)長度約為7.5Mb,利用STSs對AZF片段微缺失的定位常常需要選擇多個(gè)STS位點(diǎn)來檢測。多重PCR技術(shù)可以在同一個(gè)反應(yīng)體系同時(shí)擴(kuò)增多對引物(每一個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增需要一對引物)，以達(dá)到簡單、快速、高通量和經(jīng)濟(jì)地復(fù)合擴(kuò)增多個(gè)基因片斷的目的，是Y染色體微缺失釆用的較好的方法。但多重PCR技術(shù)相對于常規(guī)PCR方法技術(shù)含量更高。因?yàn)槎嘀豍CR要求多對引物在同一個(gè)反應(yīng)條件下復(fù)合擴(kuò)增，每對引物達(dá)到最適擴(kuò)增效率的反應(yīng)條件不一致，這就要求對復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系的引物使用濃度、PCR緩沖液的濃度、鎂離子濃度、dNTP濃度、PCR循環(huán)數(shù)、PCR循環(huán)中的各階段的溫度、不同廠家Taq酶及用量、模板DNA用量等因素進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)化復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)條件，達(dá)到最大擴(kuò)增目的片斷效率，同時(shí)減少非特異擴(kuò)增的目的(HenegariuO.，etal.1997,BioTechniques23:504-511)。現(xiàn)有技術(shù)中，這一過程搡作繁瑣、失敗率高，尤其是擴(kuò)增效率低下導(dǎo)致目的片斷檢測不到，以及引物二聚體大量產(chǎn)生干擾結(jié)果判斷.，對臨床快速診斷帶來較大麻煩。有的技術(shù)要么選擇較少的引物對，要么選擇添加某種化合物，以達(dá)到降低引物二聚體的目的。這樣造成不能完全檢測AZF片段微缺失(中國發(fā)明專利申請200410043918.0),或增加試劑成本(中國發(fā)明專利申請200710074317.X)。這是本領(lǐng)域一個(gè)亟待解決的技術(shù)難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種操作簡單、高效、通過一次性擴(kuò)增多個(gè)基因片斷用于檢測Y染色體微缺失的方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明提供了一種Y染色體微缺失的基因檢測方法，該方法包括以下步1.提取人外周血基因組DNA常規(guī)煮沸裂解法或柱洗脫法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得預(yù)期DNA產(chǎn)量約4-12ug，作為模板DNA;2.PCR擴(kuò)增采用多重PCR引物設(shè)計(jì)，多重PCR反應(yīng)體系包含N對特異擴(kuò)增Y染色體AZF片斷中STSs位點(diǎn)的嵌合引物對和1對通用引物對；多重PCR反應(yīng)在N+1對引物對的參與下，在同一個(gè)反應(yīng)體系中經(jīng)過變性、退火、延伸循環(huán)擴(kuò)增目的DNA模板的反應(yīng)；3.檢測擴(kuò)增產(chǎn)物取10ulPCR產(chǎn)物，EB染色，經(jīng)3%瓊脂糖電泳。電泳電壓4V/cm，電泳時(shí)間20分鐘；4.結(jié)果判斷a.紫外透射儀下觀察電泳圖譜，SRY基因作為男性性別決定基因，在實(shí)驗(yàn)中作為內(nèi)參對照；男性標(biāo)本都應(yīng)擴(kuò)增出內(nèi)參對照條帶，使用一女性樣本用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)的特異性和污染情況；水空白對照用來監(jiān)控試劑是否被污染；b.如與正常生育男性對照相比出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)條帶缺失，判斷為其對應(yīng)的AZF片斷缺失；如A管的MsY254和B管的MsY255條帶丟失，判斷為AZFc缺失;如A管的MsY254、MsY127和B管的MsY255、MsY134條帶丟失,判斷為AZFb+c缺失。其中，所述的通用引物對YUP1:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'YUP2:5，-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'所述的Y染色體AZF片斷STSs位點(diǎn)的嵌合引物對為sY84位點(diǎn)嵌合引物對《MsY84-F:5，-YUP1-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3，MsY84-R:5，-YUP2-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3，sY86位點(diǎn)嵌合引物對MsY86-F:5，-YUP1-AGACTATGCTTCAGCAGGTC-3，MsY86-R:5，-YUP2-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3，sY127位點(diǎn)嵌合引物對MsY127-F:5，-YUP1-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3，MsY127-R:5'-YUP2-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3'sY134位點(diǎn)嵌合引物對MsY134-F:5，-YUP1-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3，MsY134-R:5，-YUP2-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3，sY254位點(diǎn)嵌合引物對MsY254-F:5'-YUP1-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3'MsY254-R:5'-YUP2-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3'sY255位點(diǎn)嵌合引物對MsY255-F:5，-YUP1-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3，MsY255-R:5，-YUP2-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，SRY位點(diǎn)嵌合引物對MSRY-F:5'-YUP1-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'MSRY-R:5，-YUP2-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3，所述的通用引物對為一對非人類同源序列的寡核苷酸鏈，不能與人基因組序列特異結(jié)合。所述的通用引物對中至少一條引物鏈的解鏈溫度Tm大于65"C。通用引物對的退火溫度范圍從52i:~65°C。所述嵌合引物對的3'端為能與人類組基因序列互補(bǔ)的特異序列；嵌合引物對的正反引物5，端分別與通用引物YUP1和YUP2相同。嵌合引物5，端AG值大于3'端AG,所有嵌合引物的解鏈溫度Tm大于70。CD所述多重PCR反應(yīng)條件為1xPCRbuffer(50腦ol/LKC1,10mmol/LTris-HC1,pH9.0)，1.5mMMgCU200uMdNTP，5~10ng模板DNA，和1UTaqDNA聚合酶(Promega),50-200nM各嵌合引物濃度，200nM-luM通用引物濃度。PCR循環(huán)條件為95。C預(yù)變性5min，然后95。C變性40s，54°C退火40s，72。C延伸40s,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后，72。C再延伸10min。所述多重PCR方法應(yīng)可用于Y染色體微缺失的任何STS位點(diǎn)的檢測。本發(fā)明的工作原理PCR技術(shù)，全稱聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction,PCR),是在很短時(shí)間內(nèi)體外酶促合成(擴(kuò)增)特異模板DNA片斷的生化反應(yīng)。其過程以變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟為一個(gè)循環(huán)，反復(fù)重復(fù)循環(huán)20-40次，使DNA得以擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的基本原理是半保留復(fù)制的原理在變性溫度下，雙鏈DNA解開成兩條單鏈，利用人工合成的一對與模板DNA特異結(jié)合的寡核苷酸鏈作為引物，在退火溫度下正、反引物分別與目標(biāo)DNA的兩條鏈結(jié)合，通過簡A聚合酶的作用在引物的3'端合成互補(bǔ)DNA,合成的起點(diǎn)是引物結(jié)合位點(diǎn)，方向?yàn)?'—3',按模板DNA序列合成互補(bǔ)片斷。根據(jù)PCR擴(kuò)增原理，本發(fā)明選擇一對非人類同源序列的寡核苷酸鏈作為通用引物，取名為YUP1和YUP2。在檢測AZF片段微缺失的每個(gè)STS位點(diǎn)序列兩端設(shè)計(jì)一對特異引物。此對特異引物的正向引物的5'端加上一段非人類同源序列的寡核苷酸鏈YUPl,反向引物的5，端加上一段非人類同源序列的寡核苷酸鏈YUP2，合成一對新的嵌合引物。多個(gè)STSs位點(diǎn)的每對特異引物均在其正向引物寡核苷酸鏈的5'端加上YUP1，反向引物寡核苷酸鏈的5'端加上YUP2，形成嵌合引物組合。在檢測AZF片段微缺失的多重PCR反應(yīng)體系中，包含N個(gè)STSs位點(diǎn)的嵌合引物對，另外加上一對通用引物對，形成N+1引物對。整個(gè)PCR反應(yīng)過程可以分為兩個(gè)階段。第一階段包括PCR反應(yīng)的前三個(gè)循環(huán)，使用嵌合引物對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。嵌合引物對的3'端為人類基因組特異序列，能與模板DNA特異結(jié)合從而擴(kuò)增目的DNA片斷。擴(kuò)增產(chǎn)物包含目的DNA片斷和目的DNA片斷5'端的非人類同源序列的寡核苷酸序列。第二階段反應(yīng)使用一對通用引物YUP1和YUP2對第一階段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)過第一階段的擴(kuò)增，最初多對特異性引物與不同STSs模板結(jié)合后的擴(kuò)增產(chǎn)物的5'端均含有非人類同源序列的寡核苷酸序列。使用一對通用引物YUP1和YUP2與擴(kuò)增產(chǎn)物的非人類同源序列結(jié)合并進(jìn)行擴(kuò)增，可以讓多對引物的反應(yīng)條件統(tǒng)一為一對通用引物的反應(yīng)條件，最終達(dá)到穩(wěn)定多對特異性引物的擴(kuò)增效率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)1.應(yīng)用本發(fā)明，只需簡單調(diào)整嵌合引物之間的引物濃度，無需優(yōu)化其它復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)條件就能得到滿意的擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物能夠應(yīng)用普通瓊脂糖電泳觀察，滿足國內(nèi)大多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件。2.通過一次性擴(kuò)增多個(gè)基因片斷，在常規(guī)引物5'端加上一段非人類同源序列的嵌合引物設(shè)計(jì)方法，以達(dá)到保證多對引物擴(kuò)增效率相當(dāng)，同時(shí)減少引物二聚體的形成。建立了一種簡化PCR反應(yīng)條件，擴(kuò)增效率高，易于臨床實(shí)驗(yàn)搡作的檢測Y染色體微缺失的方法。圖l為本發(fā)明Y染色體微缺失基因檢測結(jié)果的電泳圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，對發(fā)明作進(jìn)一步的說明。通過實(shí)施例和附圖可以對本發(fā)明有更清楚地了解，但值得強(qiáng)調(diào)的是，它們并不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。人基因組DNA提取一一常規(guī)煮沸裂解法或柱洗脫法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得預(yù)期DNA產(chǎn)量約4-12ug,作為模板DNA。PCR擴(kuò)增——多重PCR擴(kuò)增分成A管和B管進(jìn)行。30ul的PCR反應(yīng)體系為1XPCRbuffer(50醒ol/LKC1，10畫1/LTris—HC1，pH9.0)，1.5mMMgCh，200uMdNTP，5~10ng模板DNA，和1UTaqDNA聚合酶(Promega);A管加入5對引物的濃度為MSRY0.12uM，MsY2540.luM,MsY1270.05我MsY860.1uM，YUP0.4uM;B管加入5對引物的濃度為MSRYO.luM,MsY1340.12uM，MsY840.12uM,MsY2550.05uM，YUP0.4uM，反應(yīng)在ABI公司9700型PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行。每次檢測同時(shí)設(shè)立陽性對照(正常生育男性基因組DNA)、陰性對照(女性基因組DNA)和水空白對照。PCR循環(huán)條件為:95。C預(yù)變性5min，然后95。C變性40s,54。C復(fù)性40s,72。C延伸40s,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后，72。C再延伸10min。PCR產(chǎn)物于4'C冰箱中儲存。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測_一取10ulPCR產(chǎn)物，EB染色，經(jīng)3%瓊脂糖電泳。電泳電壓4V/cm,電泳時(shí)間20分鐘。3%瓊脂糖電泳反應(yīng)產(chǎn)物條帶位置，如表1所示。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果判斷一一紫外透射儀下觀察電泳圖譜。SRY基因作為男性性別決定基因，在實(shí)驗(yàn)中充當(dāng)內(nèi)參對照。男性標(biāo)本都應(yīng)擴(kuò)增出內(nèi)參對照條帶。使用一女性樣本用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)的特異性和污染情況。此外，水空白對照用來監(jiān)控試劑是否被污染。如果與正常生育男性對照相比出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)條帶缺失，可判斷為其對應(yīng)的AZF片斷缺失。如A管的MsY254和B管的MsY255條帶丟失，可判斷為AZFc缺失；如A管的MsY254、MsY127和B管的MsY255、MsY134條帶丟失，可判斷為AZFb+c缺失，見圖l。圖l中，混和引物A管l道AZFc區(qū)缺失患者(MsY254缺失)；6道AZFb+c區(qū)缺失患者(MsY254,MsY127缺失);3，8道正常男性對照；混和引物B管2道AZFc區(qū)缺失患者(MsY255缺失)；7道AZFb+c區(qū)缺失患者(MsY255，MsY134缺失);4，9道:正常男性對照；5道:Mark實(shí)施例2AZF片段STS位點(diǎn)的選擇根據(jù)歐洲男科學(xué)會(huì)EAA(臨床層面)和歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制協(xié)會(huì)EMQN(具體實(shí)驗(yàn)搡作層面)發(fā)布的《歐洲Y染色體微缺失分子診斷指南2004版本》推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(SIM0NIM.，etal.2004，InternationalJournalofAndrology，27，240-249)。AZFa區(qū)選擇sY84和sY86位點(diǎn)特異性擴(kuò)增AZFa區(qū)sY84的引物堿基序列為sY84-F:5，-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3'sY84-R:5，-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3，特異性擴(kuò)增AZFa區(qū)sY86的引物堿基序列為sY86-F:5'-AGACTATGCTTCAGCAGGTC-3'sY86-R:5'-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3'AZFb區(qū)選擇sY127和sY134位點(diǎn)特異性擴(kuò)增AZFb區(qū)SY127的引物堿基序列為sY127-F:5，-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3'sY127-R:5'-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3'特異性擴(kuò)增AZFb區(qū)sY134的引物堿基序列為sY134-F:5'—GTC丁GCCTCACCATAAAACG—3'sY134-R:5'-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3'AZFc區(qū)選擇sY254和sY255位點(diǎn)特異性擴(kuò)增AZFc區(qū)sY254的引物堿基序列為sY254-F:5，-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3，sY254-R:5，-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3，特異性擴(kuò)增AZFc區(qū)sY255的引物堿基序列為sY255-F:5，-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3，sY255-R:5，-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，設(shè)置男性性別決定基因SRY(sexdeterminingregionY)作為內(nèi)對照特異性擴(kuò)增Y染色體SRY基因的引物堿基序列為SRY-F:5'-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'SRY-R:5，-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3，根據(jù)所述方法，Y染色體微缺失檢測的各STS位點(diǎn)嵌合引物的堿基序列設(shè)計(jì)如下非人類同源序列通用引物YUP的引物堿基序列為YUPl:5，_CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，YUP2:5，-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3，在每個(gè)特異性擴(kuò)增STS位點(diǎn)的正、反引物5，端分別加上YUPl或YUP2寡核苷酸序列，合成嵌合引物的堿基序列，如表2所示。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例3提取人外周血基因組DNA。PCR反應(yīng)，多重PCR以15ul的PCR反應(yīng)體系為例。反應(yīng)體系(pH8.5)包括以下試劑PCR反應(yīng)液，Taq酶，dATP，dGTP，dCTP，dTTP,MgCL,引物,模板DNA。dNTP反應(yīng)終濃度均為200uM;MgCL反應(yīng)終濃度為1.5mM。PCR擴(kuò)增分成兩管進(jìn)行A管復(fù)合擴(kuò)增5對引物；B管復(fù)合擴(kuò)增5對引物，兩管均設(shè)計(jì)MSRY引物作為內(nèi)對照。引物對分組如下A組MSRY，MsY254(AZFc)，MsY127(AZFb)，MsY86(AZFa),YUPB組MSRY,MsY134(AZFb)，MsY84(AZFa)，MsY255(AZFc),YUPPCR循環(huán)條件95。C預(yù)變性5min，然后95。C變性40s，54。C退火40s，72。C延伸40s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后，72。C再延伸10min。3%瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。通用引物設(shè)計(jì)遵循以下條件l.通用引物為非人類同源序列，不能與人基因組序列特異結(jié)合；2.引物長度通常為18-30bp，通用引物富含GC，嵌合引物5'端AG值大于3'端AG，所有嵌合引物的解鏈溫度Tm〉70。C;3.通用引物不能有二級結(jié)構(gòu)和3'端互補(bǔ)堿基數(shù)盡量少。本發(fā)明設(shè)計(jì)的通用引物除具備上述條件外，其退火溫度范圍從52匸至65°C，適合于大多數(shù)特異擴(kuò)增人基因組序列引物的退火溫度條件，簡化了最初引物設(shè)計(jì)的難度。權(quán)利要求1.一種Y染色體微缺失的基因檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)提取人外周血基因組DNA常規(guī)煮沸裂解法或柱洗脫法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得預(yù)期DNA產(chǎn)量約4-12ug，作為模板DNA；(2)PCR擴(kuò)增采用多重PCR引物設(shè)計(jì)，多重PCR反應(yīng)體系包含N對特異擴(kuò)增Y染色體AZF片斷中STSs位點(diǎn)的嵌合引物對和1對通用引物對；多重PCR反應(yīng)在N+1對引物的參與下，在同一個(gè)反應(yīng)體系中經(jīng)過變性、退火、延伸循環(huán)擴(kuò)增目的DNA模板的反應(yīng)；(3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物取10ulPCR產(chǎn)物，EB染色，經(jīng)3％瓊脂糖電泳。電泳電壓4V/cm，電泳時(shí)間20分鐘；(4)結(jié)果判斷a.紫外透射儀下觀察電泳圖譜，SRY基因作為男性性別決定基因，在實(shí)驗(yàn)中作為內(nèi)參對照；男性標(biāo)本都應(yīng)擴(kuò)增出內(nèi)參對照條帶，使用一女性樣本用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)的特異性和污染情況；水空白對照用來監(jiān)控試劑是否被污染；b.如與正常生育男性對照相比出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)條帶缺失，判斷為其對應(yīng)的AZF片斷缺失；如A管的MsY254和B管的MsY255條帶丟失，判斷為AZFc缺失；如A管的MsY254、MsY127和B管的MsY255、MsY134條帶丟失，判斷為AZFb+c缺失。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，(1)通用引物對YUP1:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'YUP2:5，-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3，(2)Y染色體AZF片斷STSs位點(diǎn)的嵌合引物對sY84位點(diǎn)嵌合引物對MsY84-F:5，-YUP1-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3，MsY84-R:5'-YUP2-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3'sY86位點(diǎn)嵌合引物對MsY86-F:5'-YUP1-AGACTATGCTTCAGCAGGTC-3'MsY86-R:5,-YUP2-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3，sY127位點(diǎn)嵌合引物對MsY127-F:5'-YUP1-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3'MsY127-R:5'-YUP2-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3'sY134位點(diǎn)嵌合引物對MsY134-F:5,-YUPl-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3，MsY134-R:5'-YUP2-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3'sY254位點(diǎn)嵌合引物對MsY254-F:5'-YUP卜GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3'MsY254-R:5，-YUP2-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3，sY255位點(diǎn)嵌合引物對MsY255-F:5，-YUPl-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3，MsY255-R:5，-YUP2-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，SRY位點(diǎn)嵌合引物對MSRY-F:5'-YUPl-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'MSRY-R:5'-YUP2-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3'。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測方法，其特征在于，所述通用引物對為一對非人類同源序列的寡核苷酸鏈。.4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述通用引物對中至少一條引物鏈的解鏈溫度Tm大于65°C。通用引物對的退火溫度范圍從52°C~65°C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述嵌合引物對的3，端為能與人類基因組序列互補(bǔ)的特異序列；嵌合引物對的正反引物5，端分別與通用引物YUPl和YUP2相同。嵌合引物5，端AG值大于3，端AG，所有嵌合引物的解鏈溫度Tm大于7(TC。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述多重PCR反應(yīng)條件為lxPCRbuffer(50mmol/LKCl，10,ol/LTris-HC1，pH9.0)，1.5mMMgCU200uMdNTP，5~10ng模板DNA,和1UTaqDNA聚合酶(Promega),50~200nM各嵌合引物濃度，200nM-luM通用引物濃度。PCR循環(huán)條《牛為95。C預(yù)變性5min，然后95。C變性40s,54。C退火40s，72。C延伸40s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后，72。C再延伸10min。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述多重PCR方法應(yīng)用于Y染色體微缺失的任何STS位點(diǎn)的檢測。全文摘要本發(fā)明公開了一種Y染色體微缺失的基因檢測方法。該方法提取人外周血基因組DNA后，采用多重PCR引物設(shè)計(jì)，多重PCR反應(yīng)體系包含N對特異擴(kuò)增Y染色體AZF片斷中STSs位點(diǎn)的嵌合引物對和1對通用引物對。多重PCR反應(yīng)在N+1對引物的參與下，在同一個(gè)反應(yīng)體系中經(jīng)過變性、退火、延伸循環(huán)擴(kuò)增目的DNA模板的反應(yīng)；取10ulPCR產(chǎn)物，EB染色，經(jīng)3％瓊脂糖電泳。電泳電壓4V/cm，電泳時(shí)間20分鐘；然后紫外透射儀下觀察電泳圖譜對結(jié)果作出判斷。從而建立了一種簡化PCR反應(yīng)條件，擴(kuò)增效率高，易于臨床實(shí)驗(yàn)操作的檢測方法。文檔編號C12Q1/68GK101575647SQ200910094618公開日2009年11月11日申請日期2009年6月19日優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日發(fā)明者葉峻杰,張雨龍,李宗芳,李江川,君沈,磊王,王躍力,途昕明,海郭,慧閻申請人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院