專利名稱：：鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體及制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，尤其是涉及一種鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體，制備方法及其用途。
背景技術：
：鹿流行性出血病(epizootichaemoirhagicdiseaseofdeer，EHD)是一種季節(jié)性、非接觸性的病毒性傳染病。鹿流行性出血病病毒(EHDV)為呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的成員，是通過節(jié)肢動物(主要是庫蠓)傳播的雙股RNA病毒，在形態(tài)結構上與藍舌病病毒(BTV)極為相似，血清學上與藍舌病有明顯交叉。在自然條件下，鹿流行性出血病病毒可引起牛、綿羊等家畜及白尾鹿(Ofocw7e^v^g/m'"m^)、糜、大角羚羊等多種馴養(yǎng)和野生反芻動物感染。美國已從白尾鹿、黑尾鹿、綿羊、山羊、牛、野牛及庫蠓體內分離到了病毒。以白尾鹿最為嚴重，臨床特征為體溫短暫升高，呈休克癥狀，粘膜和漿膜出血，于昏迷狀態(tài)下死亡。病變呈廣泛性充血、出血、嚴重水腫和血管壞死，有時出現腹膜水腫。綿羊EHD與藍舌病(bluetonguevirus,BTV)相似，死亡率230%，牛感染后可以檢測到抗體，但不表現癥狀，美國牛群中EHD病毒的血清陽性相當普遍。該病在日本、中國臺灣、朝鮮都有報道，臨床以發(fā)熱、精神沉郁、吞咽困難、消瘦等為特征，有時還導致懷孕牛流產、死產。目前EHD共發(fā)現8個血清型，美國大多為EHDV-2、EHDV-1，澳大利亞有EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等6個血清型。尼日利亞]分離到EHDV-3、EHDV-4。另外，印度尼西亞、中國臺灣省、馬來西亞、菲律賓、圭亞等地都分離到EHDV。本病目前尚無有效疫苗和治療措施，控制和消滅EHD必須花費大量的人力物力，出口貿易也因此受限，給EHDV流行的國家?guī)砗艽蟮慕洕鷵p失。建立基于單克隆抗體的鹿流行性出血病競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(c-ELISA)方法，是動物檢疫中急需解決的關鍵技術問題。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的是提供這種單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供這種單克隆抗體的用途。本發(fā)明所述的鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體是一種免疫球蛋白-IgG，由重鏈和輕鏈構成，是由經過鹿流行性出血熱病毒免疫BALB/c小鼠的脾淋巴細胞分化形成的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)通過細胞融合后獲得的雜交瘤細胞分泌產生的、只針對鹿流行性出血病病毒特異性抗原決定簇的抗體。本發(fā)明所述的鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體是采用雜交瘤細胞技術，用純化的EHDV免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)進行細胞融合，用HAT選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，分別用純化的EHDV抗原和正常倉鼠腎傳代細胞(BHK21)對照抗原包被的間接ELISA進行篩選，經有限稀釋法篩選克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗特異性EHDV的單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細胞株，并制備EHDV的McAb小鼠腹水，制備而成的抗EHDV的單克隆抗體。本發(fā)明所涉及的鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體的制備方法是利用細胞工程、抗體工程和免疫學技術，獲得分泌抗EHDV的單克隆抗體的細胞株，通過同品系的小鼠誘導腹水，制備抗EHDV的單克隆抗體。由以下步驟組成一、鹿流行性出血熱病毒的純化；EHDV接種BHK-21細胞，出現細胞病變后收獲病毒，反復凍融3次，二次離心將細胞碎片和病毒液分開，采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心3h，以純化EHDV病毒；二、用提純的鹿流行性出血熱病毒抗原免疫BALB/c鼠；每隔2周免疫1次，共免疫3次，純化的EHDV病毒注射劑量分別100昭、100ng和200ng;三、取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞在50X聚乙二醇(MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗EHDV的陽性孔；四、用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗EHDV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞；五、挑選12周齡BALB/C小鼠，按51(^105個雜交瘤細胞注射入BALB/c鼠腹腔制備單克隆抗體腹水；六、用間接ELISA所述的方法鑒定制備單克隆抗體僅與EHDV有特異性免疫反應，而與其它相關病毒沒有任何免疫反應。所述的鹿流行性出血熱病毒的純化將BHK21細胞培養(yǎng)至單層后接種EHDV，37。C反應lh。加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞病變達70%以上收獲病毒。將收獲好的病毒液反復凍融3次，經8000r/min離心30min，取上清液；以28000r/min4'C超速離心3h，取沉淀，PBS重懸；再將重懸液經20%、60%蔗糖溶液梯度離心，28000r/min離心3h，收獲中間病毒帶，然后超聲波裂解，紫外分光光度計測病毒蛋白含量，用作動物免疫抗原和ELISA包被抗原。將純化后的病毒稀釋到2g/L，-S(TC保存?zhèn)溆谩Ｋ龅挠锰峒兊穆沽餍行猿鲅獰岵《久庖連ALB/c鼠首次免疫后，每隔2周免疫1次，共免疫3次，注射劑量分別100jug、100pg和20(^g。首免時加等體積弗氏完全佐劑乳化，二免和三免時加等體積弗氏不完全佐劑乳化。三免后第15d，斷尾采血分離血清，用間接ELISA檢測抗EHDV血清抗體效價。于融合前3d，通過尾靜脈注射EHDV強化免疫一次，劑量為IOO嗎。所述的間接ELISA篩選陽性克隆分別用BHK細胞增殖的EHD病毒和BHK細胞抗原建立間接ELISA。首先用DU800核酸蛋白分析儀測定各種抗原的蛋白濃度。再用方陣滴定法確定最佳包被抗原濃度，并對包被時間及溫度進行優(yōu)化。2種ELISA方法分別命名為EHDV-ELISA和BHK-ELISA，這2種ELISA方法用于對雜交瘤細胞培養(yǎng)上清進行篩選，以獲得抗EHDV的單克隆抗體。所述的雜交瘤細胞注射入BALB/c鼠腹腔制備單克隆抗體腹水:取12周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7d后腹腔注入510xl()S個雜交瘤細胞，注射后710d可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000r/min離心5min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水，測定抗體效價，分裝后-8(TC凍存?zhèn)溆?。本發(fā)明的抗EHDV單克隆抗體的用途是將其用于制備可特異性檢測鹿流行性出血病抗體的競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(c-ELISA)。本發(fā)明涉及鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體在制備可特異性檢測鹿流行性出血病抗體的競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(c-ELISA)中的應用。本發(fā)明提供的EHDV單克隆抗體的特異性強，腹水效價高，親和力高，制備方法簡單，EHDV單克隆抗體可以用于EHDV抗體的檢測方法，為我國鹿流行性出血病的防控提供重要的技術手段。由于該單克隆抗體只針對EHDV的單一抗原位點，因此具有高特異性和高親和力的特點，在鹿流行性出血病的血清學診斷中具有重要應用價值。本發(fā)明提供了一種簡便易行的方法制備和純化EHDV的單克隆抗體，更為重要的是該方法制備的單克隆抗體可以有多種用途，可為EHDV的診斷、檢疫、檢測和流行病學調査提供有力的技術和產品支持。具體實施例方式1、病毒的純化和免疫原的制備BHK-21細胞長成單層后接種EHDV，37。C反應lh。加入無血清的基礎培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，23d后細胞病變(CPE)達75n/。以上時，收獲病毒。將收獲的病毒液反復凍融3次，以8000r/min離心30min，取上清液。以28000r/min4'C超速離心3h。沉淀用1/100原體積的PBS溶解，然后采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度20000r/min4'C超速離心3h，收獲提純的病毒條帶作為免疫抗原，用DU800核酸蛋白分析儀測定經差速離心和蔗糖密度梯度離心純化的的EHDV蛋白含量為2g/L，分裝后置-2(TC保存?zhèn)溆谩?、BALB/C小鼠免疫選擇812周齡的純系雌性BALB/c小鼠。用純化的EHDV作為免疫抗原免疫BALB/c小鼠，將純化后EHDV與等體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化，充分混勻后經背皮下注射健康BALB/c小鼠，0,2mL/只；首免后第2周和第4周分別用EHDV加等體積弗氏不完全佐齊U(FIA)進行二免和三免；三次免疫的抗原注射劑量分別IOO昭、100昭和200嗎。三免后2周，斷尾取血并分離血清，用間接ELISA檢測血清效價，待效價達到212以上再以不加佐劑的抗原(0.2mL/只)進行加強免疫一次，劑量為IOO叫，即可進行細胞融合。3、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)將計數后的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞按1:510的比例混合，500r/min離心10min，去上清，輕輕的彈離心管底部使細胞分散，緩慢地向離心管中加入lmL預熱的50X聚乙二醇(MW4000)融合劑，靜置3min，在5min向離心管中加入30mL1640培養(yǎng)基，終止融合作用。500r/min離心10min，去上清，加入適量的含HAT的選擇性培養(yǎng)基，懸浮融合后的細胞，將融合細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100pL，每孔再補加100upL用HAT培養(yǎng)液洗取的小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞。將細胞板置于含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，于37'C進行培養(yǎng)，每隔3d，用每孔半量HAT選擇性培養(yǎng)液換液一次。710d后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基。經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。4、陽性雜交瘤細胞的篩選及其克隆當觀察到培養(yǎng)孔中出現雜交細胞集落時(約7-8d)，取培養(yǎng)上清液，用EHDV-ELISA和BHK-ELISA同時進行篩選。選取EHDV-ELISA檢測為陽性，且BHK-ELISA檢測為陰性的孔，連續(xù)3d進行檢測。取可以穩(wěn)定分泌EHDV單抗的陽性孔進行克隆。采用有限稀釋法克隆陽性雜交瘤細胞提前l(fā)d制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞；將計數后的待克隆雜交瘤細胞懸液用含20%血清的HT培養(yǎng)基準確地進行系列稀釋，直至每mL含10個細胞，按每孔接種O.lmL細胞懸液，即每孔含l個細胞；37°C、7.5%CO2濕潤培養(yǎng)710d，出現肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清用ELISA作抗體檢測；每次克隆均隨機挑選30個孔進行三重ELSIA檢測，直至克隆孔100%為陽性，選取抗體效價高的單克隆孔，將細胞擴大培養(yǎng)并凍存?zhèn)溆茫⑶疫B續(xù)凍存-復蘇數次，觀察細胞分泌抗的穩(wěn)定性。5、單克隆抗體的特異性檢測用EHDV-ELISA和BHK-ELISA同時進行陽性克隆的檢測，選取EHDV-ELISA檢測為陽性，且BHK-ELISA檢測為陰性的孔。同時將陽性孔培養(yǎng)上清分別與用純化的BTV、VSV、AKV、PPRV建立的間接ELISA進行反應，從而評價單抗的特異性。進行單克隆抗體特異性檢測的間接ELISA操作步驟:分別用純化的EHDV、BTVV、AKV、VSV、PPRV作為包被抗原，經方陣滴定試驗，確定抗原最佳包被濃度、待檢抗體最佳工作濃度及判定標準。(l)包被用包被液將純化的病毒抗原稀釋將最佳濃度，包被96孔ELISA板，50piL/孔，于4。C過夜。(2)封閉棄去96孔ELISA板中包被液，用0.01mol/LpH7.4含0.05%Tween20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3遍，向每孔中加入200pL3%牛血清白蛋白(BSA)溶液，于37'C,反應2h。(3)棄去封閉液，用PBST洗3遍，可以用于檢測或于4'C保存?zhèn)溆谩?4)向ELISA板中加入待檢測的上清液、或陽性血清、陰性血清，5(HiL/L，37°C，反應30min。用PBST洗3遍。(5)加入1:5000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，50hL/孔，37°C，反應30min。用PBST洗3遍。(6)加入底物(TMB+H202)50pL/孔，避光反應10min。(7)加入2mol/LH2S04溶液，50^iL/孔，終止反應。(8)于酶標儀讀取00450值。經方陣試驗測得最佳的抗原稀釋包被濃度為10ug/mL，4t反應過夜。用30g/LBSA溶液于37'C封閉2h效果較好，一抗(單抗)和二抗(羊抗鼠IgG-HRP)的作用最佳時間均為30min，底物顯色時間為15min。用EHDV、其它相關病毒和BHK細胞抗原分別建立間接ELISA方法來檢測2株單抗的特異性。2株單抗(1a5和8h6)細胞培養(yǎng)上清液與EHDV-ELISA反應時呈陽性，而與用其它病毒和BHK細胞抗原建立的ELISA反應時均為陰性。表明2株單抗具有良好的特異性。2株雜交瘤細胞接種BALB/c小鼠后均產生腹水，經多次傳代、凍存、復蘇，雜交瘤細胞生長狀態(tài)良好，分泌單抗性能穩(wěn)定。用間接ELISA方法測定2株單抗與BTV、VSV、AKV、PPRV、BHK的交叉反應性(表1)。結果顯示，2株單抗與BTV、VSV、AKV、PPRV、BHK均不發(fā)生反應，證實2株單抗對EHDV具有良好的特異性反應，為針對EHDV的特異性單克隆抗體。表12株EHDV單抗特異性反應<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>6、單克隆抗體腹水制備及純化用常規(guī)方法將篩選的陽性雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)，選擇與雜交瘤細胞同源同系的小鼠誘導腹水法大量制備單克隆抗體。選取12周齡以上的BALB/c雌性小鼠，腹腔注射無菌液體石蠟，0.5mL/只。一周后，取處于對數生長期的雜交瘤細胞，進行腹腔注射，劑量為5"06細胞/只。約10d后，待小鼠腹部明顯突起時，即可用16號針頭采集腹水，一般可連續(xù)采23次，通常每只小鼠可采310mL腹水，將腹水以2000r/min離心5min，除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-S(TC凍存?zhèn)溆?，或凍干保存。采用硫酸銨沉淀法純化McAb:吸取lOmL處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液(500g硫酸銨加入500mL蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/LNaOH調pH至7.8)5.0mL;繼續(xù)緩慢攪拌30min;10000r/min離心15min;棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30min，同法離心；重復前一步12次；沉淀物溶于1.5mLPBS(0.01mol/LPH7.2)緩沖液中。用柱層析或透析法進行飽和度硫酸銨粗提物的脫鹽。柱層析法是將鹽析樣品過S印hadexG-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每minlmL。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2。/oNaHC03，lmmol/LEDTA溶液中煮10min，用蒸餾水清洗透析袋內外表面，再用蒸餾水煮透析袋10min，冷至室溫即可使用(并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4。C保存?zhèn)溆?。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析(4'C)1224h，其間更換5次透析液，用萘氏試劑(碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50mL，待溶解后，再加20。/。NaOH50mL)檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。用蛋白質測定儀測定蛋白質含量(Pr)(mg/mL)=(1.45xOD280-0.74xOD260)x稀釋倍數；或(Pr)=0028(^稀釋倍數/1.3。測得純化腹水IgG的含量為1.卯4g/L。分裝凍存?zhèn)溆谩?、單克隆抗體的亞類鑒定、細胞培養(yǎng)上清和腹水效價測定利用鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對2株單抗進行亞型鑒定，1A5和8H6分別均為IgGl，2株單抗輕鏈均為K鏈。單克隆抗體培養(yǎng)上清及純化腹水效價測定將篩選為陽性孔的細胞培養(yǎng)上清及對應腹水進行系列稀釋后，用EHDV-ELISA法測定陽性孔細胞培養(yǎng)上清的效價和腹水效價。2株單抗(1A5和8H6)的上清ELISA效價分別均為h256，腹水ELISA效價分別為1:1024000和1:2048000。結果見表2。用2株篩選后的雜交瘤細胞分別注射小鼠制備腹水，進行系列稀釋，用間接ELISA測定OD45(^值，效價結果見表2。表2雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及腹水抗體效價單抗編號1A58H6培養(yǎng)上清1:2561:512腹水1:10240001:20480008、雜交瘤細胞系的穩(wěn)定性試驗雜交瘤細胞株連續(xù)培養(yǎng)及凍存復蘇細胞，分別隨機挑選50孔檢測其抗體效價，鑒定2株雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性(表3)，結果ELISA檢測抗體效價較一致，表明雜交瘤細胞1A5和8H6均能穩(wěn)定分泌抗EHDV抗體。表3雜交瘤細胞穩(wěn)定性檢測A第一次亞克隆第二次亞克隆第三次亞克隆單抗編號(陽性孔數/檢測孔數)(陽性孔數/檢測孔數)(陽性孔數/檢測孔數)40/5050/5050/50娜39/5049/5050/509、單抗相對親和力測定純化的單克隆抗體，經DU800核酸蛋白分析儀測定OD260咖和OD280nm值，根據公式上述計算起始濃度，倍比稀釋后，按間接ELISA，測定反應曲線，以曲線上的單克隆抗體50%飽和OD45Qnm值時抗體的濃度，計算其摩爾濃度的倒數，即為相對親和力常數。經過親和力實驗，計算出1A5和8H6的親和力分常數別為6.24xl()6mol/L和1.65xI07mol/L。10、鹿流行性出血病c-ELISA方法及應用于臨床樣品的檢測酶標板抗原包被，50nL/孔，4°C過夜，PBST洗三次；加血清(被檢、陽性、陰性)50pL/孔，37°C濕盒感作60min;加入McAb50pL/孔，37°C濕盒感作30min;加入兔抗鼠IgG—HRP50pL/孔，37°C感作30min;PBST洗五次；加入底物液,100nL/孔，37°C暗盒中顯色20min，加入終止液50pL/孔，于酶標儀450nm下測定OD值。按下列公式計算抑制百分比(PI):被檢血清平均OD值抑制百分比(PI)%=100--X100陰性血清平均OD值應用EHDV特異性單克隆抗體建立的c-ELISA方法，在同樣條件下，用鹿流行性出血病、藍舌病、赤羽病、水泡性口炎、小反芻獸疫陽性血清進行c-ELISA。所有被檢血清均作1:IO稀釋，鹿流行性出血病(EHDVl-8型)標準陽性血清和經瓊脂免疫擴散試驗(AGID)確認的被檢陽性血清的抑制百分比均在50%以上，其它血清的抑制百分比均在45%以下。上述具體實施例的實驗數據表明，本發(fā)明的一種抗鹿流行性出血病病毒的特異性單克隆抗體制備方法制備的單克隆抗體，不僅特異性強，敏感性高，親和力好，效價高，而且穩(wěn)定，特別適合用于鹿流行性出血病c-ELISA抗體檢測方法，以用于鹿流行性出血病的快速診斷、檢測、檢疫和流行病學調查。權利要求1、一種鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體，其特征在于是一種免疫球蛋白-IgG，由重鏈和輕鏈構成，是由經過鹿流行性出血熱病毒免疫BALB/c小鼠的脾淋巴細胞分化形成的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)通過細胞融合后獲得的雜交瘤細胞分泌產生的、只針對鹿流行性出血病病毒特異性抗原決定簇的抗體。2、如權利要求1所述的鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體的制備方法，其特征在于由以下步驟組成一、鹿流行性出血熱病毒的純化；EHDV接種BHK-21細胞，出現細胞病變后收獲病毒，反復凍融3次，二次離心將細胞碎片和病毒液分開，采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心3h，以純化EHDV病毒；二、用提純的鹿流行性出血熱病毒抗原免疫BALB/c鼠；每隔2周免疫1次，共免疫3次，純化的EHDV病毒注射劑量分別IOO昭、100昭和200ng;三、取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇(MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗EHDV的陽性孔；四、用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗EHDV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞；五、挑選12周齡BALB/C小鼠，按510xl()S個雜交瘤細胞注射入BALB/c鼠腹腔制備單克隆抗體腹水；六、用間接ELISA所述的方法鑒定制備單克隆抗體僅與EHDV有特異性免疫反應，而與其它相關病毒沒有任何免疫反應。3、權利要求1所述的鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體用于鹿流行性出血熱病的診斷、檢疫、檢測和流行病學調查。4、如權利要求3所述的鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體在制備可特異性檢測鹿流行性出血病抗體的競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(c-ELISA)中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術領域：
。本發(fā)明所述的鹿流行性出血熱病毒單克隆抗體是一種免疫球蛋白-IgG，由重鏈和輕鏈構成，是由經過鹿流行性出血熱病毒免疫BALB/c小鼠的脾淋巴細胞分化形成的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)通過細胞融合后獲得的雜交瘤細胞分泌產生的、只針對鹿流行性出血病病毒特異性抗原決定簇的抗體。本發(fā)明提供的單克隆抗體的特異性強，腹水效價高，親和力高，制備方法簡單，可以用于EHDV抗體的檢測方法，由于該單克隆抗體只針對EHDV的單一抗原位點，在鹿流行性出血病的血清學診斷中具有重要應用價值?？蔀镋HDV的診斷、檢疫、檢測和流行病學調查提供有力的技術和產品支持。文檔編號C12P21/08GK101597333SQ20091009475公開日2009年12月9日申請日期2009年7月23日優(yōu)先權日2009年7月23日發(fā)明者盧體康,呂建強,曹琛福,曾少靈,楊俊興,林慶燕,秦智鋒,花群義,俊董,阮周曦,兵陳申請人:花群義