專(zhuān)利名稱(chēng)：：藍(lán)舌病病毒單克隆抗體及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是有關(guān)藍(lán)舌病病毒VP7蛋白單克隆抗體，以及制備方法和用途。技術(shù)背景藍(lán)舌病(BIuetonguedisease,BLU)是由呼腸孤病毒科(reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Obivirusgenus)的藍(lán)舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)引起的一種烈性動(dòng)物傳染病，由庫(kù)蠓傳播，主要危害綿羊、山羊、牛等家畜，并在世界范圍內(nèi)廣泛流行，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Worldorganisationforanimalhealth,O正)將BLU列為重要?jiǎng)游飩魅静?。在很多?guó)家動(dòng)物貿(mào)易協(xié)定中，BLU是必須進(jìn)行檢疫的傳染病之一。近年來(lái)，隨著氣候變暖，BLU在歐洲許多國(guó)家的發(fā)病率增加，嚴(yán)重影響著國(guó)際動(dòng)物貿(mào)易。BTV共有24個(gè)血清型，BTV基因組含有10個(gè)雙鏈RNA片段(dsRNA)，由19218bp組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3A)，7種結(jié)構(gòu)蛋白的4種形成雙層蛋白衣殼，外殼主要由VP2和VP5構(gòu)成，而內(nèi)殼主要由VP3和VP7構(gòu)成。VP2是病毒型特異性抗原和血凝蛋白，誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，還與病毒的毒力和細(xì)胞吸附作用有關(guān)。VP5也與中和抗體的產(chǎn)生和病毒毒力有關(guān)。VP7是核芯衣殼表面殼粒的主要成分，約占病毒總蛋白的1/3，是病毒可溶性群特異性抗原。在BLU檢測(cè)方法中，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AgarGelImmunoDiffiision，AGID)因其操作簡(jiǎn)便、成本低而在世界范圍內(nèi)被廣泛推廣應(yīng)用，也是迄今O正推薦使用的方法之一，但該方法使用的抗原與相關(guān)病毒如鹿流行性出血病病毒(Epizootichemorrhagicdiseasevirusofdeer，EHDV)存在一定的交叉反應(yīng)性，所以AGID檢測(cè)的特異性較差。競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(c-ELISA)可將藍(lán)舌病與相關(guān)病毒病區(qū)別，而雙抗體夾心法ELISA可直接進(jìn)行病毒抗原的檢測(cè)。因此，制備BTVVP7特異性單克隆抗體，不僅對(duì)研究BTVVP7蛋白的功能有重大意義，而且對(duì)建立特異、敏感、快速的BTV免疫血清學(xué)檢測(cè)方法(如ELISA)也有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗藍(lán)舌病病毒的藍(lán)舌病病毒單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的是提供這種單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供這種單克隆抗體的用途。本發(fā)明所述的藍(lán)舌病病毒單克隆抗體是采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，用純化的BTV免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行細(xì)胞融合，用HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，分別用純化的BTV抗原、基因工程表達(dá)的BTVVP7蛋白抗原和正常倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞(BHK21)對(duì)照抗原包被的間接ELISA進(jìn)行篩選，經(jīng)有限稀釋法篩選克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗特異性BTVVP7蛋白的單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞株，并制備BTVVP7蛋白的McAb小鼠腹水，制備而成的抗BTVVP7蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明所述的藍(lán)舌病病毒單克隆抗體是由小鼠免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的、只針對(duì)藍(lán)舌病病毒VP7蛋白特異性抗原決定簇的抗體，它是一種免疫球蛋白-IgG，由重鏈和輕鏈構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)相同，成分均一，特異性強(qiáng)，生物活性高。本發(fā)明所述的藍(lán)舌病病毒單克隆抗體的制備方法由以下步驟組成一、藍(lán)舌病病毒的純化；BTV接種BHK-21細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞病變后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，二次離心將細(xì)胞碎片和病毒液分開(kāi)，采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心3h，以純化BTV病毒；二、用提純的藍(lán)舌病病毒免疫BALB/c鼠；每隔2周免疫1次，共免疫3次，純化的BTV病毒注射劑量分別100嗎、100昭和200嗎；三、取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞在50X聚乙二醇(MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA方法檢測(cè)分泌抗BTVVP7蛋白的陽(yáng)性孔；四、用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗BTVVP7蛋白的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；五、雜交瘤細(xì)胞注射入BALB/c鼠腹腔制備單抗腹水，取12周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7d后腹腔注入510xl()S個(gè)雜交瘤細(xì)胞；六、用間接ELISA所述的方法鑒定制備單克隆抗體僅與BTV病毒的VP7蛋白有特異性免疫反應(yīng)，而與其它相關(guān)病毒沒(méi)有任何免疫反應(yīng)。所述的藍(lán)舌病病毒的純化BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種BTV，37。C反應(yīng)lh。加入無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，23d后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)75%以上時(shí)，收獲病毒。將收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，以8000r/min離心30min，取上清液。以28000r/min4。C超速離心3h。沉淀用1/100原體積的PBS溶解，然后采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度20000r/min4'C超速離心3h，收獲提純的病毒條帶作為免疫抗原，用DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定蛋白含量，-20°。保存?zhèn)溆?。所述的用提純的藍(lán)舌病病毒免疫BALB/c鼠首次免疫后，每隔2周免疫1次，共免疫3次，注射劑量分別100嗎、100嗎和200嗎。首免時(shí)加等體積弗氏完全佐劑乳化，二免和三免時(shí)加等體積弗氏不完全佐劑乳化。三免后第15d，斷尾采血分離血清，用間接ELISA檢測(cè)抗BTV血清抗體效價(jià)。于融合前3d，通過(guò)尾靜脈注射BTV強(qiáng)化免疫一次，劑量為100pg。所述的間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆分別用BHK細(xì)胞增殖的BTV病毒、VP7基因工程表達(dá)產(chǎn)物和BHK細(xì)胞建立間接ELISA。首先用DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定各種抗原的蛋白濃度。再用方陣滴定法確定最佳包被抗原濃度，并對(duì)包被時(shí)間及溫度進(jìn)行優(yōu)化。3種ELISA方法分別命名為BTV-ELISA、BTVVP7-ELISA和BHK-ELISA，這3種ELISA方法用于對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選，以獲得抗VP7的單克隆抗體。所述的雜交瘤細(xì)胞注射入BALB/c鼠腹腔制備單抗腹水:取12周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml降植垸，7d后腹腔注入510xl()S個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后710d可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000r/min離心5min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水，測(cè)定抗體效價(jià)，分裝后-8(TC凍存?zhèn)溆?。本發(fā)明涉及藍(lán)舌病病毒單克隆抗體在制備可特異性檢測(cè)藍(lán)舌病抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(c-ELISA)中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及藍(lán)舌病病毒單克隆抗體在檢測(cè)瑤^舌病抗原的雙抗體夾心ELISA中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的BTVVP7蛋白單克隆抗體的特異性強(qiáng)，腹水效價(jià)高，親和力高，制備方法簡(jiǎn)單，BTVVP7蛋白單克隆抗體可以用于BTV抗體和抗原的檢測(cè)方法，為我國(guó)藍(lán)舌病的防控提供重要的技術(shù)手段。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)還在于提供一種簡(jiǎn)便易行的方法制備和純化BTVVP7蛋白的單克隆抗體，更為重要的是該方法制備的單克隆抗體可以有多種用途，可為BTV的診斷、檢疫、檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)査提供有力的技術(shù)和產(chǎn)品支持。具體實(shí)施方式實(shí)施例1、病毒的純化和免疫原的制備BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種BTV，37。C反應(yīng)lh。加入無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，23d后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)75°/。以上時(shí)，收獲病毒。將收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，以8000r/min離心30min，取上清液。以28000r/min4。C超速離心3h。沉淀用1/100原體積的PBS溶解，然后采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度20000r/min4'C超速離心3h，收獲提純的病毒條帶作為免疫抗原，用DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心純化的藍(lán)舌病病毒蛋白含量為3.2688化，分裝后置-2(TC保存?zhèn)溆谩?、BTVVP7蛋白表達(dá)抗原的制備根據(jù)GenBank上公開(kāi)發(fā)表的BTVVP7基因序列，設(shè)計(jì)、合成一對(duì)引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度為1044bp。引物序列如下VP7-P1:5,-GACACTATCGCTGACAGAGCACT-3，VP7-P2:5'-CACATAGGCGGCGCGTGCAATAG-3，，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測(cè)?；厥占兓腜CR目的片段插入pBAD/ThioTOPO，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)PCR和DNA測(cè)序鑒定為含有BTVVP7基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LMG194感受態(tài)細(xì)菌。按pBAD/ThioTOPO載體試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的蛋白的阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，用pBAD/Thio載體作為陽(yáng)性表達(dá)對(duì)照，無(wú)載體的LMG194細(xì)胞作為陰性對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行表達(dá)條件的篩選，經(jīng)SDS-PAGE、ELISA確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。擴(kuò)大培養(yǎng)，收集表達(dá)菌體，用細(xì)胞壓力破碎儀進(jìn)行處理，離心后取上清，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化的BTVVP7蛋白可作為c-ELISA和間接ELISA的包被抗原(VP7-ELISA)。3、BALB/C小鼠免疫選擇8-12周齡的純系雌性BALB/c小鼠。用純化的BTV作為免疫抗原免疫BALB/c小鼠，將純化后BTV與等體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化，充分混勻后經(jīng)背部皮下注射健康BALB/c小鼠，0.2mL/只；首免后第2周和第4周分別用BTV加等體積弗氏不完全佐劑(FIA)進(jìn)行二免和三免；三次免疫的抗原注射劑量分別10(Hig、100嗎和200嗎。三免后2周，斷尾取血并分離血清，用間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，待效價(jià)達(dá)到212以上再以不加佐劑的抗原(0.211117只)進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，劑量為100嗎，即可進(jìn)行細(xì)胞融合。4、小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法如下細(xì)胞融合前，應(yīng)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞維持在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中傳代1周。于融合前4836h，將骨髓細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；融合當(dāng)d，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50mL離心管或融合管內(nèi)；1000r/min離心510min，棄去上清；加入30mL1640培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次，然后將細(xì)胞重懸浮于10mL1640培養(yǎng)基，混勻；取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用，細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，取細(xì)胞懸液0.1mL加入0.9mL臺(tái)盼藍(lán)染液中，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為每mL細(xì)胞數(shù)-4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)xl()S/4;或每mL細(xì)胞數(shù)-5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù)x106/2。5、小鼠免疫脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照血清。同時(shí)通過(guò)頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5min,在超凈工作中眼科剪和鑷子掀開(kāi)左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，用無(wú)菌手術(shù)剪剪開(kāi)腹膜，取出脾臟置于已盛有10mL1640培養(yǎng)液的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車(chē)Y(jié)締組織。將脾臟移入另一盛有10mL1640培養(yǎng)液的平皿中，用彎頭鑷子或裝在lmL注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟(也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟)，使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心510min，用1640培養(yǎng)液離心洗滌12次，然后將細(xì)胞重懸于10mL1640培養(yǎng)液混勻，取上述懸液，加臺(tái)酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。每只小鼠可得lxl()82.5xl08個(gè)脾細(xì)胞。6、詞養(yǎng)細(xì)胞的制備以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞融合前12d制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞，使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層飼養(yǎng)細(xì)胞層。其制備方法如下按上述釆小鼠脾細(xì)胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10mL不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1min，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。3000r/min離心510min，棄上清。先用5mLHAT培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2xl05/mL，加入96孔板，每孔O.lmL(相當(dāng)于2滴)，然后置37°C5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通常96孔培養(yǎng)板每孔需2><104個(gè)細(xì)胞，24孔板每孔需105細(xì)胞，每只小鼠可得35"06個(gè)細(xì)胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養(yǎng)細(xì)胞。7、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng).將計(jì)數(shù)后的脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按1:510的比例混合，500r/min離心10min，去上清，輕輕的彈離心管底部使細(xì)胞分散，緩慢地向離心管中加入lmL預(yù)熱的50X聚乙二醇(MW4000)融合劑，靜置3min，在5min向離心管中加入30mL1640培養(yǎng)基，終止融合作用。500r/min離心10min，去上清，加入適量的含HAT的選擇性培養(yǎng)基，懸浮融合后的細(xì)胞，將融合細(xì)胞加入己有詞養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100pL，每孔再補(bǔ)加100pL用HAT培養(yǎng)液。將細(xì)胞板置于含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，于37'C進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3d,用每孔半量HAT選擇性培養(yǎng)液換液一次。710d后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基。經(jīng)常觀(guān)察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清供抗體檢測(cè)。8、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選及其克隆當(dāng)觀(guān)察到培養(yǎng)孔中出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落時(shí)(約7-8d)，取培養(yǎng)上清液，用BTV-ELISA、VP7-ELISA和BHK-ELISA同時(shí)進(jìn)行篩選。選取BTV-ELISA和VP7-ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性，且BHK-ELISA檢測(cè)為陰性的孔，連續(xù)3d進(jìn)行檢測(cè)。取可以穩(wěn)定分泌VP7單抗的陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆。采用有限稀釋法克隆陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞提前l(fā)d制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞；將計(jì)數(shù)后的待克隆雜交瘤細(xì)胞懸液用含20%血清的HT培養(yǎng)基準(zhǔn)確地進(jìn)行系列稀釋?zhuān)敝撩縨L含10個(gè)細(xì)胞，按每孔接種O.lmL細(xì)胞懸液，即每孔含l個(gè)細(xì)胞；37°C、7.5%C02濕潤(rùn)培養(yǎng)710d，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆即可檢測(cè)抗體；在倒置顯微鏡下觀(guān)察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔，取上清用ELISA作抗體檢測(cè)；每次克隆均隨機(jī)挑選30個(gè)孔進(jìn)行三重ELSIA檢測(cè)，直至克隆孔100%為陽(yáng)性，選取抗體效價(jià)高的單克隆抗體陽(yáng)性孔，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存?zhèn)溆?，并且連續(xù)凍存-復(fù)蘇數(shù)次，觀(guān)察細(xì)胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性。9、單克隆抗體的特異性檢測(cè)用BTV-ELISA、VP7-ELISA和BHK-ELISA同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性克隆的檢測(cè)，選取BTV-ELISA和VP7-ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性，且BHK-ELISA檢測(cè)為陰性的孔。同時(shí)將陽(yáng)性孔培養(yǎng)上清分別與用純化的EHDV、VSV、AKV、PPRV建立的間接ELISA進(jìn)行反應(yīng)，從而評(píng)價(jià)單克隆抗體的特異性。進(jìn)行單克隆抗體特異性檢測(cè)的間接ELISA操作步驟分別用純化的BTV、EHDV、AKV、VSV、PPRV作為包被抗原，經(jīng)方陣滴定試驗(yàn)，確定抗原最佳包被濃度、待檢抗體和酶結(jié)合物的最佳工作濃度及判定標(biāo)準(zhǔn)。(1)包被用包被液將純化的病毒抗原稀釋?zhuān)?6孔ELISA板，50nL/孔，于4。C過(guò)夜。(2)封閉棄去96孔ELISA板中包被液，用0.01mol/LpH7.4含0.05%Tween20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3遍，向每孔中加入200nL3%牛血清白蛋白(BSA)溶液，于37。C，反應(yīng)2小時(shí)。(3)棄去封閉液，用PBST洗3遍，可以用于檢測(cè)或于4'C保存?zhèn)溆谩?4)向ELISA板中加入待檢測(cè)的上清液、或陽(yáng)性血清、陰性血清，50pL/L，37°C，反應(yīng)30min。用PBST洗3遍。(5)加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，50pL/孔，37°C，反應(yīng)30min。用PBST洗3遍。(6)加入底物(TMB+H202)50pL/孔，避光反應(yīng)10min。(7)加入2mol/LH2S04溶液，50nL/孔，終止反應(yīng)。(8)于酶標(biāo)儀讀取0045()值。經(jīng)方陣試驗(yàn)測(cè)得最佳的包被抗原稀釋濃度為5ug/mL，4。C反應(yīng)過(guò)夜。用30g/LBSA溶液于37'C封閉2h效果較好，一抗(單抗)和二抗(羊抗鼠IgG-HRP)的作用最佳時(shí)間均為30min，底物顯色時(shí)間為15min。用BTV、其它相關(guān)病毒和BHK細(xì)胞分別建立間接ELISA方法來(lái)檢測(cè)3株單抗的特異性。3株單抗(1F5、4E5和6A1)細(xì)胞培養(yǎng)上清與BTV-ELISA反應(yīng)時(shí)呈陽(yáng)性，而與用其它病毒和BHK建立的ELISA反應(yīng)時(shí)均為陰性。3株雜交瘤細(xì)胞接種BALB/c小鼠后均產(chǎn)生腹水，經(jīng)多次傳代、凍存、復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分泌單抗性能穩(wěn)定。3株單克隆抗體(1F5、4E5禾Q6A1)的腹水分別與BTV(血清10、1、3、5、8、11、12、17、22型)、BTV陽(yáng)VP7和EHDV(血清l、2型)、VSV、PPRV、AKV包被的ELISA板反應(yīng)，表明3株單抗與BTV和BTV-VP7包被ELISA板反應(yīng)時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性，與其他病毒包被ELISA板反應(yīng)時(shí)均為陰性，結(jié)果見(jiàn)表1。證實(shí)3株單抗可與BTVVP7蛋白特異性結(jié)合，為針對(duì)BTVVP7蛋白的特異性單克隆抗體。表l:單克隆抗體(腹水)特異性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>10、雜交瘤細(xì)胞的染色體分析在加秋水仙素前4836h將雜交瘤細(xì)胞傳代。秋水仙素處理在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素(100pg/mL，除菌，-20^保存)，使最終濃度為0.10.4昭/mL;繼續(xù)培養(yǎng)46h，然后吹打細(xì)胞，移入離心管中，1000r/minlOmin，棄上清。加入已預(yù)溫到37。C的0.075mol/LKCl溶液5mL，將沉淀細(xì)胞懸浮并混勻，37。C水浴1520min。向懸液中加入新配制的固定液(甲醇與冰醋酸3:l混合)lmL，混勻，然后1000r/min10min，棄去上清液；本步驟的目的是使細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成團(tuán)塊。加入固定液5mL，將細(xì)胞懸浮并混勻，室溫靜置2030min，然后1000r/min10min，棄去上清液；重復(fù)操作一次；其后加5mL固定液，將細(xì)胞懸浮并混勻，封上管口，置4。C過(guò)夜。取出離心管，1000r/min5min，輕輕吸去上清液，根據(jù)細(xì)胞壓積多少而留下0.5lmL固定液，將細(xì)胞懸浮并混勻后，吸取細(xì)胞懸液12滴，滴在剛從冰水中取出的載玻片上，用口吹散，并在火焰上通過(guò)數(shù)次，使細(xì)胞平鋪于載玻片上，自然干燥。用新配制的10。/。Giemsa染色液(Giemsa染液配方Giemsa粉0.5g，甘油33mL，556(TC保溫2h，加甲醇33mL混勻，保存于棕色瓶?jī)?nèi)作為原液；取原液1份，加l/15mol/LpH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液)染色1020min，然后用自來(lái)水洗去染液，自然干燥。鏡檢，選擇染色體分散好，無(wú)重疊，無(wú)失散的細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察分析。結(jié)果3株單抗(1F5、4E5和6A1)的染色體為104。11、單克隆抗體腹水制備及純化用常規(guī)方法將篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，選擇與雜交瘤細(xì)胞同源同系的小鼠誘導(dǎo)腹水法大量制備單克隆抗體。選取12周齡以上的BALB/c雌性小鼠，腹腔注射無(wú)菌液體石蠟，0.5mL/只。一周后，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行腹腔注射，劑量為5xl(^細(xì)胞/只。約10d后，待小鼠腹部明顯突起時(shí)，即可用16號(hào)針頭采集腹水，一般可連續(xù)采23次，通常每只小鼠可采310mL腹水，將腹水以2000r/min離心5min，除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測(cè)定抗體效價(jià)，分裝，-S(TC凍存?zhèn)溆?，或凍干保存。采用硫酸銨沉淀法純化McAb:吸取lOmL處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液(500g硫酸銨加入500mL蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過(guò)夜，析出的結(jié)晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/LNaOH調(diào)pH至7.8)5.0mL;繼續(xù)緩慢攪拌30min;10000r/min離心15min;棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30min，同法離心；重復(fù)前一步12次；沉淀物溶于1.5mLO.01mol/LpH7.2PBS緩沖液中。用柱層析或透析法進(jìn)行飽和度硫酸銨粗提物的脫鹽。柱層析法是將鹽析樣品過(guò)SephadexG-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每minlmL。第一個(gè)蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2n/。NaHC03，lmmol/LEDTA溶液中煮10min，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋10min，冷至室溫即可使用(并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4"保存?zhèn)溆?。將鹽析樣品裝入透析袋中，對(duì)50100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析(4'C)1224h，其間更換5次透析液，用萘氏試劑(碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50mL，待溶解后，再加2()Q/。NaOH50mL)檢測(cè)，直至透析外液無(wú)黃色物形成為止。用蛋白質(zhì)測(cè)定儀測(cè)定蛋白質(zhì)含量(Pr)(mg/mL)=(1.45><OD280-0.74xOD260)x稀釋倍數(shù)；或(Pr)OD28。x稀釋倍數(shù)/1.3。測(cè)得純化腹水IgG的含量為1.97g/L。分裝凍存?zhèn)溆谩?2、單克隆抗體的亞類(lèi)鑒定、細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水效價(jià)測(cè)定利用鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)3株單抗進(jìn)行亞型鑒定，1F5、4E5和6A1分別為IgGl、IgG2a和IgGl，3株單抗輕鏈均為K鏈。單克隆抗體培養(yǎng)上清及純化腹水效價(jià)測(cè)定將篩選為陽(yáng)性孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清及對(duì)應(yīng)腹水進(jìn)行系列稀釋后，用BTV-ELISA法測(cè)定陽(yáng)性孔細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)和腹水效價(jià)。3株單抗(1F5、4E5和6A1)的上清ELISA效價(jià)分別為1:512、1:256和l:512，腹水ELISA效價(jià)分別為1:512000、1:128000和l:512000。結(jié)果見(jiàn)表2。表2:3株單抗(1F5、4E5和6A1)的細(xì)胞上清液和腹水ELISA抗體效價(jià)雜交瘤細(xì)胞株編號(hào)1F54E56A1上清ELISA效價(jià)1:5121:2561:512腹水ELISA效價(jià)1:5120001:1280001:51200013、單抗相對(duì)親和力測(cè)定采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定McAb的親和力常數(shù)取優(yōu)化的最佳工作濃度的BTV純化抗原包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，O.lmL/孔，4'C過(guò)夜。洗滌后，加入封閉液，O.lmL/孔，37。C孵育60min。取已測(cè)定濃度的McAb，與系列倍比稀釋的抗原混合，4'C過(guò)夜，使反應(yīng)達(dá)到平衡。將感作平衡后的抗原抗體復(fù)合物加入到上述已用抗原包被并封閉過(guò)的聚苯乙烯酶標(biāo)板中，0.1mL/孔，37。C孵育60min。洗滌后，加入適宜濃度HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，0.1mL/L，37°C孵育30min。洗滌后，加入底物溶液(TMB底物)，O.lmL/孔，37。C避光顯色30min。用終止液終止反應(yīng)后，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸收率。按下列公式計(jì)算各McAb的親和常數(shù)(K):AO/(AO-A)=l+KaO(AO-無(wú)抗原時(shí)A值；A二采用不同濃度抗原時(shí)A值；&0=抗原總量；K=親和力常數(shù))。經(jīng)過(guò)親和力測(cè)定，計(jì)算出1F5、4E5和6A1的親和力分常數(shù)別為5.14xl07mol/L、6.71xl06mol/L和3.58xl07mol/L。14、HRP—抗BTVVP7蛋白單克隆抗體結(jié)合物的制備與鑒定用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記單抗，采用方法是過(guò)碘酸鈉法。標(biāo)記程序如下將5mgHRP溶于0.5mL0.1mol/LNaHCO3溶液中；加0.5mL10mmol/LNalO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2h。加0.75mLO.lmol/LNa2C03混勻。加入0.75mL純化單抗(15mg/mL)，混勻。稱(chēng)取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口墊玻璃棉的5mL注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，4'C過(guò)夜。用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20體積新鮮配制的5mg/mLNaBH4溶液，混勻，室溫作用30min;再加入3/20NaBH4溶液，混勻，室溫作用lh(或4'C過(guò)夜)。將交聯(lián)物過(guò)SephadexG200或Sepharose6B(2.6x50cm)層析純化，分管收集第一峰。測(cè)定克分子比值和標(biāo)記率，鑒定酶結(jié)合物質(zhì)量，用ELISA法測(cè)定酶活性和抗體活性。HRP抗體酶結(jié)合物的保存時(shí)，加入等量甘油后，小量分裝-2(TC存放。15、雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存是細(xì)胞在加血清和二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基中以一定的緩慢速度下降溫度(0°C-20°C，每分鐘下降1°C;-20°(:-40°。每分鐘下降2'C)，可在-196'C液氮或液氮蒸氣中長(zhǎng)期保存。雜交瘤細(xì)胞凍存時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期、健康而活力好的雜交瘤細(xì)胞離心，重新懸浮于預(yù)冷的凍存液(含1020%血清、510。/。DMSO的HT培養(yǎng)基，冰浴降溫至O'C左右)中，濃度為1()61(^左右/mL，分裝安瓶，每瓶lmL，置冰浴上；凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng)、凍存日期、批號(hào)等。凍存管封口后仍置冰浴上。將凍存管放入一帶收口繩的小布袋內(nèi)，布袋上標(biāo)明凍存號(hào)、細(xì)胞名稱(chēng)等，立即將布袋放入吸管筒內(nèi)，置-7(TC冰箱。24h后或過(guò)夜后從-7(TC冰箱取出吸管筒，將盛有細(xì)胞的布袋移入液氮罐；在布袋的線(xiàn)繩上作好標(biāo)記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細(xì)記錄。雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，速度要快，使之迅速通過(guò)最易受損的-5'C0'C，以防細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引起細(xì)胞死亡。從液氮中取出安瓶，立即在37'C水浴融化，待最后一點(diǎn)冰塊快要融化時(shí)，從水浴中取出，置冰浴上。用510mLHT培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?000r/min10min，棄上清，再懸浮于適量HT培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶或24孔板，置37"，7.5%C02培養(yǎng)。如果細(xì)胞存活力不高，死細(xì)胞太多，可加104l()S/mL小鼠腹腔細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。16、用單抗建立c-ELISA方法檢測(cè)藍(lán)舌病抗體操作步驟酶標(biāo)板抗原包被，50pL/孔，4°C過(guò)夜，PBST洗三次；加血清(被檢、陽(yáng)性、陰性)50pL/孔，37°C濕盒感作60min;加入McAb50pL/孔，37°C濕盒感作30min;加入兔抗鼠IgG—HRP50^L/孔，37°C感作30min;PBST洗五次；加入底物液，100pL/孔，37°C暗盒中顯色20min，加入終止液50laL/孔，于酶標(biāo)儀450nm下測(cè)定OD值。按下列公式計(jì)算抑制百分比(PI):被檢血清平均OD值抑制百分比(PI)%=100--X100陰性血清平均OD值在同樣條件下，用藍(lán)舌病、鹿流行性出血熱、、赤羽病、水泡性口炎、小反芻獸疫陽(yáng)性血清進(jìn)行c-ELISA。所有被檢血清均作l:IO稀釋?zhuān)珺TVl-24型陽(yáng)性血清和當(dāng)?shù)乇粰z陽(yáng)性血清的抑制百分比均在64%97%之間，其它血清的抑制百分比在-37%43%之間。BTV1-24型陽(yáng)性血清之間的抑制百分比差別不大，其中BTV11型、BTV10型、BTV17型陽(yáng)性血清的抑制百分比最大(95%97%)，而B(niǎo)TV1型、BTV22型、BTV7型、BTV19型陽(yáng)性血清的抑制百分比最小(64%76%)。17、用單抗建立雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)抗原操作步驟用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將純化后的單抗(1F5)稀釋至0.01mg/mL，包被ELISA板，50|xL/孔，4。C過(guò)夜，用洗滌液(含0.05。/。Tween-20的PBSpH7.2，PBST)洗3次。加入30mg/mLBSA溶液，200^iL/孔，37。C封閉lh。用PBST洗3次，加入待檢樣品50nL/孔，同時(shí)用BHK細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照，37。C反應(yīng)30min，加入1:500稀釋兔抗BTVIgG，50pL/孔，37°C反應(yīng)30min，用PBST洗3次，加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG,37。C反應(yīng)30min，用PBST洗3次，最后加入底物溶液(TMB+H202)，50pL/孔，室溫反應(yīng)10min，用0.2mol/LH2S04溶液終止反應(yīng)，檢測(cè)OD45QNM值。ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定用建立的ELISA檢測(cè)30份BTV陰性樣品，測(cè)定0045()值，計(jì)算平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以O(shè)D45Q值X+2SD作為陽(yáng)性和陰性的分界線(xiàn)。用ELISA檢測(cè)30份BTV陰性樣品，測(cè)定OD45o值，平均值為0.143，標(biāo)準(zhǔn)差為0.036，根據(jù)公式X+2SD計(jì)算，陽(yáng)性和陰性結(jié)果判定的臨界值為0.215。ELISA方法的特異性用建立的ELISA分別檢測(cè)BTV(血清1、3、5、8、10、11、12、17、22型)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品各20份和其它病毒陽(yáng)性樣品及陰性樣品各10份，評(píng)價(jià)ELISA的特異性。ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果:用ELISA分別檢測(cè)BTV(血清1、3、5、8、10、11、12、17、22型)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品各20份，結(jié)果全為陽(yáng)性。用ELISA方法檢測(cè)EHDV、VSV、PPRV、AKV陽(yáng)性樣品各10份及陰性樣品10份，結(jié)果全為陰性，表明該ELISA具有良好的特異性。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。表3特異性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果從同一批制備的ELISA試劑盒中隨機(jī)取4個(gè)分別對(duì)10份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)在3.76%9.41%之間，表明ELISA批內(nèi)重復(fù)性很好。用3批ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)IO份樣品，結(jié)果批間變異系數(shù)在4.23%9.61%之間，表明ELISA批間重復(fù)性很好。18、兩種ELISA方法的臨床樣品檢測(cè)與應(yīng)用18.1應(yīng)用BTVVP7蛋白特異性單克隆抗體建立的c-ELISA方法，對(duì)采自全國(guó)各地區(qū)動(dòng)物共計(jì)1377份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果c-ELISA陽(yáng)性的血清樣品282份。與瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)檢測(cè)和用美國(guó)(BLUETOUGUEANTIBODYTESTKIT，cELISA)和澳大利亞(Trop-BiocELISAKIT)的診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果完全一致。18.2應(yīng)用BTVVP7蛋白特異性單克隆抗體建立的雙抗體夾心法ELISA,對(duì)采自全國(guó)各地區(qū)259份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，用RT-PCR進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)，其中ELISA檢測(cè)26份陽(yáng)性樣品，233份為陰性；RT-PCR檢測(cè)28份為陽(yáng)性，231份為陰性。24份兩種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性，229份兩種方法檢測(cè)均為陰性。計(jì)算得出ELISA的特異性和敏感性分別為99.1%(229/231)和85.7%(24/28);兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為97.7%(253/259)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表4。_表4臨床樣品檢測(cè)結(jié)果_RT-PCRELISA-_^__總數(shù)陽(yáng)性24226陰性4229233_^_^__^_上述具體實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的一種抗藍(lán)舌病病毒VP7蛋白的特異性單克隆抗體制備方法制備的單克隆抗體，不僅特異性強(qiáng)，敏感性高，親和力好，效價(jià)高，而且穩(wěn)定，特別適合用于建立藍(lán)舌病c-ELISA抗體檢測(cè)和雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法，以用于藍(lán)舌病的快速診斷、檢測(cè)、檢疫和流行病學(xué)調(diào)查。權(quán)利要求1、一種藍(lán)舌病病毒單克隆抗體，其特征在于是采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，用純化的BTV免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行細(xì)胞融合，用HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，分別用純化的BTV抗原、基因工程表達(dá)的BTVVP7蛋白抗原和正常倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞(BHK21)對(duì)照抗原包被的間接ELISA進(jìn)行篩選，經(jīng)有限稀釋法篩選克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗特異性BTVVP7蛋白的單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞株，并制備BTVVP7蛋白的McAb小鼠腹水，制備而成的抗BTVVP7蛋白的單克隆抗體。2、如權(quán)利要求1所述的藍(lán)舌病病毒單克隆抗體的制備方法，其特征在于由以下步驟組成一、藍(lán)舌病病毒的純化；BTV接種BHK-21細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞病變后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，二次離心將細(xì)胞碎片和病毒液分開(kāi)，采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心3h，以純化BTV病毒；二、用提純的藍(lán)舌病病毒免疫BALB/c鼠；每隔2周免疫1次，共免疫3次，純化的BTV病毒注射劑量分別lOOpg、100昭和200昭；三、取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髄瘤細(xì)胞在50X聚乙二醇(MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA方法檢測(cè)分泌抗BTVVP7蛋白的陽(yáng)性孔；四、用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗BTVVP7蛋白的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；五、雜交瘤細(xì)胞注射入BALB/c鼠腹腔制備單抗腹水，取12周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7d后腹腔注入510><105個(gè)雜交瘤細(xì)胞；六、用間接ELISA所述的方法鑒定制備單克隆抗體僅與BTV病毒的VP7蛋白有特異性免疫反應(yīng)，而與其它相關(guān)病毒沒(méi)有任何免疫反應(yīng)。3、權(quán)利要求1所述的藍(lán)舌病病毒單克隆抗體在制備可特異性檢測(cè)藍(lán)舌病抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(c-ELISA)中的應(yīng)用。4、權(quán)利要求1所述的藍(lán)舌病病毒單克隆抗體在檢測(cè)藍(lán)舌病抗原的雙抗體夾心ELISA中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明所述的藍(lán)舌病病毒單克隆抗體是采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，用純化的BTV免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行細(xì)胞融合，用HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，分別用純化的BTV抗原、基因工程表達(dá)的BTVVP7蛋白抗原和正常倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞(BHK21)對(duì)照抗原包被的間接ELISA進(jìn)行篩選，經(jīng)有限稀釋法篩選克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗特異性BTVVP7蛋白的單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞株，并制備BTVVP7蛋白的McAb小鼠腹水，制備而成的抗BTVVP7蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明提供的BTVVP7蛋白單克隆抗體的特異性強(qiáng)，腹水效價(jià)高，親和力高，制備方法簡(jiǎn)單，BTVVP7蛋白單克隆抗體可以用于BTV抗體和抗原的檢測(cè)方法，為我國(guó)藍(lán)舌病的防控提供重要的技術(shù)手段。文檔編號(hào)C12N15/06GK101597334SQ20091009475公開(kāi)日2009年12月9日申請(qǐng)日期2009年7月23日優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日發(fā)明者呂建強(qiáng),周曉黎,曹琛福,曾少靈,楊俊興,秦智鋒,軍艾,花群義,詹愛(ài)軍,阮周曦,兵陳,虹陶申請(qǐng)人:花群義