專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒別反芻動(dòng)物源性成分的熒光pcr檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR檢測(cè)試劑在制備一種能同時(shí)鑒別檢測(cè)牛、山羊和綿羊三種反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
本試劑可對(duì)牛、山羊和綿羊三種反芻動(dòng)物源性成分進(jìn)行同時(shí)快速鑒別檢測(cè)。
研究建立特異、敏感、安全、準(zhǔn)確、快速的牛羊源性成分檢測(cè)方法，在防御瘋牛病和癢病經(jīng)飼料傳播，以及有力監(jiān)管和嚴(yán)格杜絕牛羊商品的摻雜使假現(xiàn)象等多個(gè)方面具有重要意義。對(duì)樣品中低含量的牛羊源性成分或經(jīng)高溫高壓處理后造成樣品中牛羊源性成分DNA降解為小片段的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的方法必須具備高敏感性、高特異性和高準(zhǔn)確性。本發(fā)明中的三重TaqMan熒光PCR檢測(cè)方法可同時(shí)對(duì)牛、山羊和綿羊源性成分進(jìn)行準(zhǔn)確的定性檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)多種源性成分的高通量檢測(cè)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)為 1、本試劑利用三條特異性探針?lè)謩e針對(duì)牛、山羊和綿羊三種動(dòng)物源性成分，以三種不同熒光顯示，從熒光PCR儀直接讀取檢測(cè)結(jié)果，中途不需開(kāi)蓋或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，大大減少了氣溶膠的污染來(lái)源，保證了檢測(cè)結(jié)果的有效性，具有快速、特異、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果讀取直觀等特點(diǎn)。
2、本試劑可對(duì)飼料、肉品、奶品、生皮和動(dòng)物油脂等動(dòng)物產(chǎn)品，以及樣品中低含量的牛羊源性成分或經(jīng)高溫高壓處理后造成樣品中牛羊源性成分DNA降解為小片段的樣品進(jìn)行牛、山羊和綿羊源性成分鑒別檢測(cè)，檢測(cè)樣品種類(lèi)多，檢測(cè)靈敏度高。
3、本試劑可實(shí)現(xiàn)多種動(dòng)物源性成分的高通量檢測(cè)，減少同一樣品因分別進(jìn)行多種動(dòng)物源性成分檢測(cè)時(shí)多次操作DNA或PCR產(chǎn)物而引起污染的風(fēng)險(xiǎn)。比常規(guī)PCR方法通量大，結(jié)果有效性得到更好的保障，也克服了常規(guī)PCR產(chǎn)物須經(jīng)電泳檢測(cè)、費(fèi)時(shí)、不敏感和容易造成氣溶膠污染的缺點(diǎn)。
4、TaqMan熒光PCR增加了探針特異性結(jié)合目的擴(kuò)增產(chǎn)物的限制條件，與常規(guī)PCR的可疑陽(yáng)性檢測(cè)仍必須進(jìn)行酶切鑒定或DNA測(cè)序相比，可作出一個(gè)更加快速準(zhǔn)確的估計(jì)，判定出陽(yáng)性、陰性和可疑。經(jīng)過(guò)對(duì)大量樣品的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，CT值35.0可確定為陽(yáng)性和陰性的臨界值(cut-off)。
5、與常規(guī)PCR必須受到電泳檢測(cè)產(chǎn)物大小的最低要求相比，熒光PCR檢測(cè)的目的片段可大大縮小，特別適用于目的檢測(cè)樣品中的DNA已降解為小片段而在常規(guī)PCR檢測(cè)中可能被漏檢的樣品的檢測(cè)。
6、本試劑盒檢測(cè)方法可在收到樣品后3小時(shí)內(nèi)作出牛、山羊和綿羊源性成分的定性檢測(cè)結(jié)果，是一種檢測(cè)樣品中牛、山羊和綿羊源性成分的敏感而可靠的方法。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例 1、設(shè)計(jì)引物和探針 本發(fā)明分別選擇牛、山羊和綿羊線粒體基因中特異和保守的序列片段為靶目標(biāo)，通過(guò)收集大量GenBank中報(bào)道的牛、山羊和綿羊線粒體基因序列以及其他多種反芻動(dòng)物、非反芻動(dòng)物的線粒體基因序列，進(jìn)行序列分析比較，應(yīng)用Primer Express 3.0軟件和DNAStar中的PrimerSelect軟件，設(shè)計(jì)多組引物和探針。將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，初步確定候選引物和探針，經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過(guò)大量樣品的檢測(cè)應(yīng)用評(píng)估，確定擴(kuò)增效率和特異性最好的引物和探針是基于牛、山羊和綿羊線粒體基因中特異和保守的cyt b基因的保守序列片段設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度大小分別為92bp、136bp和136bp。選定引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成。探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端標(biāo)記，檢測(cè)牛源性成分的探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM(6-羧基熒光素)，3’端標(biāo)記的基團(tuán)是MGB(DNA小溝結(jié)合物)；檢測(cè)山羊源性成分的探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是ROX(6-羧基諾丹明)，3’端標(biāo)記的基團(tuán)是MGB(DNA小溝結(jié)合物)；檢測(cè)綿羊源性成分的探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX(六氯-6-甲基熒光素)，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA(6-羧基四甲基諾丹明)。
2、DNA提取 血粉和全血樣品依照全血基因組提取試劑盒(TAKARA)中的操作說(shuō)明提取DNA。肉品、動(dòng)物源性飼料及飼料添加劑、奶品、生皮、骨骼等樣品按照細(xì)胞/組織-基因組提取試劑盒(TIANGEN)中的操作說(shuō)明提取DNA。植物性飼料及飼料添加劑按動(dòng)物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)中的操作說(shuō)明提取DNA。豬油渣等油脂類(lèi)樣品按邵碧英等人撰寫(xiě)的《動(dòng)物油脂中DNA的提取及牛、羊源性成分的PCR檢測(cè)》(中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26(3)300-302)一文提到的方法提取DNA。熒光PCR和常規(guī)PCR試驗(yàn)用同批次提取的DNA。
3、牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR 首先建立牛、山羊和綿羊3種源性成分的單一熒光PCR方法。引物與探針?lè)纸M配對(duì)，對(duì)牛、山羊、綿羊、鹿、馬、驢、豬、貓、狗、兔、魚(yú)、雞、鴨、鵝、鴿子、火雞和鴕鳥(niǎo)共17種不同動(dòng)物DNA進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)牛、山羊和綿羊源性成分的單一熒光PCR檢測(cè)分別只能從牛、山羊和綿羊DNA為模板的反應(yīng)管中檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明針對(duì)以上3種源性成分設(shè)計(jì)的引物與探針的擴(kuò)增有效性和特異性良好，分別建立了檢測(cè)牛、山羊和綿羊源性成分的單一熒光PCR方法。
將上述各檢測(cè)管產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線檢測(cè)和凝膠電泳檢測(cè)，進(jìn)一步確定陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物的特性和片段大小是否與預(yù)期一致。溶解曲線分析結(jié)果顯示，牛、山羊和綿羊3種單一DNA模板的PCR產(chǎn)物的溶解溫度接近，介于79.4～82.1℃之間。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，牛、山羊和綿羊3種單一DNA模板的PCR產(chǎn)物片段大小與預(yù)期片段大小基本一致。
將DNA模板分別為牛、山羊和綿羊的熒光PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，分析比對(duì)序列，確定陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物為目的源性DNA序列，片段的準(zhǔn)確大小為92bp、136bp和136bp，與預(yù)期片段大小一致。
分別以牛、山羊和綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，反應(yīng)體系設(shè)定為50μL，篩選引物、探針、dNTP和Mg2+的最佳濃度。引物濃度由0.25μmol/L～0.6μmol/L以0.05μmol/L遞增，探針濃度由0.1μmol/L～0.45μmol/L以0.05μmol/L遞增，dNTP濃度由0.075mmol/L～0.25m mol/L以0.025mmol/L遞增，Mg2+濃度由0.75mmol/L ～2.5mmol/L以0.25mmol/L遞增。Taq酶用量以單位u計(jì)算，由1u～5u以0.5u遞增。每次試驗(yàn)采用等量模板和只設(shè)一個(gè)變量，以Ct值、熒光增量和平臺(tái)期等因素為考察依據(jù)，每個(gè)成分的濃度篩選設(shè)置4個(gè)平行管，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，若結(jié)果穩(wěn)定，可確定為該成分的最佳濃度值。
以優(yōu)化好的反應(yīng)體系摸索PCR最佳反應(yīng)條件，在“95℃1～12min，35～45個(gè)循環(huán)的95℃15～30s和55～63℃35～60s”的范圍內(nèi)反復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，每次試驗(yàn)采用同管等量模板，每個(gè)反應(yīng)條件重復(fù)試驗(yàn)3次，以Ct值、熒光增量、平臺(tái)期和耗時(shí)等因素為考察依據(jù)，分別確定3種源性成分的最佳反應(yīng)條件。
在牛、山羊和綿羊源性成分單一熒光PCR檢測(cè)方法的建立基礎(chǔ)上，組合各條引物和探針，建立牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)三重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中的引物、探針、dNTP、Mg2+濃度、Tag酶用量和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。模板采用等比例混合的牛、山羊和綿羊DNA原液，每種配置設(shè)立4個(gè)平行管，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，確定優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。
經(jīng)優(yōu)化，牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR采用50μL體積反應(yīng)液，在ABI 7500型熒光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，58℃40s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。
4、牛羊源性成分檢測(cè)常規(guī)PCR 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20190Y-2006是對(duì)牛羊源性成分進(jìn)行檢測(cè)的常規(guī)PCR方法，只能鑒別檢測(cè)牛和羊源性，不區(qū)分山羊和綿羊源性，分別設(shè)置了檢測(cè)牛和羊源性成分的引物各一對(duì)，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度分別為273bp和294bp，PCR產(chǎn)物以1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
5、牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性和靈敏性 用鹿、馬、驢、豬、貓、狗、兔、魚(yú)、雞、鴨、鵝、鴿子、火雞和鴕鳥(niǎo)等14種不同動(dòng)物DNA與牛、山羊、綿羊DNA進(jìn)行牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性比較實(shí)驗(yàn)。
分別對(duì)牛、山羊、綿羊DNA樣品原液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)门！⑸窖蚝途d羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR和牛羊源性常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的檢測(cè)靈敏度。
6、牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn) 在評(píng)估牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR的組內(nèi)和組間試驗(yàn)的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時(shí)，每次使用牛、山羊和綿羊等比例混合的等量DNA樣品，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，設(shè)置6個(gè)平行反應(yīng)管，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)12次。
7、陽(yáng)性對(duì)照樣品的制備和使用方法 制備牛、山羊和綿羊肉粉作為陽(yáng)性對(duì)照樣品，制備方法如下新鮮牛、山羊和綿羊肉，以經(jīng)消毒滅菌的切刀切成薄片狀，放置在56℃恒溫烘箱中過(guò)夜，充分干燥后，次日轉(zhuǎn)至滅菌研缽中研磨成粉末，即可轉(zhuǎn)移到滅菌EP管中長(zhǎng)期保存，作為陽(yáng)性對(duì)照樣品提取陽(yáng)性對(duì)照DNA。制備過(guò)程中，處理牛、山羊和綿羊樣品的用品用具需嚴(yán)格分開(kāi)，單獨(dú)使用，防止互相污染。
陽(yáng)性對(duì)照樣品的使用方法根據(jù)檢測(cè)源性項(xiàng)目，每次檢測(cè)提取牛、山羊或綿羊DNA各1份，每份陽(yáng)性對(duì)照DNA大約取5mg肉粉，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行DNA的提取，最終將DNA溶解在100μL TE溶液或DEPC水中。
8、對(duì)牛、山羊、綿羊和其他動(dòng)物樣品，以及其他待測(cè)動(dòng)物源性樣品的檢測(cè) 分別采用牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法和國(guó)標(biāo)GB/T 20190Y-2006方法對(duì)牛、山羊、綿羊、鹿、馬、驢、豬、貓、狗、兔、魚(yú)、雞、鴨、鵝、鴿子、火雞和鴕鳥(niǎo)等17種不同動(dòng)物DNA，以及200份飼料、肉品、奶品等不同來(lái)源的樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證三重?zé)晒釶CR方法的特異性。在每一個(gè)檢測(cè)試驗(yàn)中采用同管等量的DNA模板，每份DNA樣品的每種方法檢測(cè)必須重復(fù)2次，每次均設(shè)置2個(gè)平行試驗(yàn)，只有當(dāng)每種方法的2次重復(fù)試驗(yàn)與所有平行試驗(yàn)結(jié)果都一致時(shí)，才確定該份DNA樣品的檢測(cè)結(jié)果，否則需重新進(jìn)行檢測(cè)。最后，分別比對(duì)兩種方法對(duì)每一份DNA樣品的檢測(cè)結(jié)果是否一致，計(jì)算兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率。結(jié)果顯示，對(duì)于那些由兩種方法檢測(cè)都顯示為陽(yáng)性的樣品，其在三重?zé)晒釶CR檢測(cè)中的CT值均小于或等于35.0，陰性對(duì)照樣品的CT值均大于38.0或無(wú)CT值，試驗(yàn)特異性強(qiáng)。因此，經(jīng)過(guò)對(duì)大量陽(yáng)性和陰性樣品檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析后，確定了CT值38.0可作為陽(yáng)性和陰性的臨界值(cut-off)。CT值大于38.0或無(wú)CT值可判為陰性，CT值小于或等于35.0可判為陽(yáng)性，在35.0-38.0之間為可疑，須重新試驗(yàn)。因此，三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)牛、山羊和綿羊源性成分的特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好。
9、牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑和檢測(cè)程序 9.1試劑盒組成(50μl反應(yīng)×50次)根據(jù)上述1～8試驗(yàn)結(jié)果，按照反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)確定的反應(yīng)條件，配制如下試劑盒組份 9.2操作方法 9.2.1總DNA的提取 (1)參照李永明主編《實(shí)用分子生物學(xué)方法手冊(cè)》，科學(xué)出版社(1998年)第166-168頁(yè)，酚/氯仿核酸抽提法提取DNA。
(2)也可從生物試劑公司購(gòu)買(mǎi)針對(duì)各類(lèi)樣品DNA提取的商品化試劑盒，如細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒、動(dòng)物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒、全血基因組提取試劑盒和油脂類(lèi)原料DNA提取試劑盒等。其中，試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照需使用細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照DNA的提取，每份陽(yáng)性對(duì)照取粉劑5mg，提取DNA后溶解在100μl DEPC水或TE中待用。
9.2.2反應(yīng)組份的配制 (1)反應(yīng)總體積為50μl，向反應(yīng)管中加入下列組分
(2)設(shè)立對(duì)照 設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各2管，陽(yáng)性對(duì)照根據(jù)檢測(cè)的目的源性成分來(lái)設(shè)定。若只檢測(cè)牛、山羊或綿羊中的一種源性成分，只需在陽(yáng)性對(duì)照管中加入相應(yīng)的一種陽(yáng)性對(duì)照DNA，若需同時(shí)檢測(cè)三種源性成分，則陽(yáng)性對(duì)照管中同時(shí)加入三種陽(yáng)性對(duì)照DNA。
9.2.3熒光PCR反應(yīng)程序 按下列參數(shù)設(shè)置熒光PCR反應(yīng)程序
9.2.4結(jié)果分析和判定 (1)結(jié)果分析條件設(shè)定 根據(jù)擴(kuò)增曲線的熒光素種類(lèi)，F(xiàn)AM代表牛源性成分，ROX代表山羊源性成分，HEX代表綿羊源性成分，直接讀取檢測(cè)結(jié)果。
基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。
(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) ——陰性對(duì)照無(wú)Ct值，且無(wú)擴(kuò)增曲線，基本為一水平線。
——陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于35.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照管的相應(yīng)源性成分的擴(kuò)增曲線基本重合，特別是在Threshold(熒光臨界值)附近。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
(3)結(jié)果描述及判定 ——陰性 Ct值應(yīng)大于38.0或無(wú)擴(kuò)增曲線，表示樣品中無(wú)牛、山羊和綿羊源性成分。
——陽(yáng)性 代表FAM的擴(kuò)增曲線Ct值小于或等于35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在牛源性成分；代表ROX的擴(kuò)增曲線Ct值小于或等于35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在山羊源性成分；代表HEX的擴(kuò)增曲線Ct值小于或等于35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在綿羊源性成分；代表FAM、ROX和HEX的3種擴(kuò)增曲線的Ct值均小于或等于35.0，且都出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中同時(shí)存在牛、山羊和綿羊源性成分。
——有效原則 根據(jù)對(duì)大量樣品的檢測(cè)篩選，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增曲線的Ct值處于35.0～38.0之間的樣品為可疑樣品，建議重做。重做結(jié)果Ct值大于38.0或無(wú)擴(kuò)增曲線者為陰性，否則為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1、一種鑒別反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR檢測(cè)試劑，其特征在于包含兩對(duì)特異性引物和三條TaqMan探針，其中，一對(duì)引物針對(duì)牛源性成分，另一對(duì)是針對(duì)山羊和綿羊源性成分檢測(cè)的通用引物，三條探針?lè)謩e針對(duì)牛、山羊和綿羊源性成分，對(duì)牛、山羊和綿羊源性成分檢測(cè)的擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度分別為92bp、136bp和136bp，引物和探針序列如下
A、牛源性成分檢測(cè)引物和探針序列
引物B-F5’-TGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT-3’
B-R5’-TGACTGTTGCTCCTCAGAATGATA-3’
探針B-probeFAM-5’-AGCATTTATAGGATACGTCC-3’-MGB
B、山羊源性成分檢測(cè)引物和探針序列
引物G-O-F5’-AGAAACATGAAACATC(T)GGA-3’
G-O-R5’-ATATGGAATTGCTGAAAGAA(G)-3’
探針G-probeROX-5’-TCCTGCTCGCAACAATGGC-3’-MGB
C、綿羊源性成分檢測(cè)引物和探針序列
引物G-O-F5’-AGAAACATGAAACATC(T)GGA-3’
G-O-R5’-ATATGGAATTGCTGAAAGAA(G)-3’
探針O-probeHEX-5’-TCCTATTTGCGACAATAGC-3’-TAMRA。
2、如權(quán)利要求1所述的鑒別反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于由以下步驟組成
一、分別選擇牛、山羊和綿羊線粒體基因中特異和保守的cyt b基因的保守序列片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列分別為
(1)牛源性成分的檢測(cè)擴(kuò)增目標(biāo)序列
TGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGTAATAGCCACAGCATTTATAGGATACGTCCTGCCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCAACAGTCA；
(2)山羊源性成分的檢測(cè)擴(kuò)增目標(biāo)序列
AGAAACATGAAACATCGGAGTAATCCTCCTGCTCGCAACAATGGCCACAGCATTCATAGGCTATGTTTTACCATGAGGACAAATATCATTTTGAGGGGCAACAGTCATCACTAATCTTCTTTCAGCAATTCCATAT；
(3)綿羊源性成分的檢測(cè)擴(kuò)增目標(biāo)序列
AGAAACATGAAACATCGGAGTAATCCTCCTATTTGCGACAATAGCCACAGCATTCATAGGCTATGTTTTACCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAACCTTCTTTCAGCAATTCCATAT；
二、根據(jù)牛、山羊和綿羊特異和保守的線粒體基因保守序列的特點(diǎn)，應(yīng)用Primer Express3.0軟件和DNAStar中的PrimerSelect軟件，設(shè)計(jì)合成多組待測(cè)引物和探針；
三、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成；
四、探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端標(biāo)記，檢測(cè)牛源性成分的探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM(6-羧基熒光素)，3’端標(biāo)記的基團(tuán)是MGB(DNA小溝結(jié)合物)；檢測(cè)山羊源性成分的探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是ROX(6-羧基諾丹明)，3’端標(biāo)記的基團(tuán)是MGB(DNA小溝結(jié)合物)；檢測(cè)綿羊源性成分的探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX(六氯-6-甲基熒光素)，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA(6-羧基四甲基諾丹明)；
五、將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，得到權(quán)利要求1所述的引物和探針。
3、權(quán)利要求1所述的鑒別反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR檢測(cè)試劑在制備一種能同時(shí)鑒別檢測(cè)牛、山羊和綿羊三種反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能同時(shí)鑒別三種反芻動(dòng)物品種的生物檢測(cè)試劑，以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明是選擇牛、山羊和綿羊特異和保守的線粒體基因保守序列片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用Primer Express 3.0軟件和DNAStar中的Primer Select軟件，設(shè)計(jì)合成多組引物和探針。將設(shè)計(jì)的多對(duì)引物和探針合成和標(biāo)記后進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)，得到最適合的引物和探針組合。本發(fā)明所述的試劑包含兩對(duì)特異性引物和三條Taq Man探針，其中，一對(duì)引物針對(duì)牛源性成分，另一對(duì)是針對(duì)山羊和綿羊源性成分檢測(cè)的通用引物，三條探針?lè)謩e針對(duì)牛、山羊和綿羊源性成分，對(duì)牛、山羊和綿羊源性成分檢測(cè)的擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度分別為92bp、136bp和136bp。本發(fā)明中的三重Taq Man熒光PCR檢測(cè)方法可同時(shí)對(duì)牛、山羊和綿羊源性成分進(jìn)行準(zhǔn)確的定性檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)多種源性成分的高通量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101659996SQ200910094768
公開(kāi)日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者曾少靈, 秦智鋒, 花群義, 阮周曦, 盧體康, 曹琛福, 陳書(shū)琨, 呂建強(qiáng), 張彩虹, 潔 孫, 兵 陳 申請(qǐng)人:花群義