專利名稱：川芎嗪的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域與食品化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用納豆枯 草芽孢桿菌制備川芎嗪的方法。
背景技術(shù)：
川芎，傘形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖。 亦稱,考，為多年生草本植物，根狀莖，黃褐色；二或三回羽狀復(fù)葉，小 葉3至5對，邊緣成不整齊羽狀全裂或深裂；花白色，復(fù)傘形花序；雙懸果 卵形，有銳棱。根狀莖入藥，性溫、味辛，有活血、行氣、調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)、 祛癡、止痛等功能，主治頭痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、；e失打肺痛、風(fēng)濕痹 痛等癥，用于治療冠心病，急、慢性缺血性腦血管病。
川芎為我國傳統(tǒng)的中藥材，主要化學(xué)成分有阿魏酸、川芎嗪、川芎酚、 川芎哚、蒿本內(nèi)酯、川芎酞內(nèi)酸，還含有多種有機(jī)酸、酯、醇、糖等化學(xué) 物質(zhì)、維生素A和微量元素等。川芎噪(Ligustrazine,Lig;Tetramethylpyra zine,TMP)是從傘科植物川芎的根、莖中提取的一種活性生物堿，學(xué)名為 四曱基吡嗪。川芎。秦分子式為C8H12N2，相對分子質(zhì)量為136.20;外觀為 無色針晶，有特殊氣味，熔點(diǎn)為80 82。C，沸點(diǎn)為19(TC,吸潮，易升華； 溶于熱水、石油醚、氯仿、稀鹽酸，微溶于乙醚，難溶于冷水。
近年來人們對川芎。秦的藥理和臨床應(yīng)用均做了深入的研究，根據(jù)動物 藥理實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用觀察，川芍。秦具有明顯擴(kuò)張冠狀動脈、增加冠狀動脈 血流量、松弛血管平滑肌、降低血小板表面活性等藥理作用。在臨床上可 用于改善心絞痛和心肌缺血狀態(tài)，治療缺血性腦血栓和腦梗塞，拮抗鈣離子，降低血液黏度，增強(qiáng)心肌收縮，以糾正心衰，松弛平滑肌，減少腺體 分泌、改善^f效循環(huán)，治療腎炎、糖尿病、腎病、肺間質(zhì)纖維、小兒哞喘及 支氣管炎、面癱、耳聾、關(guān)節(jié)炎等疾病。
目前川芍嗪主要是從中藥材川芎中提取得到，趙惠萍對川芎的提取工
藝進(jìn)行了研究(中國醫(yī)學(xué)叢刊，2004年，4巻10期，川芎提取工藝的研究)， 采用四種提取方法得出最佳提取方案，證明在酸性條件下，用醇提取川芎 嗪的工藝是可行的。劉本等人用法多索溶劑、超臨界CO2或含有10。/。曱醇 的超臨界C02從川芎中提取川芎嗪(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1999年，2巻30 期，法多索溶劑和超臨界流體提取川芎中的川芎嗪)，HPLC分析結(jié)果表 明，經(jīng)過2小時的提取，含有10。/。曱醇的超臨界CO2提取率最高1.02。/。，法 多索溶劑經(jīng)過3次1.5小時的才是取，提取率最低0.74%。
川穹溱也可以采用化學(xué)合成的方法來制備，中國專利CN1100765C中 公開了一種四曱基吡溱的制備方法，在vin族金屬化合物與有機(jī)配體形成的 配位催化劑存在下，通過氫氣與2，3 - 丁二酮一肟反應(yīng)而獲得四曱基吡嗪， 其中考察了不同反應(yīng)溫度、氫氣分壓、反應(yīng)時間、溶劑等對其合成的影響 規(guī)律。中國專利CN1238344C公開了一種四曱基吡嗪的生產(chǎn)方法，以氨基 丁酮為原料，在石咸性條件下通入蒸汽，得到的四曱基吡嗪可以為三水合物 形式。上述化學(xué)合成法雖然產(chǎn)率較高，但容易產(chǎn)生許多副產(chǎn)物，還會帶來 環(huán)境污染和安全性問題。
生物轉(zhuǎn)化是利用植物離體細(xì)胞或器官、動物細(xì)胞、微生物及其細(xì)胞器， 以及游離酶對外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的生化反應(yīng)。其中微生物作為一 個完整個體，其體積雖小，但也有一套自身特異性的酶體系，且資源豐富、 種類繁多，對于特異的底物，可供篩選的菌林^f艮多。目前利用多種不同催 化功能的酶系對天然活性成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的組合性的天然化合 物庫，再通過活性篩選，尋找新的高效低毒的天然活性先導(dǎo)化合物，或通 過對活性組分中不同成分結(jié)構(gòu)變化與活性強(qiáng)度消長關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)新一
5代的先導(dǎo)化合物，已取得了巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)開發(fā)新藥的過程，是以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物，通 過化學(xué)或生物的手段，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，得到根多結(jié)構(gòu)新穎的化合物， 進(jìn)而發(fā)現(xiàn)毒性更低，療效更好的藥物?？梢娚镛D(zhuǎn)化在指導(dǎo)新藥的結(jié)構(gòu)修 飾，獲得高效長效的新一代藥物中的重要性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種川芎嗪的制備方法，利用納豆枯草芽孢桿菌對大豆 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化制備川穹嗪，該方法操作簡單，轉(zhuǎn)化反應(yīng)易于控制，無污染， 安全性高。
一種川t嗪的制備方法，包括
(1 )將納豆枯草芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基， 在30 40。C (優(yōu)選37。C)培養(yǎng)18 24小時得到種子培養(yǎng)液；
所述的納豆枯草芽孢桿菌為日本生產(chǎn)納豆的常用菌種，可采用市售產(chǎn)
口 口口 ，
得到的種子培養(yǎng)液內(nèi)菌種細(xì)胞的密度為lxl07~ lxl09cfti/ml。 (2)將步驟(1 )得到的種子培養(yǎng)液接入大豆培養(yǎng)基，在30 40。C(優(yōu) 選37。C )培養(yǎng)轉(zhuǎn)化144- 168小時后即得到含有川芎嗪的產(chǎn)物；
所述的大豆培養(yǎng)基是將用流水浸泡的大豆滅菌處理后得到，滅菌處理 過程為常規(guī)的高溫滅菌，優(yōu)選在115。C滅菌處理25分鐘。
種子培養(yǎng)液與大豆培養(yǎng)基的重量比優(yōu)選為0.5 ~ 8 : 100，優(yōu)選為1 :
100。
培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過程中可添加適量的乙偶姻，乙偶姻的添加時間可選擇在培
養(yǎng)轉(zhuǎn)化進(jìn)行0 ~ 132小時的時候，優(yōu)選在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化進(jìn)行96小時的時候；乙 偶姻的添加量為培養(yǎng)液與大豆培養(yǎng)基總重量的0.1%~3%，優(yōu)選0.5% 。 經(jīng)研究表明，乙偶姻的加入可以顯著提高轉(zhuǎn)化率，對目標(biāo)產(chǎn)物的純度也會有良好的改善。
(3)在步驟(2)得到的含有川芎溱的產(chǎn)物中加入有機(jī)溶劑進(jìn)行提取 得到提取液，將提取液與稀鹽酸混合均勻后靜置分層，水相即為鹽酸化的 川芎。秦水溶液。
含有川芍嗪的產(chǎn)物和有機(jī)溶劑的用量可優(yōu)選含有川芎嗪的產(chǎn)物的重 量(g):有機(jī)溶劑的體積(mL) = 1 : 5-50，優(yōu)選1 : 25;以保證充分 提取川芎。秦，并節(jié)約有機(jī)溶劑。
所述有機(jī)溶劑為甲醇、丙酮、乙酸乙酯、lmol/LNaOH水溶液與氯仿
體積比為l : l的混合溶液或氯仿。
所述有機(jī)溶劑還可以是乙酸、乙醇和水的混合溶液，其重量百分比組
成為乙酸5%，乙醇65%~80%，余量為水。采用該混合溶液，由于其極 性與目的產(chǎn)物的極性接近，可明顯提高提取的收率。
該混合溶液配置時一般可采用預(yù)先配置好的乙醇水溶液與適量的乙 酸混合。
利用有機(jī)溶劑提取的過程可選擇在超聲波輔助處理下于20 ~ 60°C回 流提取0.5-4小時，過濾除去殘?jiān)玫教崛∫海?br> 超聲波的功率可選擇220~880W，提取溫度可為23~57°C,提取時 間為0.5-3小時。
所述稀鹽酸濃度為O.l ~ 0.4mol/L,優(yōu)選0.2 ~ 0,25mol/L。
鹽酸化的川芎溱水溶液中含有川考。秦，可直接進(jìn)行利用或根據(jù)需要應(yīng) 用現(xiàn)有技術(shù)手段進(jìn)行濃縮或提純。
鹽酸化的川芎。秦水溶液經(jīng)過濾處理后進(jìn)行反向高效液相色譜法 (RP-HPLC)檢測，檢測條件為流動相質(zhì)量濃度為1%的醋酸水溶液 與曱醇的體積比=45 : 55;流速0.8mL/min;;險測波長290nm;柱溫 45。C;進(jìn)樣量2pL。
本發(fā)明川芎嗪的制備方法利用了納豆枯草芽孢桿菌的特性，操作流程
7簡單，微生物細(xì)胞培養(yǎng)容易，生物轉(zhuǎn)化易于控制，安全性高，且無環(huán)境污 染，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
將納豆枯草芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng) 基，在37"、 150r/min搖床中培養(yǎng)18小時得到種子培養(yǎng)液。
稱取100g用流水浸泡的大豆加入500mL三角瓶中，于115。C滅菌處 理25分鐘，得到所需的培養(yǎng)基。
將2g種子培養(yǎng)液無菌接入上述培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)轉(zhuǎn)化144小時后即 得到102g含有川莒嗪的產(chǎn)物，加入510mL氯仿，在功率為550W的超聲 波輔助處理下，于30。C回流提取1.5小時后過濾除去殘?jiān)?，得到提取液?加入與提取液相同體積的0.2mol/L的稀鹽酸，混合均勻后靜置分層，水相 即為鹽酸化的川芎溱水溶液。
將上述鹽酸化的川芎溱水溶液進(jìn)行RP-HPLC檢測，檢測結(jié)果為每 100g大豆可轉(zhuǎn)化制得0.0214 mg川芎。秦。
實(shí)施例2
將納豆枯草芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng) 基，在37。C、 150r/min搖床中培養(yǎng)18小時得到種子培養(yǎng)液。
稱取100g用流水浸泡的大豆加入500mL三角瓶中，于115。C下滅菌 處理25分鐘，得到所需的培養(yǎng)基。
將2g種子培養(yǎng)液無菌接入上述培養(yǎng)基，于37。C進(jìn)行培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化96小時時加入0.2g乙偶姻，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化144小時后即得到102.2g含有 川芎嗪的產(chǎn)物，加入511mL丙酮，在功率為550W的超聲波輔助處理下， 于43。C回流提取1.5小時后過濾除去殘?jiān)?，得到提取液，加入與提取液相
8同體積的0.2mol/L的稀鹽酸，混合均勻后靜置分層，水相即為鹽酸化的川 芍"秦水溶液。
將上述鹽酸化的川芎溱水溶液進(jìn)行RP-HPLC檢測，檢測結(jié)果為每 100g大豆可轉(zhuǎn)化制得0.698 mg川穹溱。
實(shí)施例3
將納豆枯草芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng) 基，在37。C、 150r/min搖床中培養(yǎng)18小時得到種子培養(yǎng)液。
稱取100g用流水浸泡的大豆加入500mL三角瓶中，于115。C下滅菌 處理25分鐘，得到所需的培養(yǎng)基。
將5g種子培養(yǎng)液無菌接入上述培養(yǎng)基，于37。C下進(jìn)行培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，培 養(yǎng)轉(zhuǎn)化96小時時加入0.2g乙偶姻，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化144小時后即得到105.2g含 有川芎嗪的產(chǎn)物，加入5260mL氯仿，在功率為880W的超聲波輔助處理 下，于25。C回流提取2.5小時后過濾除去殘?jiān)?，得到提取液，加入與提取 液相同體積的0.2mol/L的稀鹽酸，混合均勻后靜置分層，水相即為鹽酸化 的川芎喚水溶液。
將上述鹽酸化的川芍嗪水溶液進(jìn)行RP-HPLC檢測，檢測結(jié)果為每 100g大豆可轉(zhuǎn)化制得0.888 mg川芍溱。
實(shí)施例4
將納豆枯草芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng) 基，在37。C、 150r/min搖床中培養(yǎng)18小時得到種子培養(yǎng)液。
稱取100g用流水浸泡的大豆加入500mL三角瓶中，于115匸下滅菌 處理25分鐘，得到所需的培養(yǎng)基。
將lg種子培養(yǎng)液無菌接入上述培養(yǎng)基，于37。C下進(jìn)行培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，培 養(yǎng)轉(zhuǎn)化96小時時加入0.48g乙偶姻，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化168小時后即得到101.48g含有川芎嗪的產(chǎn)物，加入乙酸、乙醇和水的混合溶液2537ml進(jìn)行提取， 混合溶液重量百分比組成為乙酸5%，乙醇70%，余量為水。在功率為880W 的超聲波輔助處理下，于25。C回流提取2.5小時后過濾除去殘?jiān)?，得到?取液，加入與提取液相同體積的0.25mol/L的稀鹽酸，混合均勻后靜置分 層，水相即為鹽酸化的川芎。秦水溶液。
將上述鹽酸化的川彎溱水溶液進(jìn)行RP-HPLC檢測，檢測結(jié)果為每 100g大豆可轉(zhuǎn)化制得0.92 mg川芎"秦。
權(quán)利要求
1、一種川芎嗪的制備方法，包括(1)將納豆枯草芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，在30～40℃培養(yǎng)18～24小時得到種子培養(yǎng)液；(2)將步驟(1)得到的種子培養(yǎng)液接入大豆培養(yǎng)基，在30～40℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化144～168小時后即得到含有川芎嗪的產(chǎn)物；(3)在步驟(2)得到的含有川芎嗪的產(chǎn)物中加入有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，得到提取液，將提取液用稀鹽酸酸化后分離出水相，得到鹽酸化的川芎嗪水溶液。
2、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(l)中，種子 培養(yǎng)液內(nèi)菌種細(xì)胞的密度為lxl07~ lxl09cfU/mL。
3、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，種子 培養(yǎng)液與大豆培養(yǎng)基的重量比為0.5-8 : 100。
4、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，在培 養(yǎng)轉(zhuǎn)化過程中添加乙偶姻。
5、 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述乙偶姻的添加 時間為在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化進(jìn)行0~132小時的時候，添加量為種子培養(yǎng)液與大豆 培養(yǎng)基總重量的0.1% ~3%。
6、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述有 機(jī)溶劑為曱醇、丙酮、乙酸乙酯、lmol/L NaOH水溶液與氯仿體積比為1 : 1的混合溶液或氯仿。
7、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述有 機(jī)溶劑為乙酸、乙醇和水的混合溶液，其重量百分比組成為乙酸5%,乙 醇65%~80%,余量為水。
8、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述提取過程為在超聲波輔助處理下于20 6(TC回流提取0.5~4小時，過濾除去殘?jiān)?，?到提取液。
9、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述稀鹽酸的濃度 為0.1 ~0.4mol/L。
10、 如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于所述稀鹽酸的濃度 為0.2 ~ 0.25mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種川芎嗪的制備方法，包括將納豆枯草芽孢桿菌LB斜面種子培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，接入大豆培養(yǎng)基中，在30～40℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化144～168小時后即得到含有川芎嗪的產(chǎn)物，再加入有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，提取液與稀鹽酸混合均勻后靜置分層，水相即為鹽酸化的川芎嗪水溶液。該方法操作簡單，微生物細(xì)胞培養(yǎng)容易，生物轉(zhuǎn)化易于控制，安全性高，且無污染，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P17/12GK101503718SQ20091009681
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者何國慶, 傅明亮, 婧 劉, 章海鋒, 輝 阮, 陳啟和 申請人:浙江大學(xué)