專利名稱：：源于成形組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種源于成形組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化方法。(二)
背景技術(shù)：
人體的各種組織都有可能存在著具有一定分化潛能的干細(xì)胞。相關(guān)的研究已經(jīng)表明，除了骨髓和臍帶血之外，在其他的成形組織中，例如脂肪、新生兒臍帶以及胎盤等，也存在著可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等的干細(xì)胞，這些干細(xì)胞一皮統(tǒng)稱為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。這些間充質(zhì)干細(xì)胞都可能將在醫(yī)學(xué)上具有細(xì)胞移植和組織工程化的重大利用價(jià)值。由于目前還尚未發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞專一的特異性標(biāo)記分子，因此該干細(xì)胞的分離純化采用的還是間接的方法即采用貼壁粘附的方法進(jìn)行篩選和純化。對(duì)于液體組織(例如骨髓和臍帶血)來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，通常采用分離液體組織中的單個(gè)核細(xì)胞，并在進(jìn)行貼附培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，利用間充質(zhì)干細(xì)胞的貼附性，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁形成紡錘狀或纖維狀細(xì)胞，并經(jīng)過傳代貼壁來逐步純化間充質(zhì)干細(xì)胞。對(duì)于成形組織(例如臍帶和胎盤等)，一種方法是將組織剪切成碎塊后直接進(jìn)行貼附培養(yǎng)，然后分離纖維狀細(xì)胞；另一種方法是采用膠原酶或胰酶消化組織塊后收集分散細(xì)胞，再行貼附培養(yǎng)方法進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞分離和純化。成形組織中間充質(zhì)干細(xì)胞的這兩種方法簡(jiǎn)單方便,但是這兩種方法分離的細(xì)胞實(shí)際上是多種細(xì)胞的混合物，其中混有大量的內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，而非單純的間充質(zhì)干細(xì)胞。這種多細(xì)胞混合物的繼代培養(yǎng)和擴(kuò)增能力較低，難以形成真正的間充質(zhì)干細(xì)胞抹系。目前已有研究根據(jù)間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)為CD3r、CD34-、CD45-、CD29+、CD73+、CD90+、CD105+和CD166+的特點(diǎn),采用在細(xì)月包原代貼附培養(yǎng)、積聚一定的細(xì)胞數(shù)量基礎(chǔ)上，再利用特異的抗體標(biāo)記免疫磁珠進(jìn)行分選，能有效地提高胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的純化率。但是，這種分離純化方法比較煩瑣、成本比較高，并且不適用于大量成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化。因此，如果能在成形組織的間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化中采用一種既分離純化效率高，又簡(jiǎn)便快捷、成本低廉的方法，則對(duì)今后大量分離成形組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容為了有效提高成形組織中間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離純化效率，本發(fā)明依據(jù)成形組織中不同種類細(xì)胞的貼附能力差異，進(jìn)行分時(shí)間段貼壁篩選，目的是提供一種便捷有效的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞分離和純化方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種源于成形組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化方法，所述方法包括(1)取成形組織碎片用膠原酶消化，獲得懸浮細(xì)胞，收集所述的懸浮細(xì)胞于培養(yǎng)液a中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)410小時(shí)，收集未貼附的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞備用；(2)將步驟(1)獲得的未貼附細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)液b中貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)時(shí)間為步驟(1)所述的貼壁培養(yǎng)時(shí)間的1.52.5倍，再次收集未貼附的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞備用；(3)步驟(2)獲得的未貼附細(xì)胞重復(fù)步驟(2)的操作1~5次，每次各自貼壁培養(yǎng)時(shí)間為前一次的貼壁培養(yǎng)時(shí)間的1.5~2.5倍，獲得不同時(shí)間段貼附的貼壁細(xì)胞；(4)對(duì)不同時(shí)間段獲得的貼壁細(xì)胞分別培養(yǎng)擴(kuò)增，并分別進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面抗原檢定，篩選獲得具有間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特性貼壁細(xì)胞的最佳貼壁培養(yǎng)時(shí)間段；(5)取在最佳貼壁培養(yǎng)時(shí)間段貼附的貼壁細(xì)胞，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液c中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，獲得純化的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明關(guān)鍵在于依據(jù)成形組織中不同種類細(xì)胞的貼附能力差異，進(jìn)行分時(shí)間段貼壁培養(yǎng)篩選以獲得最佳貼壁時(shí)間段的貼附細(xì)胞，培養(yǎng)過程中的其他參數(shù)，均可采用本領(lǐng)域常規(guī)手段進(jìn)行。所述細(xì)胞培養(yǎng)液a、細(xì)胞培養(yǎng)液b、細(xì)胞培養(yǎng)液c為本領(lǐng)域常規(guī)用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，分別命名為a、b、c只是為了便于區(qū)分不同操作步驟中的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液a、細(xì)胞培養(yǎng)液b、細(xì)胞培養(yǎng)液c可以相同，也可以有所不同，本發(fā)明推薦所述細(xì)胞培養(yǎng)液a、細(xì)胞培養(yǎng)液b、細(xì)胞培養(yǎng)液c相同，均優(yōu)選為添加體積含量為10%胎牛血清和2mML-谷氨酰胺的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)畫LG(低糖DMEM)培養(yǎng)液。即所述的細(xì)胞培養(yǎng)液每L含有基礎(chǔ)DMEM-LG培養(yǎng)基900ml、100ml胎牛血清、L-谷氨酰胺2mmo1。DMEM-LG培養(yǎng)基含有如下成份1.0g/L葡萄糖(低糖)，3.7g/L碳酸氫鈉，0.11g/L丙酮酸鈉，含酚紅，不含谷氨酰胺。所用膠原酶推薦為IV型膠原酶。所述間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面抗原檢定為對(duì)CD31、CD34、CD45、CD29、CD73、CD90、CD105和CD166中的三種以上抗原的檢定。需滿足CD31-、CD34-、CD45-、CD29+、CD73+、CD90+、CD105+和CD166+,-表示陰性，+表示陽性。所述成形組織來自下列之一脂肪、新生兒臍帶、胎盤等。具體的，所述方法如下(1)取胎盤母體側(cè)蛻膜組織，剪碎，碎片用IV型膠原酶消化，收集細(xì)胞懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液a中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)8小時(shí)，收集未貼附的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞備用；(2)將步驟(1)獲得的未貼附細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)液b中貼壁培養(yǎng)16小時(shí)，再次收集未貼附的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞備用；(3)步驟(2)獲得的未貼附細(xì)胞重復(fù)步驟(2)的操作3次，各次貼壁培養(yǎng)時(shí)間依次為24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，分別獲得不同時(shí)間段貼附的貼壁細(xì)胞；(4)對(duì)不同時(shí)間段獲得的貼壁細(xì)胞分別培養(yǎng)擴(kuò)增，并分別進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面抗原檢定，篩選獲得具有間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特性貼壁細(xì)胞的最佳貼壁培養(yǎng)時(shí)間段；(5)取在最佳貼壁培養(yǎng)時(shí)間段貼附的貼壁細(xì)胞，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液c中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，獲得純化的蛻膜組織間充質(zhì)干細(xì)胞；所述細(xì)胞培養(yǎng)液a、細(xì)胞培養(yǎng)液b、細(xì)胞培養(yǎng)液c均為添加有體積含量為10%胎牛血清和2mML-谷氨酰胺的DMEM-LG培養(yǎng)液。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本方法采用收集成形組織細(xì)胞后，進(jìn)行分散懸浮細(xì)胞的不同時(shí)間段貼壁培養(yǎng)，然后再行特異表面抗原測(cè)定，篩選最佳貼壁時(shí)間段的貼附細(xì)胞，可以達(dá)到比較好的分選效果。(2)對(duì)最佳貼壁時(shí)間段分選的細(xì)胞采用單個(gè)細(xì)胞克隆方法進(jìn)一步提高了成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞的純化效率。(3)經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段分選的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的增殖潛能。與未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的貼附細(xì)胞相比，其對(duì)數(shù)生長期可以提前2~3天，并且最快可以在5天的時(shí)間內(nèi)完成細(xì)胞單層的形成；而未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中鋪層較慢，細(xì)胞生長期可達(dá)9~11天之久。(4)經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段分選的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞具有顯著的多分化潛能。(四)圖1(A)為實(shí)施例2經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段分選的細(xì)胞克??；圖1(B)為實(shí)施例2克隆細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)增鋪層后的細(xì)胞形態(tài)；圖2為實(shí)施例3經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段分選的細(xì)胞(以一令一表示)與未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的細(xì)胞(以一—表示)擴(kuò)增能力比較；圖3(A)為實(shí)施例4經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段分選的細(xì)胞與未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化潛能的比較圖3(B)為實(shí)施例4經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段分選的細(xì)胞與未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的向成骨細(xì)胞分化潛能的比較。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:取胎盤母體側(cè)蛻膜組織，剪碎成小塊，取碎片5g加入到10mL含0.1%(w/v,即lg/L,每1L消化液中含lg酶)IV型膠原酶(Sigma公司，125U/mg)的消化液(消化液溶劑為雙蒸水)中消化30分鐘后收集細(xì)胞，以細(xì)胞培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)和2mML-谷氨酰胺(Sigma公司)的DMEM-LG(Hyclone公司)培養(yǎng)液(按900mL基礎(chǔ)DMEM-LG培養(yǎng)液添加100mL胎牛血清和2mmo1L-谷氨酰胺配制，下同)懸浮后，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間段的貼壁培養(yǎng)。1、收集的懸浮細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板中貼壁培養(yǎng)8小時(shí)后，收集未貼附的懸浮細(xì)胞，保留已經(jīng)貼附在培養(yǎng)板中的細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；收集的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)貼壁培養(yǎng)16小時(shí)，然后再次收集未貼壁的懸浮細(xì)胞，保留已經(jīng)貼附在培養(yǎng)板中的細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；收集的懸浮細(xì)胞再次轉(zhuǎn)移至新的6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)貼壁培養(yǎng)24小時(shí)，然后再次收集未貼壁的懸浮細(xì)胞，保留已經(jīng)貼附在培養(yǎng)板中的細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；如此循環(huán)，分別進(jìn)行8、16、24、48和72小時(shí)的不同時(shí)間段貼壁培養(yǎng)，并擴(kuò)增各時(shí)間段貼附的細(xì)胞，直至細(xì)胞在培養(yǎng)板中達(dá)到8090%鋪層。2、用Tryspin-EDTA(GIBCO公司)消化并收獲各時(shí)間段貼附的細(xì)胞，并以0.1。/。W型膠原酶消化的胎盤母體側(cè)蛻膜組織細(xì)胞直接在6孔培養(yǎng)^反中連續(xù)貼壁培養(yǎng)72小時(shí)的貼附細(xì)胞(未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的細(xì)胞)作對(duì)照。收獲的細(xì)胞用磷酸緩沖液(PBS)洗滌一次后懸浮在PBS中。例見表1。表l:不同時(shí)間段貼附細(xì)胞中標(biāo)記性細(xì)胞表面抗原的比例(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>對(duì)照細(xì)胞和在24小時(shí)內(nèi)貼壁分選的細(xì)胞，CD31抗原陽性率較高，而CD90、CD105和CD29抗原陽性率較低，由此推測(cè)在這些細(xì)胞主要為內(nèi)皮細(xì)胞及其它細(xì)胞；在48小時(shí)時(shí)間段才貼附的細(xì)胞CD31抗原陽性率顯著降低，而CD90、CD105和CD29抗原陽性率顯著增加，特別是在72小時(shí)時(shí)間段貼附的細(xì)胞，其CD31抗原陽性率最低，而CD90、CD105和CD29抗原陽性率最高，由此推測(cè)這個(gè)時(shí)間段貼附的大部分細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原特征。實(shí)施例2:篩選細(xì)胞的克隆根據(jù)實(shí)施例1的結(jié)果，篩選經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段(72小時(shí))分選的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞克隆培養(yǎng)。用Tryspin-EDTA消化并收獲72小時(shí)時(shí)間段貼附的細(xì)胞。收獲的細(xì)胞用PBS洗滌一次后懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)基(配制100mL胎牛血清、2mmolL-谷氨酰胺，900mL基礎(chǔ)DMEM-LG培養(yǎng)基混合)中，并進(jìn)行有限稀釋方法進(jìn)行細(xì)胞密度梯度倍釋后，于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞克隆培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞克隆形成后，收集單個(gè)細(xì)胞的克隆，然后轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。參見圖1(A)為單個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞克??；圖1(B)為克隆細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)增鋪層后的細(xì)胞形態(tài)，呈長纖維狀細(xì)胞。收集24孔培養(yǎng)板中鋪層的細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其相應(yīng)的標(biāo)記性表面抗原比例如表l。結(jié)果表明，對(duì)最佳貼壁時(shí)間段貼附細(xì)胞的克隆培養(yǎng)進(jìn)一步提高了CD90、CD105和CD29抗原陽性細(xì)胞的比例。實(shí)施例3:擴(kuò)增能力比較分析收集經(jīng)最佳貼壁時(shí)間革殳(72小時(shí))貼附的細(xì)胞，并以0.1。/。IV型月交原酶消化的胎盤組織細(xì)胞直接在6孔培養(yǎng)板中連續(xù)貼壁培養(yǎng)72小時(shí)的貼附細(xì)胞(未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的貼附細(xì)胞)作對(duì)照，在24孔培養(yǎng)板中用細(xì)胞培養(yǎng)基(配制100mL胎牛血清、2mmolL-谷氨酰胺、900mL基礎(chǔ)DMEM-LG培養(yǎng)基混合)培養(yǎng)，并進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增能力測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2,其中一—表示未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的貼附細(xì)胞，一—表示經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段(72小時(shí))貼附的細(xì)胞。從圖2的比較結(jié)果分析，在經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段(72小時(shí))貼附的細(xì)胞具有顯著的生長優(yōu)勢(shì)細(xì)胞快速生長，在培養(yǎng)的第3天開始出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長期，至第5天基本上達(dá)到鋪層；未進(jìn)行分時(shí)間，歐貼壁分選的貼附細(xì)胞出現(xiàn)生長快速的時(shí)期比較滯后，大約在第6~7出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長期，至第911天才達(dá)到鋪層。在l:3的傳代比例下進(jìn)行傳代能力分析。比較分析兩種貼附細(xì)胞的傳代擴(kuò)增能力，發(fā)現(xiàn)最佳貼壁時(shí)間段(72小時(shí))貼附細(xì)胞能傳1721代，而未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的貼附細(xì)胞僅傳6~8代。至此之后，細(xì)胞逐漸失去擴(kuò)增和分化能力。實(shí)施例4:向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化能力比較收集經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段(72小時(shí))貼附的細(xì)胞以及未進(jìn)行分時(shí)間段貼壁分選的貼附細(xì)胞，分別制備制成單細(xì)胞懸液，以2xl(^個(gè)/培養(yǎng)皿接種于直徑30mm的培養(yǎng)亞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到鋪層8090%時(shí)，用脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液(DMEM-LG培養(yǎng)液900mL,添加100mL胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、10(ig/ml胰島素、lpmol地塞米松、0.5mmo1l-曱基-3-異丁基-黃嘌呤、lOOpmol吲哚美辛)進(jìn)行脂肪細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化；用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(DMEM-LG培養(yǎng)液900mL，添加100mL胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、0.1nmol地塞米松、10mmol卩-甘油磷酸鈉、50pmol2-磷酸-抗壞血酸)進(jìn)行成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)。在脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，第7天起光鏡下可見黃色的圓形脂滴沉著的細(xì)胞，外形變?yōu)閳A形，橢圓形，細(xì)胞核被脂滴擠于一側(cè)。油紅O染色示胞核呈藍(lán)色，脂滴呈紅色。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，脂肪細(xì)胞的比例逐漸增高。但是，通過脂滴OD值測(cè)定分析，兩種貼附細(xì)胞定向分化脂肪細(xì)胞的潛能具有顯著的差異(圖3(A)),72小時(shí)時(shí)間段貼附的細(xì)胞具有比較高的脂肪細(xì)胞分化潛能。在成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，一般從第5天開始，可以看到有細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎叫?，折光性?qiáng)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，立方形的細(xì)胞比例逐漸增高。細(xì)胞繼續(xù)增殖，形成復(fù)層。改良鈣鈷法堿性磷酸酶染色的誘導(dǎo)細(xì)胞胞漿深棕色或深黑色，其中充滿致密的黑色沉淀。但是，通過^5咸性磷酸酶pNP值測(cè)定分析，兩種貼附細(xì)胞定向分化成骨細(xì)胞的潛能具有顯著的差異(圖3(B)),72小時(shí)時(shí)間段貼附的細(xì)胞具有比較高的成骨細(xì)胞分化潛能?？偨Y(jié)(1)本分選技術(shù)有效地富集了成形組織的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段(72小時(shí))的貼附篩選后，CD90陽性細(xì)胞比例達(dá)到89.4%,CD105陽性細(xì)胞比例達(dá)到91.8%，CD29陽性細(xì)胞比例達(dá)到86.6%,并且基本上排除了CD31陽性細(xì)胞。(2)分選的細(xì)胞具有擴(kuò)增和繼代培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)經(jīng)本分選技術(shù)分選的細(xì)胞具有顯著的擴(kuò)增能力。分選細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長期比未分選細(xì)胞要提前34天，由此導(dǎo)致分選細(xì)胞的快速形成細(xì)胞增殖，并在5天左右完成一個(gè)世代的鋪層。(4)擴(kuò)增的分選細(xì)胞具有分化多潛能性最佳貼壁時(shí)間段貼附的細(xì)胞具備較高的分化多潛能性，能定向誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。(3)克隆培養(yǎng)有效促進(jìn)了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的純化效率通過最佳貼壁時(shí)間段分選的貼附細(xì)胞，經(jīng)過克隆培養(yǎng)，能形成高度純化的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞集落。權(quán)利要求1.一種源于成形組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化方法，所述方法包括(1)取成形組織碎片用膠原酶消化，獲得懸浮細(xì)胞，收集所述的懸浮細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)液a中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)4～10小時(shí)，收集未貼附的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞備用；(2)將步驟(1)獲得的未貼附細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)液b中貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)時(shí)間為步驟(1)所述的貼壁培養(yǎng)時(shí)間的1.5～2.5倍，再次收集未貼附的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞備用；(3)步驟(2)獲得的未貼附細(xì)胞重復(fù)步驟(2)的操作1～5次，每次各自貼壁培養(yǎng)時(shí)間為前一次的貼壁培養(yǎng)時(shí)間的1.5～2.5倍，獲得不同時(shí)間段貼附的貼壁細(xì)胞；(4)對(duì)不同時(shí)間段獲得的貼壁細(xì)胞分別培養(yǎng)擴(kuò)增，并分別進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面抗原檢定，篩選獲得具有間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特性貼壁細(xì)胞的最佳貼壁培養(yǎng)時(shí)間段；(5)取在最佳貼壁培養(yǎng)時(shí)間段貼附的貼壁細(xì)胞，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液c中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，獲得純化的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)液a、細(xì)胞培養(yǎng)液b、細(xì)胞培養(yǎng)液c均為添加有體積含量為10。/。胎牛血清和2mML-谷氨酰胺的DMEM-LG培養(yǎng)液。3.如權(quán)利要求l所迷的方法，其特征在于所用膠原酶為IV型膠原酶。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面抗原4企定為對(duì)CD31、CD34、CD45、CD29、CD73、CD90、CD105和CD166中的三種以上抗原的檢定。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述成形組織來自下列之一脂肪、新生兒臍帶、胎盤。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述成形組織來自胎盤。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)取胎盤母體側(cè)蛻膜組織，剪碎，碎片用IV型膠原酶消化，收集細(xì)胞懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液a中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)8小時(shí)，收集未貼附的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞備用；(2)將步驟(1)獲得的未貼附細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)液b中貼壁培養(yǎng)16小時(shí)，再次收集未貼附的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞備用；(3)步驟(2)獲得的未貼附細(xì)胞重復(fù)步驟(2)的操作3次，各次貼壁培養(yǎng)時(shí)間依次為24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，分別獲得不同時(shí)間段貼附的貼壁細(xì)胞；(4)對(duì)不同時(shí)間段獲得的貼壁細(xì)胞分別培養(yǎng)擴(kuò)增，并分別進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面抗原檢定，篩選獲得具有間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特性貼壁細(xì)胞的最佳貼壁培養(yǎng)時(shí)間段；(5)取在最佳貼壁培養(yǎng)時(shí)間段貼附的貼壁細(xì)胞，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液c中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，獲得純化的蛻膜組織間充質(zhì)干細(xì)胞；所述細(xì)胞培養(yǎng)液a細(xì)胞培養(yǎng)液b、細(xì)胞培養(yǎng)液c均為添加體積含量為10%胎牛血清和2mML-谷氨酰胺的DMEM-LG培養(yǎng)液。全文摘要本發(fā)明提供了一種源于成形組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化方法，本方法依據(jù)成形組織中不同種類細(xì)胞的貼附能力差異，進(jìn)行分時(shí)間段貼壁篩選，通過不同時(shí)間段貼附細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面抗原檢定后，篩選最佳貼壁時(shí)間段的貼附細(xì)胞，并收集和懸浮細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞集落形成的克隆培養(yǎng)，獲得純化的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明方法可達(dá)到比較好的分選效果；(2)對(duì)最佳貼壁時(shí)間段分選的細(xì)胞采用單個(gè)細(xì)胞克隆方法進(jìn)一步提高了成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞的純化效率；(3)經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段分選的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的增殖潛能；(4)經(jīng)最佳貼壁時(shí)間段分選的成形組織間充質(zhì)干細(xì)胞具有顯著的多分化潛能。文檔編號(hào)C12N5/08GK101531996SQ200910097099公開日2009年9月16日申請(qǐng)日期2009年4月1日優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日發(fā)明者王金福,袁文佶申請(qǐng)人:浙江大學(xué)