專利名稱：：一種抗腫瘤融合基因及其表達蛋白與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種抗腫瘤融合基因及其表達蛋白與應用。
背景技術：
：惡性腫瘤是威脅人類的常見病。近年來，針對受體、基因或關鍵物質的靶向性治療藥物成為藥物研制的重要方向。這類藥物主要靶向作用于相關的腫瘤細胞上，它在提高對腫瘤細胞的殺傷力同時可減少對正常組織細胞的不良作用，被認為是未來癌癥治療中最具前景的研究方向。CXCL10是指在外源性因素(脂多糖等)或內源性炎性因子(IL-1、IFN-a、IFN-y)等刺激下，由多種細胞分泌、表達的細胞趨化因子。CXCL10具有顯著的抗腫瘤活性，主要包括以下兩方面介導活化的免疫效應細胞(主要是T淋巴細胞及NK細胞)向CXCL10的高濃度區(qū)進行定向運動；抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖、分化，抑制肺瘤的增殖及轉移。表皮生長因子受體(EGFR)在很多腫瘤細胞表面特異性高表達(可達正常細胞的100倍)，其配體EGF含有三個保守的環(huán)狀結構，其中第三環(huán)是與EGFR結合的部位，又稱為EGF受體干擾序列。大量研究已經(jīng)證實此干擾序列可與EGFR結合，但不具有EGF所具有的刺激腫瘤細胞增殖的活性。中國專利文獻CN101200502A公開了一種用于治療人類疾病的干擾素誘導型蛋白-IO(IP-!0或CXCL10)趨化因子類似物的方法，它們可與以CXCR3受體或IP-10類似物作為配體的任何其他受體相結合，因此此類似物可以作為IP-IO趨化因子的激動劑或拮抗劑，也可以被用于預防、治療、或緩解疾病的癥狀。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及CXCL10-EGF融合基因及其可溶性表達和用途，具體包括所述融合基因的PCR擴增、融合基因轉入克隆載體、構建融合基因的表達重組體及工程菌、由此工程菌表達的融合蛋白(即重組人CXCL10-EGF融合蛋白)的分離純化及此蛋白耙向性抗腫瘤的藥物用途。根據(jù)EGF受體干擾序列，本發(fā)明構建了人CXCL10-loop3-EGF(以下簡稱重組CXCL10-EGF)融合基因，并誘導其在大腸桿菌中表達。此融合基因表達的融合蛋白以EGF受體干擾序列編碼蛋白作為導向蛋白，既增強此融合蛋白對腫瘤細胞的特異性親和力，并通過竟爭性抑制干擾了天然構象EGF對腫瘤細胞生長、增殖的刺激作用，又融合了CXCL10趨化腫瘤殺傷效應細胞及抑制新生血管的生成的功能，從而更大程度上地發(fā)揮了兩者的抗腫瘤生物效應。本發(fā)明的技術方案通過下述方法和步驟實現(xiàn)一種抗腫瘤融合基因，其特征在于該融合基因的核苷酸序列是SEQIDNO:l。所述的抗腫瘤融合基因的表達蛋白屬于本發(fā)明保護范圍。所述抗腫瘤融合基因的表達載體及宿主菌也屬于本發(fā)明保護范圍，表達載體可是包含該抗腫瘤基因的質粒，宿主菌可選用大腸桿菌。所述的抗腫瘤融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的詳細描述1、運用RT-PCR擴增人CXCL10基因從健康獻血者的外周血單個核細胞(PBMC)中提取mRNA，經(jīng)過RT-PCR反應擴增獲得hCXCL10基因片斷。瓊脂糖凝膠電泳鑒定及擴增產物割膠回收純化。2、重組CXCL10-EGF融合基因的獲得設計3條引物FI、FII和FIII。采用引物4荅橋法和兩步PCR法以純化后的hCXCL10為才莫板擴增融合基因CXCL10-EGF，并將該融合基因與pTG19-T載體連接構建重組pTG19-T-CXCL10-EGF質粒，轉化大腸桿菌DH5a，經(jīng)X-gal和IPTG篩選陽性菌落。3、構建CXCL10-EGF融合基因的重組表達載體分別設計上下游引物，菌落PCR擴增CXCL10-EGF基因，經(jīng)雙酶切回收產物片斷后與同樣經(jīng)過雙酶切的表達載體pET32a(+)體外連接。構建重組pET32a(+)-CXCL10-EGF質粒，轉化宿主菌大腸桿菌OrigamiB(DE3),篩選陽性克隆；提取重組質粒送DNA測序分析。4、重組his-CXCL10-EGF融合蛋白在工程菌中的表達用IPTG誘導重組his-CXCL10-EGF融合蛋白表達；融合蛋白以可溶的形式表達于菌體胞漿中，表達水平達30~40%。SDS-PAGE、WesternBlot鑒定表達蛋白正確。5、融合蛋白his-CXCL10-EGF的純化、酶切收集大量表達his-CXCL10-EGF融合蛋白的宿主菌，超聲破碎、分離上清中的可溶性表達的融合蛋白，經(jīng)過鎳柱親和層析純化融合蛋白，再通過腸激酶酶切去除融合蛋白上his標簽、再次過鎳柱親和層析獲得不帶標簽的成熟CXCL10-EGF融合蛋白。6、通過CXCL10-EGF融合蛋白對活化PBMC的趨化活性實驗及HUVEC血管形成抑制實驗驗證此蛋白的抗腫瘤功能。本發(fā)明提供了一種具有結合EGF受體、干擾EGF對腫瘤細胞的刺激效應，同時又具有CXCLIO活性的雙功能融合蛋白，為治療EGFR高表達的腫瘤提供一種新的低毒性高效的靶向性藥物。本發(fā)明還提供了包含人CXCL10-EGF融合基因重組體的構建及含該基因的表達型重組體的工程菌誘導表達的方法，為重組人CXCL10-EGF融合蛋白的大M^莫制備、純化提供了技術路線。圖1是重組pET32a(+)-CXCL10-EGF質粒筌定圖。圖2是重組his-CXCL10-EGF融合蛋白SDS-PAGE圖。圖3是重組his-CXCL10-EGF融合蛋白WesternBlot圖。圖4是重組his-CXCL10-EGF融合蛋白純化后SDS-PAGE圖。圖5是重組his-CXCL10-EGF融合蛋白酶切SDS-PAGE圖。圖6是酶切后重組CXCL10-EGF融合蛋白WesternBlot圖。圖7是HUVEC血管形成抑制實驗圖。具體實施例方式以下結合附圖對本發(fā)明的技術路線做進一步的闡述，但不僅僅局限于所述的實施例實施例l:編碼重組人CXCLIO-EGF蛋白的基因獲得(1)hCXCL10基因的獲得健康體檢者靜脈血5mL,等量生理鹽水稀釋后，用淋巴細胞分離液進行密度梯度離心，收集外周血單個核細胞(PBMC)，經(jīng)IFN-Y(2000U/mL)刺激4h;Trizol抽提細胞總RNA,RT-PCR擴增人CXCLIO基因。逆轉錄反應體系20uL,取lug總RNA作為模板，用OligdT為引物，按常規(guī)方法進行擴增。根據(jù)Genebank上發(fā)表的hCXCLlOcDNA序歹'J，利用Primer5.0軟件設計PCR引物。上游引物Pl:5'國GAGCCTACAGCAGAGGAACC-3';下游引物P2:5'-TTTGCTCCCCTCTGGTTTTA-3',其擴增片斷包含完整hCXCL10的編碼區(qū)。PCR^應條件為95。C5min預變性，94°C45s、58°C45s、72°Clmin，30個循環(huán)，72°C10min延伸；反應體系為50jnL,各成分常規(guī)配制，使用的擴增酶是Taq酶。PCR擴增產物以L2。/。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并割膠純化回收得到346bp左右的DNA片斷。(2)重組CXCL10-EGF融合基因的獲得設計了FI、FII和FIII三條引物，均由上海捷瑞生物公司合成。上游引物FI為5，-GTACCTCTCTCTAGAACCGTACG-3，；下游引物FII為5'-TACTGACATCGCTCCCCGATGTAGCCAACAACACAGTTGGAACCACCGCCACCAGGAGATCTTTTA-3，；下游引物FIII為5'-TTATCATTCCCACCACTTCAGGTCTCGGTACTGACATCGCTCCC-3，采用引物搭橋法和兩步PCR法擴增融合基因CXCL10-EGF:首先以純化后CXCL10基因為模板，以FI、FII為引物，按常規(guī)方法進行PCR擴增284bp基因序列；然后以該基因序列為才莫板，以FI、FIII為引物，用ExTaqPCR試劑盒再次進行PCR擴增，得到312bp的CXCL10-EGF融合基因，并將該融合基因與pTG19-T載體連接構建重組pTG19-T-CXCL10-EGF質粒。重組質粒轉化大腸桿菌DH5a,經(jīng)X-gal和IPTG誘導藍白篩選平板上的白色陽性菌落。4兆取白色單克隆菌落轉移至5mLLB培養(yǎng)液中37。C搖床搖菌培養(yǎng)8h。人CXCL10-EGF融合基因的DNA序列為1gtacctctctctagaactgtacgctgtacctgcatcagcattagtaatcaacctgttaat61ccaaggtctttagaaaaacttgaaattattcctgcaagccaa加gtccacgtgtcgag121atcattgctacaatgaaaaagaagggtgagaagagatgtctgaatccagaatcgaaggcc181atcaagaatttactgaaagcagttagcaaggaaaggtctaaaagatctcctggtggcggt241ggttccaactgtgttgttggctacatcggggagcgatgtcagtaccgagacctgaagtgg301tgggaatgataa重組CXCL10-EGF融合基因編碼的氨基齡列為GEKRCLNPES認KNLLKAVSKERSKRSPGGGGSNCVVGYIGERCQYRDLKWWE**實施例2:融合基因CXCL10-EGF表達型重組體pET32a(+)-CXCL10-EGF的構建分別設計上下游引物從含有重組pTG19-T-CXCL10-EGF質粒的陽性菌落中PCR擴增CXCL10-EGF全長基因pl:5'-GTGGAATTCGTACCTCTCTCTAGAACTGTACGC-3，；p2:5，-TTATCATTCCCACCACTCTCGAGTCT-3，，兩端分別引入EcolI及XholI酶切位點，經(jīng)膠回收后分別以EcolI及XholI雙酶切，回收產物片斷與同樣經(jīng)雙酶切的pET32a(+)載體連接，構建重組pET32a(+)-CXCL10-EGF表達載體。重組pET32a(+)-CXCL10-EGF質粒酶切鑒定結果如圖l所示，其中條帶1為DNAladder;條帶2為質粒pET32a(+)-CXCL10-EGF經(jīng)Eco1I及XholI雙酶切的圖i普。實施例3:重組his-CXCL10-EGF融合蛋白在大腸桿菌中的表達與鑒定將pET32a(+)-CXCL10-EGF表達載體轉化宿主菌大腸桿菌OrigamiB(DE3),構建工程菌pET32a(+)-CXCL10-EGF/OrigamiB(DE3)，將此工程菌接種于5mLLB培養(yǎng)液(含100ug/mL氨節(jié)青霉素)37t:振搖培養(yǎng)過夜，分別取2mL菌液抽提質粒送測序鑒定及10jnL重新接種入8mLLB培養(yǎng)液(含100ug/mL氨節(jié)青霉素)37。C振搖培養(yǎng)，至菌懸液OD6oo達到0.6時，取出2mL放入試管l，其余加入終濃度為0.05mmol/L的IPTG于25。C誘導8h，各取出2mL放入試管2及試管3。將試管3的菌液12000rpm離心1Omin后棄上清，以20mmol/LTris-HCl(pH8.0)洗涂3次。以超聲裂解緩沖液(含lmmol/LPMSF、lmg/mL溶菌酶、20mmol/LTris-HCl緩沖液，pH8.0)lmL懸浮細菌反復凍融3次后進行超聲裂菌(超聲時間5s，間隔時間5s，功率為400W,共10~20次，視菌體濃度而定)，至菌體清亮為止，12000rpmx10min分別收集上清和沉淀，沉淀加入200uL的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)混勻。以上試管l取全菌、試管3取收集的上清(可溶性表達)和沉淀(包涵體表達)、試管2取全菌分別加入上樣緩沖液(50mmol/LTris-HCl，pH6.8，100mmol/DDT,2%SDS，0.10/0溴酚藍，10%甘油)混勻，100°C沸水浴保持10min，10000rpmx3min,取上清(5/i1)進行聚丙烯敞胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。并通過考馬斯亮藍R-25,0染色后，觀察分析，并照相記錄重組his-CXCL10-EGF融合蛋白的表達情況(其中Ws為質粒pET32a(+)上所攜帶的標簽蛋白，用于蛋白純化)，其SDS-PAGE電泳結果見圖2，其中條帶l為蛋白Mark,條帶2為經(jīng)IPTG誘導表達的總蛋白(試管2)，條帶3為經(jīng)IPTG誘導呈可溶性表達的總蛋白(試管3上清)，條帶4為經(jīng)IPTG誘導呈包涵體表達的總蛋白(試管3沉淀)，條帶5為未經(jīng)IPTG誘導表達的總蛋白(試管l)。WesternBlot分析未經(jīng)IPTG誘導表達的總蛋白(試管l)及經(jīng)IPTG誘導呈可溶性表達的總蛋白(試管3上清)以12。/。SDS-PAGE進行電泳以250mAx30min條件，將蛋白轉移至PVDF膜上，膜以封閉液(含5。/。脫脂奶粉和0.5。/。Tween-20的PBS，pH7.5)于4。C封閉過夜后，加入以封閉液稀釋(1:1000)的小鼠抗人CXCL10單抗，于室溫溫育2h，用封閉液洗膜3次后加入以封閉液稀釋(1:1000)的HRP-羊抗小鼠lgG于室溫孵育2h，分別用TBST(20mmol/LTris-HCl、50Ommol/LNaCl、0.25%Tween-20,pH7.4)及TBS(20mmol/LTris-HCl、50Ommol/LNaCl，pH7.4)洗膜3次后，加入DAB顯色液避光顯色10min,其WesternBlot結果見圖4，其中條帶l為蛋白Mark，條帶2為未經(jīng)IPTG誘導，條帶3為經(jīng)IPTG誘導。實施例4:工程菌的大量培養(yǎng)及重組his-CXCL10-EGF融合蛋白的純化(1)工程菌大量培養(yǎng)工程菌pET32a(+)-CXCL10-EGF/OrigamiB(DE3)t妄種入200mlLB(含100ug/mL氨節(jié)青霉素)培養(yǎng)液中37。C搖床培養(yǎng)。蛋白獲取條件及方法同上。(2)可溶性表達融合蛋白his-CXCL10-EGF的純化、除鹽及濃縮將初步純化的可溶性his-CXCL10-EGF融合蛋白經(jīng)0.45um濾器過濾后，開始進行鎳柱親和層析，流速調整為每小時10個柱體積。樣品與等體積2x結合緩沖液(500mmol/LNaCl、20mmol/LTris-HCl、20mmol/L咪唑，pH-7.9)混合后，上經(jīng)洗滌緩沖液(500mmol/LNaCl、20mmol/LTris-HCl、20mmol/L咪唑，pH=7.9)預洗滌5個柱體積的鎳親和層析柱。用4個柱體積的洗脫緩沖液(500mmol/LNaCl、20mmol/LTris-HCl、200mmol/L咪唑，pH=7.9)洗脫結合的蛋白，分管收集洗脫蛋白lmL/管，直至流過液A2500.01。用6個柱體積的結合緩沖液洗柱。對收集過柱純化后的樣品進行SDS-PAGE電泳鑒定。將鑒定正確的樣本'管轉入截留分子量為5KD的超濾管中以5000g，離心15min除鹽及濃縮成(1/20)倍體積，留取濃縮后蛋白進行SDS-PAGE電泳鑒定，鑒定結果如圖3所示，其中條帶l為蛋白Mark,條帶2為純化后的重組his-CXCL10-EGF(29KD)融合蛋白。(3)腸激酶酶切及重組CXCL10-EGF融合蛋白純化、除鹽及濃縮濃縮后重組his-CXCL10-EGF融合蛋白經(jīng)蛋白定量后加入腸激酶(每50ug蛋白加入lU腸激酶)，16。C酶切16h切下his標簽和硫氧還原蛋白成為成熟的重組融合蛋白CXCL10-EGF。酶切產物過鎳親和層析柱去除his標簽，步驟同上，但分管收集的是穿透液。進行SDS-PAGE電泳鑒定；將鑒定正確的樣本轉入截留分子量為5KD的超濾管中以5000g離心力離心15min除鹽及濃縮成(1/20)倍體積。SDS-PAGE電泳鑒定結果見圖5，其中條帶l為蛋白Mark,條帶2為重組his-CXCL10-EGF融合蛋白，條帶3為重組his-CXCL10-EGF融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切16h，條帶4為重組CXCL10-EGF融合蛋白酶切后過柱純化產物。(4)透析將濃縮蛋白轉入透析袋(截留蛋白分子量為3KD)中，以PB緩沖液(0.2mol/LNaH2P04、0.2mol/LNa2HP04，pH=7.4)透析24h，每3h更換新的PB緩沖液。透析后蛋白進行WestemBlot鑒定，結果如圖6，其中條帶1為蛋白Mark，條帶2為重組CXCL10-EGF融合蛋白。(6)Transwell細胞趨化實驗采用密度梯度離心法從人淋巴細胞分離液/人外周血中分離PBMC。經(jīng)PHA(8ug/ml)刺激3d后使其中淋巴細胞活化。根據(jù)Transwe11趨化小室下層是否培養(yǎng)A431細胞將趨化實驗分為2組(1)A431細胞組該組又繼續(xù)分為4組，小室下層分別進行如下處理實驗組加入融合蛋白CXCL10-EGF(100ng/ml)、阻斷實'瞼組先加入HumanEGF標準蛋白(100ng/ml)4h后換液并加入融合蛋白CXCL10-EGF(100ng/ml);以上兩組細胞于培養(yǎng)3h后均換液以去除處理因素。陽性對照組加入HumanCXCL10標準蛋白(100ng/ml)，陰性對照組不加任何蛋白；每組重復3個孔。(2)無A431細胞組該組又分為3組，小室下層分別進行如下處理實-瞼組加入融合蛋白CXCL10-EGF(100ng/ml)、陽性對照組加入HumanCXCL10標準蛋白U00ng/ml)、陰性對照不加任何蛋白；每組3個孔。在小室上層底部鋪Matrigel(100/ii/孔，冰上操作)，37。C孵育lh待Matrigel凝固后，在其上加入預先活化的PBMC(5x105/孔，200juL)。才艮椐分組情況進行趨化實驗。鏡下觀察PBMC是否趨化至小室下層，趨化12h后，拍照記錄，并收集下層PBMC細胞并計數(shù)，計算趨化指數(shù)(chemotaticindex,CI)，統(tǒng)計分析趨化效應。CI-實驗組趨化至下室的上層細胞凄^/對照組趨化至下次的上層細胞數(shù)，當CI22時判斷為有趨化效應，實驗結果見表l。(7)HUVEC血管形成/抑制實驗按M丄ourdesPonce的方法進行。加入梯度稀釋的重組CXCL10-EGF融合蛋白或HumanCXCL10標準蛋白(20ul/孔)Ong/mh50ng/ml、100ng/ml;每個梯度重復3個孔。4竟下觀察HUVEC形成血管情況，并拍照記i,結果如圖7所示，其中A、B、C為CXCL10-EGFC融合蠆-白處理組，濃度依次為Ong/ml、50ng/ml、100ng/ml，D、E、F為HumanCXCL10蛋白處理組，濃度依次為Ong/ml、50ng/ml、100ng/ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><110>浙江省臺州醫(yī)院<120>—種抗肺瘤融合基因及其表達蛋白與應用<130><160>1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>324<212>DNA<213>人工序列<400>1gaattcgtacctctctctagaactgtacgctgtacctgcatcagcattagtaatcaacct60gttaatccaaggtctttagaaaaacttgaaattattcctgcaagccaattttgtccacgt120gtcgagatcattgctacaatgaaaaagaagggtgagaagagatgtctgaatccagaatcg180aaggccatcaagaatttactgaaagcagttagcaaggaaaggtctaaaagatctcctggt240ggcggtggttccaactgtgttgttggctacatcggggagcgatgtcagtaccgagacctg300aagtggtgggaatgataactcgag32權利要求1、一種抗腫瘤融合基因，其特征在于該融合基因的核苷酸序列是SEQIDNO1。2、權利要求1所述的抗腫瘤融合基因的表達蛋白。3、含有權利要求1所述抗腫瘤融合基因的表達載體。4、含有權利要求1所述抗腫瘤融合基因的宿主菌。5、權利要求2所述的抗腫瘤融合基因的表達蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種抗腫瘤融合基因及其表達蛋白與應用。本發(fā)明提供了包含人CXCL10-EGF融合基因重組體的構建，以及含該基因的表達型重組體的工程菌中融合蛋白CXCL10-EGF的誘導表達，為重組人CXCL10-EGF融合蛋白的大規(guī)模制備、純化提供了技術路線。本發(fā)明還提供了其表達蛋白在抗腫瘤藥物中的應用。文檔編號C12N15/62GK101654679SQ20091009765公開日2010年2月24日申請日期2009年4月16日優(yōu)先權日2009年4月16日發(fā)明者波沈申請人:浙江省臺州醫(yī)院