專利名稱：叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種叢枝菌根真菌孢子的高密 度純種生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhizae， AM)是自然界中普遍存在的，與80% 以上陸地植物共生的真菌。在自然界中，AM真菌的寄主和分布范圍均很廣泛， 能與絕大多數(shù)植物形成共生關(guān)系，至今已發(fā)現(xiàn)150多種AM真菌能與植物形成共 生體，是菌根中最普遍的類型之一。它與宿主植物互惠共生真菌的根外菌絲 從土壤中吸收磷素及其它營養(yǎng)元素供給宿主植物，改善了植物對礦質(zhì)元素的吸 收能力，促進植物生長等，宿主植物則供給真菌生長所必需的碳水化合物。由 于AM真菌在植物生存中的重要地位，同時作為一種生物技術(shù)措施，其在農(nóng)林業(yè)、 綠化和環(huán)境保護等方面的應(yīng)用前景是十分廣闊的，世界各國對它的應(yīng)用均寄予 了很高的期望。因此，叢枝菌根逐步發(fā)展成為了一個十分活躍的研究領(lǐng)域，國 內(nèi)外學(xué)者對其資源、分類、生理生態(tài)及其應(yīng)用等方面進行了廣泛的探索與研究。
目前美洲、歐洲、亞洲、太平洋等發(fā)達國家和發(fā)展中國家都在加緊研究AM 菌根真菌在農(nóng)林業(yè)、綠化和環(huán)境保護等領(lǐng)域中的應(yīng)用途徑和方法，近年來已取 得了較快的進展。由于AM真菌是專性共生真菌，自身不能合成DNA，到目前為 止，該真菌的純培養(yǎng)尚未取得成功，所以不能像外生菌根真菌那樣通過工業(yè)發(fā) 酵大規(guī)模地生產(chǎn)接種菌劑。只能將其接種在植物根系上，經(jīng)過2—4個月的共生 培養(yǎng)，與宿主植物一起生長發(fā)育，才能得到其繁殖體。AM菌劑生產(chǎn)的方法，概括起來有以下幾種:盆栽培養(yǎng)法、靜止培養(yǎng)法、流動液培養(yǎng)法、噴霧培養(yǎng)法、大 田培養(yǎng)法等，其中盆栽培養(yǎng)法在目前仍是一種最傳統(tǒng)經(jīng)濟的方法。目前已有一 些國家真菌制劑的生產(chǎn)應(yīng)用已經(jīng)商品化，如美國、英國、法國、日本等國均有 AM菌劑出售，他們的制劑純度高，質(zhì)量好，大都通過嚴(yán)格控制各種環(huán)境因子進 行溫室工廠化生產(chǎn)；如英國洛桑農(nóng)業(yè)研究中心生產(chǎn)出名為AM菌劑已經(jīng)在英國、 法國、丹麥、荷蘭和日本等國家廣泛地運用于蔬菜、花卉、果樹等；同時在新 西蘭和澳大利亞的牧草生產(chǎn)上均獲得了顯著的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。但中國目 前還沒有工廠化商業(yè)菌劑生產(chǎn)，因此AM真菌菌根的高效培養(yǎng)技術(shù)對我國的農(nóng)林 業(yè)、環(huán)境保護等都具有深遠(yuǎn)的意義。
叢枝菌根真菌常規(guī)培養(yǎng)方法主要是采用土攘或者河砂為基質(zhì)，單一作物(如 玉米、三葉草)為寄主植物。菌根真菌的培養(yǎng)效率可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基質(zhì)的組 成和培養(yǎng)條件得到提高，Atimanav等比較了不同粒徑的膨脹礦物材料對叢枝菌 根真菌生產(chǎn)的影響(At imanav Gaur， A. dholeya. Effects of the particle size of soil-less substrates upon AM fungus inoculum production 2000， 10: 43—48);英國PLANT W0RK公司(www. Plantworksuk.uk )采用一種膨脹礦物 作為基質(zhì)培養(yǎng)叢枝菌根真菌，同時在培養(yǎng)過程中使用了緩釋性磷肥控制和調(diào)節(jié) 植物與菌根真菌的生長。這些方法大多采用單一膨脹礦物或膨脹礦物加草碳的 方式，培養(yǎng)效率不夠高。文獻(Sylvia, D. M. and D. H. Hubbell. 1986. Growth and sporula/tion of vesicular-arbusculeir mycorrhizal fungi in aeroponic and membrane systems. Symbiosis 1: 259-267)采用氣霧法培養(yǎng)菌劑，在密 閉的容器中用霧化裝裝置將營養(yǎng)液變成氣霧噴在侵染有菌根真菌的植物根系 上，獲得純凈的菌荊。這個方法的優(yōu)點是可以獲得十分純凈的菌劑，但是成本 高、產(chǎn)量低。叢枝菌根真菌菌劑商業(yè)化生產(chǎn)都是采用在溫室條件下將寄主植物與叢枝菌
根真菌共同培養(yǎng)4-5個月的方式進行，由于叢枝菌根真菌不能離開宿主植物單獨 培養(yǎng)，因此該菌劑大規(guī)模生產(chǎn)十分困難，且寄主植物的類型、培養(yǎng)基質(zhì)的配方、 培養(yǎng)條件均為生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明目的在于提供一種能夠大規(guī)模生產(chǎn)，成 本低，產(chǎn)量高的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法的技術(shù)方案。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下工
藝步驟
1) 將毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根的根組織培養(yǎng)在改進合成培養(yǎng)基 中，在黑暗中，溫度23-25"C條件下，培養(yǎng)5 — 7個星期；
2) 將上述培養(yǎng)的毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根的根組織轉(zhuǎn)接至新的 改進合成培養(yǎng)基中，再在培養(yǎng)基中接種叢枝菌根真菌，叢枝菌根真菌接種孢子 量為300-500個/mL，在黑暗中，溫度23-25。C條件下，培養(yǎng)7-IO個星期；
3) 在步驟2)的培養(yǎng)基中取含有被叢枝菌根真菌侵染的根、菌絲和孢子的 直徑為1.5-2.5cm的培養(yǎng)物移種至專用培養(yǎng)盒中含有改進合成培養(yǎng)基的一室， 并把新鮮培養(yǎng)的毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根的根組織移種至培養(yǎng)物旁， 所述的專用培養(yǎng)盒為兩室培養(yǎng)盒，兩室之間設(shè)置350-450目的橫隔網(wǎng)，專用培 養(yǎng)盒另一室中含有叢枝菌根真菌RT培養(yǎng)基，將上述的培養(yǎng)物在黑暗中，溫度 23-25t:條件下，培養(yǎng)7-IO個星期；
4) 取上述專用培養(yǎng)盒含有叢枝菌根真菌RT培養(yǎng)基一室中的孢子和菌絲體， 溶解于8-ll毫摩爾無菌檸檬酸鈉溶液中，并調(diào)pH至5. 5-6. 5，充分?jǐn)嚢?，再傾 倒于無菌的0. 45um孔徑的篩子，用無菌水洗滌至只剩孢子和菌絲體；5)取上述得到的孢子和菌絲體，用篩子收集孢子，清洗干凈后，浸泡于含 有鏈霉素100-300 mg/L和慶大霉素50-200mg/L的20°/。的甘油無菌溶液中保存。
所述的叢枝菌根真菌孢'子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于所述的改進 合成培養(yǎng)基含有硫酸鎂720-740mg/L、硝酸鉀70-90 mg/L、氯化鉀55-75 mg/L、 硝酸鈣270-290mg/L、 EDTA鐵鈉鹽5-12mg/L、肌醇40-60 mg/L、硫酸錳 0. 01-0. 08 mg/L、硫酸銅0. 01-0. 03 mg/L、硼酸0. 3-0. 6 mg/L、硫酸鋅0. 1-0. 4 mg/L、碘化鉀0. 01-0. 03mg/L、鉬酸鈉0. 01-0. 03 mg/L、氯化鈷0. 01-0. 04 mg/L、 維生素BO. 1-0. 3mg/L 、卩必哆醇0. 1-0. 3mg/L、煙酸0.2-0.8 mg/L、蔗糖 7500-8500mg/L、葡萄糖4500-5500mg/L和植物膠3500-4500mg/L。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于所述的改進 合成培養(yǎng)基含有硫酸鎂725-735mg/L、硝酸鉀75-85 mg/L、氯化鉀60-70 mg/L、 硝酸韓275-285mg/L、 EDTA鐵鈉鹽7-9mg/L 、肌醇45-55mg/L 、硫酸錳 0. 01-0. 05mg/L、硫酸銅0. 01-0. 02mg/L、硼酸0. 4-0. 5mg/L、硫酸鋅0. 2-0. 3 mg/L、碘化鉀0. 01-0. 02mg/L、鉬酸鈉0. 01-0. 02 mg/L、氯化鈷0. 02-0. 03 mg/L、 維生素BO. l-0.2mg/L、卩必哆醇0. l-0.2mg/L、煙酸0.4-0.6 mg/L 、蔗糖 7800-8200mg/L、葡萄糖4800-5200mg/L和植物膠3700-4200mg/L。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于步驟2)中叢 枝菌根真菌為叢枝菌根真菌的球囊霉屬，叢枝菌根真菌接種孢子的量為350-450 個/mL，培養(yǎng)溫度為23.5-24.5'C條件下，培養(yǎng)8-9個星期。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于步驟2)中叢 枝菌根真菌為根內(nèi)球囊霉。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于步驟3)中專 用培養(yǎng)盒中間設(shè)置的橫隔網(wǎng)為370-400目，培養(yǎng)條件為在黑暗中，溫度23.5-24.5X:條件下，培養(yǎng)8-9個星期。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于步驟3)中叢 枝菌根真菌RT培養(yǎng)基為在改進合成培養(yǎng)基中減少蔗糖和葡萄糖兩個組分，并加 入培養(yǎng)基重量0. 1-0. 2%的酒石酸氨和培養(yǎng)基體積2-5%的根浸出液。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于步驟4)專用 培養(yǎng)盒含有叢枝菌根真菌培養(yǎng)基一室中的孢子和菌絲體，溶解于9-10毫摩爾無 菌檸檬酸鈉溶液中，并調(diào)pH至5.8-6.2。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于步驟5)中 20%的甘油無菌溶液中含有鏈霉素150-250 mg/L和慶大霉素100-150mg/L。
所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于根浸出液為 培養(yǎng)毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根組織得到的液體。
本發(fā)明通過配置改進合成培養(yǎng)基及采用專用的培養(yǎng)盒進行叢枝菌根真菌的 培養(yǎng)，與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的優(yōu)點在于l培養(yǎng)基是無菌環(huán)境的，成本低 廉，既滿足寄主植物生長又適合AM真菌生長；2寄主植物生長營養(yǎng)要求低，可 以在合成培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)；3由該方法培養(yǎng)的孢子(含有菌絲體)是無污染純 種培養(yǎng)物；4生產(chǎn)的孢子保存于液體中，可以保持90%活性以上。本技術(shù)生產(chǎn)出 的孢子可以用于菌根菌劑的繁殖，生物肥料的生產(chǎn)，以及科研上提供無污染的 純種孢子，用于基礎(chǔ)研究。
具體實施例方式
以下通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明。叢枝菌根真菌在市場上均有售， 毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根的技術(shù)均為現(xiàn)有技術(shù)。 實施例 l.培養(yǎng)基配制用于培養(yǎng)毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根和叢枝菌根真菌的培養(yǎng)基組 成(組分濃度為mg/L，用超凈水配制)
硫酸鎂731硝酸鉀80
氯化鉀65硝酸鈣288
EDTA鐵鈉鹽8肌醇50
硫酸錳0. 04硫酸銅0. 025
硼酸0. 45硫酸鋅0. 22
碘化鉀0. 01鉬酸鈉0. 02
氯化鈷0. 025維生素B0. 1
秘口多醇0. 1煙酸0. 5
蔗糖■0葡萄糖5000
其中Mn和Zn控制在非常低的濃度。這兩種元素能抑制孢子的萌發(fā)。培養(yǎng) 基加4000mg/L植物膠(約占培養(yǎng)基重量的0.4%)凝固，因為植物膠中含有高磷 濃度，所以在培養(yǎng)基中省去KH2P04。培養(yǎng)基在l公斤壓力，12rC滅菌20min。叢 枝菌根真菌RT培養(yǎng)基配制就是在改進合成培養(yǎng)基中減少蔗糖和葡萄糖這兩個組 分并加入酒石酸氨和根浸出液。
2. 根組織培養(yǎng)
將毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根培養(yǎng)在如上培養(yǎng)基中，在黑暗中，溫 度24'C下，培養(yǎng)5個星期，培養(yǎng)至根組織長滿整個培養(yǎng)皿(15cm直徑)，再將根 組織轉(zhuǎn)接至新的改進合成培養(yǎng)基中，同時在培養(yǎng)基中接種根內(nèi)球囊霉，接種量 為400個/ml，在黑暗中，溫度24。C下，培養(yǎng)8個星期。
3. 移種和孢子繁殖
取上述的培養(yǎng)基中含有被叢枝菌根真菌侵染的根、菌絲和孢子的一小塊的培養(yǎng)物移接至兩室不銹鋼培養(yǎng)盒的其中一室，這一室中含有改進合成培養(yǎng)基，
同時把鮮新培養(yǎng)的根組織移種至該小塊接種物旁邊；而培養(yǎng)皿的另外一室含有 叢枝菌根真菌RT培養(yǎng)基，叢枝菌根真菌RT培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基重量O. 1%或0.2%的 酒石酸氨和培養(yǎng)基體積2%、 3%或5%的根浸出液(含倍半萜素)，并且中間橫隔 網(wǎng)400目不讓根生長至這一室。于是在黑暗中，溫度24'C下培養(yǎng)8個星期后，真 菌菌絲就爬過中間橫隔在另一室繁衍生長。
4. 孢子收獲
在含有叢枝菌根真菌RT培養(yǎng)基的另一室培養(yǎng)基培養(yǎng)成熟后的孢子連同培養(yǎng) 基一起溶解于10mM無菌檸檬酸鈉溶液中，并調(diào)pH至6.0，在磁力攪拌器中充分?jǐn)?拌使固體膠溶解，再傾倒于無菌的0.45um孔徑的篩子上，用無菌水洗滌至只有 孢子和菌絲體。
5. 孢子保存
用篩子收集孢子，清洗干凈后，就可以浸泡于含有20%甘油、鏈霉素 (200mg/L)、慶大霉素(100mg/L)的無菌溶液中，在4。C下可以保存1年以上。
孢子數(shù)量檢測可以采用體視顯微鏡放大20倍觀察計數(shù)。產(chǎn)品可以分為孢子 數(shù)量為1000個/ml， 5000個/ml和10000個/ml三個不同規(guī)格，本發(fā)明以前的技術(shù)的 得到的孢子數(shù)100-120個/ml，而本發(fā)明技術(shù)得到的孢子數(shù)一般在1500-2000個 /ml。
步驟l中培養(yǎng)基的含量為(單位為mg/L):
硫酸鎂720、硝酸鉀70、氯化鉀55、硝酸鈣270、 EDTA鐵鈉鹽5、肌醇 40、硫酸錳O.Ol、硫酸銅O.Ol、硼酸0.3、硫酸鋅O. 1、碘化鉀0.01、鉬酸鈉 0.01、氯化鈷O.Ol、維生素BO. 1、卩必哆醇O. 1、煙酸0.2、蔗糖7500、葡萄糖 4500和植物膠3500或采用硫酸鎂740、硝酸鉀90、氯化鉀75、硝酸鈣290、 EDTA鐵鈉鹽12、肌 醇60、硫酸錳0.08、硫酸銅0.(J3、硼酸0.6、硫酸鋅0.4、碘化鉀0.03、鉬酸鈉 0.03、氯化鈷0.04、維生素B0.3、秘、哆醇0.3、煙酸0.8、蔗糖8500和葡萄糖 5500;
或采用硫酸鎂725、硝酸鉀85、氯化鉀60、硝酸鈣275、 EDTA鐵鈉鹽7、肌醇 45、硫酸錳O.Ol、硫酸銅O.Ol、硼酸0.4、硫酸鋅0.2、碘化鉀0.015、鉬酸鈉 0.02、氯化鈷0.02、維生素B0.2、卩必哆醇0.2、煙酸0.6、蔗糖8200和葡萄糖 5200植物膠4500。
步驟2的叢枝菌根真菌換成叢枝菌根真菌的球囊霉屬得其他真菌，培養(yǎng)條 件采用在黑暗中，溫度23、 23.5、 24、 24. 5或25。C下培養(yǎng)7、 8、 9、或10個 星期，孢子接種量為300個/ml、 350個/ml、 400個/ml或450個/ml，步驟3中 培養(yǎng)條件采用在黑暗中，溫度23、 23.5、 24、 24. 5或25'C下培養(yǎng)50、 55或60 天，專用培養(yǎng)盒橫隔網(wǎng)采用350或370目；步驟4中采用8mM、 9mM或llmM的 無菌擰檬酸鈉溶液中，并調(diào)pH至5. 5、6. 0或6. 5;步驟5中加入鏈霉素100mg/L、 慶大霉素50mg/L，或鏈霉素300mg/L、慶大霉素200mg/L，或鏈霉素150mg/L、 慶大霉素150mg/L，其他步驟和條件均與實施例相同，最后也能達到與實施例相 同的技術(shù)效果。
1權(quán)利要求
1.叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下工藝步驟1)將毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根的根組織培養(yǎng)在改進合成培養(yǎng)基中，在黑暗中，溫度23-25℃條件下，培養(yǎng)5-7個星期；2)將上述培養(yǎng)的毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根的根組織轉(zhuǎn)接至新的改進合成培養(yǎng)基中，再在培養(yǎng)基中接種叢枝菌根真菌，叢枝菌根真菌接種孢子量為300-500個/mL，在黑暗中，溫度23-25℃條件下，培養(yǎng)7-10個星期；3)在步驟2)的培養(yǎng)基中取含有被叢枝菌根真菌侵染的根、菌絲和孢子的直徑為1.5-2.5cm的培養(yǎng)物移種至專用培養(yǎng)盒中含有改進合成培養(yǎng)基的一室，并把新鮮培養(yǎng)的毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根的根組織移種至培養(yǎng)物旁，所述的專用培養(yǎng)盒為兩室培養(yǎng)盒，兩室之間設(shè)置350-450目的橫隔網(wǎng)，專用培養(yǎng)盒另一室中含有叢枝菌根真菌RT培養(yǎng)基，將上述的培養(yǎng)物在黑暗中，溫度23-25℃條件下，培養(yǎng)7-10個星期；4)取上述專用培養(yǎng)盒含有叢枝菌根真菌RT培養(yǎng)基一室中的孢子和菌絲體，溶解于8-11毫摩爾無菌檸檬酸鈉溶液中，并調(diào)pH至5.5-6.5，充分?jǐn)嚢?，再傾倒于無菌的0.45um孔徑的篩子，用無菌水洗滌至只剩孢子和菌絲體；5)取上述得到的孢子和菌絲體，用篩子收集孢子，清洗干凈后，浸泡于含有鏈霉素100-300mg/L和慶大霉素50-200mg/L的20％的甘油無菌溶液中保存。
2. 如權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征 在于所述的改進合成培養(yǎng)基含有硫酸鎂720-740mg/L、硝酸鉀70-90 mg/L、 氯化鉀55-75 mg/L、硝酸鈣270-290mg/L、 EDTA鐵鈉鹽5-12mg/L、肌醇40-60 mg/L、硫酸錳0.01-0.08 mg/L、硫酸銅0.01-0.03 mg/L、硼酸0. 3-0. 6 mg/L、硫酸鋅0. 1-0. 4 mg/L、碘化鉀0. 01-0. 03mg/L、鉬酸鈉0. 01-0. 03 mg/L、氯化 鈷0. 01-0. 04 mg/L、維生素B0. 1-0. 3mg/L、秘哆醇0. 1-0. 3mg/L、煙酸0. 2-0. 8 mg/L、蔗糖7500-8500mg/L、葡萄糖4500-5500mg/L和植物膠3500-4500mg/L。
3. 如權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征 在于所述的改進合成培養(yǎng)基含有硫酸鎂725-735mg/L、硝酸鉀75-85 mg/U 氯化鉀60-70 mg/L、硝酸轉(zhuǎn)275-285mg/L、EDTA鐵鈉鹽7-9mg/L、肌醇45-55mg/L、 硫酸錳0. 01-0. 05mg/L、硫酸銅0.01-0.02mg/L、硼酸0. 4-0. 5mg/L、硫酸鋅 0. 2-0. 3 mg/L、碘化鉀0. 01-0. 02mg/L、鉬酸鈉0. 01-0. 02 mg/L、氯化鈷0. 02-0. 03 mg/L、維生素BO, 1-0. 2mg/L、卩必哆醇0. 1-0. 2mg/L、煙酸0. 4-0. 6 mg/L、蔗糖 7800-8200mg/L、葡萄糖4800-5200mg/L和植物膠3700-4200mg/L。
4. 如權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征 在于步驟2)中叢枝菌根真菌為叢枝菌根真菌的球囊霉屬，叢枝菌根真菌接種孢 子的量為350-450個/mL，培養(yǎng)溫度為23. 5-24. 5"C條件下，培養(yǎng)8-9個星期。
5. 如權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征 在于步驟2)中叢枝菌根真菌為根內(nèi)球囊霉。
6. 如權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征 在于步驟3)中專用培養(yǎng)盒中間設(shè)置的橫隔網(wǎng)為370-400目，培養(yǎng)條件為在黑 暗中，溫度23.5-24.5'C條件下，培養(yǎng)8-9個星期。
7. 如權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征 在于步驟3)中叢枝菌根真菌RT培養(yǎng)基為在改進合成培養(yǎng)基中減少蔗糖和葡萄 糖兩個組分，并加入培養(yǎng)基重量0.1-0. 2%的酒石酸氨和培養(yǎng)基體積2-5%的根浸 出液。
8. 如權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征在于步驟4)專用培養(yǎng)盒含有叢枝菌根真菌培養(yǎng)基一室中的孢子和菌絲體，溶解 于9-10毫摩爾無菌擰檬酸鈉溶液中，并調(diào)pH至5. 8-6. 2。
9. 如權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征 在于步驟5)中20%的甘油無菌溶液中含有鏈霉素150-250 mg/L和慶大霉素 100-150mg/L。
10. 如權(quán)利要求7所述的叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，其特征 在于根浸出液為培養(yǎng)毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根組織得到的液體。
全文摘要
叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法，屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。包括以下工藝步驟1)培養(yǎng)毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根組織；2)毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根組織與叢枝菌根真菌一起培養(yǎng)在改進合成培養(yǎng)基；3)在上述培養(yǎng)基中取含有被叢枝菌根真菌侵染的根、菌絲和孢子的直徑為培養(yǎng)物移種至專用培養(yǎng)盒中進行培養(yǎng)；4)收集孢子和菌絲體；5)保存叢枝菌根真菌孢子。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，優(yōu)點在于1培養(yǎng)基是無菌環(huán)境的，成本低廉，既滿足寄主植物生長又適合AM真菌生長；2寄主植物生長營養(yǎng)要求低，可以在合成培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)；3由該方法培養(yǎng)的孢子是無污染純種培養(yǎng)物；4生產(chǎn)的孢子保存于液體中，可以保持90％活性以上。
文檔編號C12N3/00GK101565689SQ20091009898
公開日2009年10月28日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者金海如 申請人:浙江師范大學(xué)