專利名稱：癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件cpd及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術，涉及基因表達調控，具體地說，涉及一種特異性針對癌胚抗原陽性 腫瘤細胞的靶向性基因表達元件CPD的設計、制備及其在癌胚抗原陽性的腫瘤細胞內特異表 達、其產物可以有效地阻斷腫瘤細胞內的DNA復制，使細胞周期因DNA復制受阻而無法進 行下去，從而達到抑制細胞增殖的作用。本發(fā)明可用于制備靶向性腫瘤基因治療藥物。
背景技術：
惡性腫瘤是目前人類主要"殺手"之一，近年來隨著人們生活方式及環(huán)境的改變，其發(fā) 病率呈上升趨勢，在許多城市己成為第一位死亡原因，在農村位列第二位。肺癌、胃腸道腫 瘤、乳癌等在我國是最常見的危害極大的惡性腫瘤，雖然目前可以通過手術和化療等常規(guī)方 式進行治療，對較早期發(fā)現(xiàn)的上述腫瘤能收到一定的甚至較好的療效，但對于較晚期的上述 腫瘤的療效和預后均不理想。
被稱為腫瘤治療新模式的生物治療目前正顯示出越來越良好的應用前景。在各種腫瘤生 物治療手段中，基因治療始終是一個主要方向，我國研制的世界上第一個正式進入臨床使用 的基因藥物、針對許多腫瘤細胞中發(fā)生突變的抑癌基因p53的、可表達野生型p53的腺病毒 注射液"今又生"即是其代表。隨著醫(yī)學分子生物學技術和知識的飛速發(fā)展，各種先進的分 子生物學手段都運用到腫瘤的基因治療研究中。但是由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及眾多基因，而 目前的研究大都僅針對個別靶基因，因此，這些研究雖然都顯示出較好的細胞水平的體外抑 瘤效果甚至荷瘤動物模型的體內抑瘤效應，但實際效果并不理想。因此，探索、嘗試新的腫 瘤基因治療手段具有十分重要的意義。
正常細胞在各種致癌因素的作用下逐漸發(fā)生變化直至最后發(fā)生癌變，有相當多的基因表 現(xiàn)出過度表達的現(xiàn)象，尤其是一些促進細胞生長、侵襲等惡性表型的基因的過量表達。針對 腫瘤中異常表達的基因，人們設計了許多靶向性基因治療的方法，其中以封閉促進腫瘤生長、 侵襲等相關基因的表達的研究是一個相當熱門的領域。在以往大量的研究中，人們利用反義 RNA (antisense RNA)對腫瘤細胞高表達基因進行封閉，但由于反義RNA本身存在的限制， 這類研究在抑制腫瘤細胞生長、控制細胞侵襲遷移等方面雖然取得了較大的成績，其封閉基 因表達的效果仍不理想。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種抑制腫瘤效果好、適應性廣、安全性好的癌胚抗 原陽性細胞耙向性基因表達元件CPD。本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD而改造的用于構建其他的耙
向性基因表達元件
本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD在制備耙向性腫瘤基因治療 藥物中的應用。
本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD在制備腸癌藥物中的應用。 本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD在制備胃癌藥物中的應用。 本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD在制備乳癌藥物中的應用。 本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD在制備肺癌藥物中的應用。
本發(fā)明提供的CEA陽性腫瘤細胞耙向性基因表達元件CPD為一種DNA分子，具有如 SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。其中第7位至第375位為人CEA基因翻譯起始點(定為 +1)上游第-407位至第-39位，該區(qū)域含有CEA的基本啟動子和第一外顯子5，非翻譯區(qū)部分 序列，為CEA陽性細胞表達調控序列；第376位至第1599位為3個3種串聯(lián)連接的針對人 DNA聚合酶S催化亞基p125基因的人工設計的microRNA;第1600位至第1948位為牛生長 激素基因多聚腺苷酸信號區(qū)，為基因表達提供轉錄終止信號。
該表達元件在導入CEA陽性的腫瘤細胞后，可以在細胞中表達針對DNA聚合酶5催化亞 基p125的人工microRNA,并有效抑制細胞內DNA聚合酶S催化亞基p125的表達，進而影 響到DNA復制，最終阻斷細胞周期的進行，抑制細胞增殖。
本發(fā)明提供該表達元件可用于構建的靶向性基因治療載體，進而制備基因治療藥物，用 于CEA陽性的腫瘤的靶向基因治療。該表達元件中針對人DNA聚合酶S催化亞基p125的人 工microRNA序列可以用于其它表達載體達到抑制相應細胞中DNA聚合酶S催化亞基pl25 的表達目的。
小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的發(fā)現(xiàn)為人為干預細胞中基因的表達提供了 一個有力的工具。利用化學合成的雙鏈形式的siRNA，或是由III型啟動子帶動轉錄的結構類 似的小發(fā)卡樣RNA (small hairpin RNA, shRNA)，可以通過序列特異性匹配原則降解耙基因， 從而對靶基因的表達進行有效的抑制，因此也被嘗試應用于基因治療。但是由于化學合成的 siRNA代價太高，而shRNA的表達又不利于調控，這些因素大大地限制了這一技術的應用。
微小RNA (microRNA)是細胞內天然存在的一種小分子RNA，是在基因轉錄后水平進 行表達調控的一種重要方式，能在序列完全匹配的情況下降解耙基因mRNA，也可以在序列 非完全匹配的情況下抑制靶基因的翻譯，是目前生命科學領域中的一個研究熱點，在腫瘤相關microRNA方面也有大量研究，而且大都集中在正常細胞和腫瘤細胞之間表達有差異的各 種天然microRNA的發(fā)現(xiàn)以及功能鑒定。
由于天然microRNA是由II型啟動子帶動轉錄，因此如果人工設計類似的microRNA分 子，也應該可以由II型啟動子引導轉錄，而II型啟動子的特點是其轉錄啟動功能可以調控， 所以其下游的人工miRNA的表達應該可以受到人為控制，而microRNA的作用方式最近的一 些文獻報道已證實這一設想。
在本發(fā)明中我們選擇細胞周期中的DNA復制過程為作用點，設計人工microRNA的序列， 抑制DNA復制中必需的DNA聚合酶S的催化亞基p125表達。由于DNA的復制是一個復雜 而又精密調控的過程，主要由DNA聚合酶ct、狩BS等酶催化、以原有的DNA鏈為模板進行 的半保留復制，因此對DNA聚合酶S催化亞基p125表達的抑制將有效阻斷細胞的DNA復制， 從而使細胞周期因DNA無法復制而停止，進而抑制細胞的增殖。
為了達到對腫瘤細胞的靶向性作用，針對我國高發(fā)的肺癌、胃腸道腫瘤、乳癌等惡性腫 瘤，利用在胚胎細胞中表達而在正常成人細胞中不表達、但在上述腫瘤細胞中又常會重新表 達胚胎性抗原——癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)的特點，重組了CEA基因上游 的表達調控序列，用來調控人工設計的microRNA的表達。這一基因表達元件在導入正常細 胞后不會有任何表達，而在導入CEA陽性的腫瘤細胞后，可以表達出相應的microRNA并有 效地阻斷腫瘤細胞的DNA復制，從而達到靶向性抑制肝癌細胞的生長。
基于本發(fā)明的思路，還可以DNA聚合酶5催化亞基p125基因的其它位點做為耙序列進行 人工microRNA的設計，或是以DNA復制過程中其它重要基因作為靶基因來進行DNA復制 的阻斷，從而抑制細胞增殖。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點及效果
利用本發(fā)明提供的表達元件可以制備的基因治療藥物，其特點在于以多種腫瘤細胞均重 新表達的胚胎性抗原——癌胚抗原為腫瘤細胞特異性表達調控手段、以腫瘤細胞快速生長分 裂所需的DNA聚合酶S催化亞基p125為作用耙點進行表達抑制，有效地引起細胞周期阻斷， 特異性地抑制CEA陽性的腫瘤細胞的增殖。


圖1為CEA陽性細胞表達調控序列PCR產物電泳圖。
圖2為針對人DNA聚合酶S催化亞基p125的三種人工microRNA構建PCR產物電泳圖。 圖3為Western blot法檢測CPD對GAPDH表達的抑制的比較圖。圖4為MTT法檢測結果。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明 并不局限于以下實施例。 實施例1:
人CEA陽性細胞表達調控序列的克隆
首先從GenBank檢索得到包含人CEA基因5'側翼及第一個外顯子的基因組DNA序列 (GenBank登錄號Z21818),然后參考Nyati MK等人的文獻(Cancer Research 62, 2337 — 2342, 2002)，設計并合成引物1和引物2，利用聚合酶鏈反應技術(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴增CEA翻譯起始點(定為+l)上游包含基本啟動子和部分第一外顯子的5'非翻譯區(qū) 在內的-407至-39位序列。引物1序列為:5' - AGA TCT CCC GGG ACC CTG CTG GGT TTC -3，、 引物2序列為5， - GGA TCC AGC TTG AGT TCC AGG AAC G -3'，以人腸癌細胞SW620基因 組DNA為模板，用上述引物進行核酸擴增，獲得381 bp的擴增產物。
將上述擴增產物以T-A克隆的方式分別克隆至pGEMT-easy載體(Promega公司，.美國)， 參見圖1，其中泳道1為1Kb Plus DNA分子量標記，泳道2為pGEM T-easy/CEA經EcoR I酶 切，如克隆成功，則會出現(xiàn)兩個條帶，大的一個條帶為約3.0 kb的載體pGEM T-easy,小的 一個條帶為約0. 4 kb的插入片段CEA陽性細胞表達調控序列，如果未克隆成功，則僅有一個 條帶，即約3.0 kb的載體pGEM T-easy，從圖中可以看出PCR產物克隆成功，條帶大小與預 期完全相符。經DNA序列測定并與基因組DNA序列(GenBank登錄號Z21818)核對驗證其 正確性。測序結果如下，其中下劃線部分分別為兩端加的BglII和BamHl位點，加框部分為 人CEA基因翻譯起始點上游第-407位至第-39位序列。 AGATCTCCCG GGACCCTGCT GGGTTTCTCT GTCACAAAGG AAAATAATCC CCCTGGTGTG 60 ACAGACCCM GGACAGAACA CAGCAGAGGT CAGCACTGGG GAAGACAGGT TGTCCTCCCA 120 GGGGATGGGG GTCCATCCAC CTTGCCGAAA AGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG 180 GAAAAAAGAG GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA GGACACCTGA 240 ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC 300 TCAGGGCAGA GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG ACAAAACGTT 360 CCTGGAACTC AAGCTGGATC C 381
針對人DNA聚合酶S催化亞基Pl25基因的人工microRNA的克隆從GenBank檢索得到人DNA聚合酶S催化亞基p125基因的mRNA序列(GenBank登錄號 NM—002691. 1)，利用網上軟件分析該mRNA序列上合適的位點，確定3個人工microRNA的作 用靶點，設計合成引物D卜IS: 5， — TGC TGT TGA CAG TGA GCG CCG GCT TCG CTC CCT ACT TCT ATA GTG AAG CCA CAG ATG TA -3' 、 Dl-1R: 5' - TCC GAG GCA GTA GGC AAC GGC TTC GCT CCC TAC TTC TAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TA -3， 、 Dl-2S: 5' -TGC TGT TGA CAG TGA GCG ACG GGA CCA GGG AGA ATT AAT ATA GTG AAG CCA CAG ATG TA-3， 、 D1-2R: 5' -TCC GAG GCA GTA GGC AGC GGG ACC AGG GAG AAT TAA TAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TA-3' 、 D卜3S: 5， -TGC TGT TGA CAG TGA GCG AGG AGT CTG AGC TGT ATC AGA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TA_3，、 D1-3R: 5' -TCC GAG GCA GTA GGC AGG GAG TCT GAG CTG TAT CAG AAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TT-3， 、 PS: 5' -AGA TCT GAT CCA AGA AGG TAT ATT GCT GTT GAC AGT GAG CG-3，和 PR: 5， -GGA TCC ATC GTA GCC CTT GAA GTC CGA GGC AGT AGG CA-3'。先分別將引物D1-1S 和引物D1-1R、引物D1-2S和引物Dl-2R、引物D1-3S和引物D1-3R配對進行重疊延伸PCR， 均分別得到97 bp的擴增產物D1-lp、 Dl-2p和D卜3p，再分別以這些擴增產物為模板，用引 物PS和引物PR進行PCR擴增，再分別得到142 bp的擴增產物Dl-lf、 Dl-2f和Dl-3f ，參 見圖2，其中泳道l、 2、 4分別為三種不同人工microRNA的PCR產物，均顯示出142 bp的 PCR產物條帶，泳道3為DL2000分子量標記，說明按照設計進行的人工microRNA的PCR合 成成功。
上述142 bp的擴增產物以T-A克隆的方式分別克隆至pGEM T-easy載體，經DNA測序驗 證其正確性。這些即為針對人DNA聚合酶S催化亞基p125基因3個不同耙點的人工microRNA 序列。為了加強其作用效果，每一種人工microRNA分別用限制性內切酶BamH I和Bgl II雙酶 切后回收該人工microRNA序列并重新插入同一載體的BamH I位點，獲得各有3個串聯(lián)連接 的人工microRNA序列，再將它們串聯(lián)連接在一起成為完整的針對人DNA聚合酶S催化亞基pl25 基因的人工microRNA序列。
腫瘤靶向性基因表達元件CPD的構建及腺病毒載體的制備
首先構建pDC312-BGHpA載體將腺病毒穿梭質粒pDC312載體(Microbix公司，美國) 用限制性內切酶XbaI單酶切開，用Klenow酶補平，再用限制性內切酶HindIII單酶切，去掉 Xbal到HindIII之間的部分(從HindIII、 Sac I 、 Ecl國I、 Acc I 、 SalI到XbaI)，回收 部分一端為平端，另一端為HindIII粘性末端。pcDNA3. 1(+)載體(Invitrogen公司，美國) 用限制性內切酶PvuII和HindIII雙酶切，回收包括HindIII、 Asp718、 Kpn I 、 BamH I 、 BstXI、 EcoR I 、 EcoRV、 BstXI、 Not I 、 Xho I 、 Xba I 、 DraII 、 Apa I和Pme I多克隆位點和牛生長因子基因多聚腺苷酸信號(BGHpA)的片段， 一端為Hindin粘性末端，另一端為PvuII的 平端。將上述兩個片段連接起來，即成pDC312-BGHpA載體，可在多克隆位點上插入啟動子和 目的基因編碼區(qū)。
再將前面所述的CEA陽性細胞表達調控序列從載體上用限制性內切酶BamH I和Bgl II雙 酶切后回收，并插入pDC312-BGHpA的BamH I位點，得到帶有CEA陽性細胞表達調控序列和 BGHpA的腺病毒穿梭質粒。最后將串聯(lián)連接的完整的針對人DNA聚合酶5催化亞基p125基因 的人工microRNA序列從載體上用限制性內切酶BamH I和Bgl II雙酶切后回收，插入此穿梭質 粒的BamHI位點，得到帶有完整腫瘤靶向性表達元件CPD的腺病毒穿梭質粒，酶切鑒定結果 與預期完全相符。
將上述帶有完整腫瘤靶向性表達元件CPD的腺病毒穿梭質粒與腺病毒骨架質粒 pBHGlox(delta)El,3cre (Microbix公司,美國)共轉染腺病毒包裝細胞293細胞，得到帶 有表達元件CPD的腺病毒載體。也就是完成了癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD的 制備。
應用實施例1:
基因表達元件CPD對CEA陽性細胞DNA聚合酶S催化亞基p125基因表達的抑制 取對數(shù)生長期的CEA陽性的人腸癌細胞服8348細胞，按3 X 105細胞/孔的密度接種于6
孔板中，培養(yǎng)24小時使其貼壁并達到80%的匯合度。用培養(yǎng)基稀釋上述帶有表達元件cra的
腺病毒，以感染復數(shù)(multiplicity of infection, M0I)為100 pfu/cell感染細胞，48hr 后中止作用，提取細胞總蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠，5%濃縮膠)， 然后將蛋白轉至PVDF膜，封閉后與1 : 1000稀釋的抗DNA聚合酶5催化亞基pl25的抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.,美國，DNA pol 5 2 (C-20): sc-8800，)于4。C結合過夜，用 TBST洗膜3次，再與1 : 10000稀釋HRP標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)結 合，室溫2小時后，用TBST洗膜3次，然后用化學發(fā)光試劑盒(Roche公司，美國)顯影， X光片暴光。用帶綠熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的腺病毒感染和無腺病 毒感染的細胞作對照。從圖3中可看到，感染帶有表達元件CPD的腺病毒的CEA陽性腸癌細 胞HR8348中的DNA聚合酶5催化亞基p125表達明顯受到抑制。圖中1為無病毒感染的HR8348 腸癌細胞DNA聚合酶S催化亞基p125基因表達情況，2為帶CPD的腺病毒以MOI 100感染服8348 腸癌細胞48小時后DNA聚合酶S催化亞基p125基因表達情況。 應用實施例2:
基因表達元件CPD對CEA陽性細胞體外細胞生長抑制試驗(MTT法)取對數(shù)生長期的腸癌細胞HR8348，按3X105細胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小 時使其貼壁。將帶CPD的腺病毒以MOI為200 pfu/cel1、 100 pfu/cel1、 10 pfu/cell和0 pfu/cell感染細胞。在病毒感染48小時后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 200^1， 37。C繼 續(xù)培養(yǎng)4hr，中止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入DMS0 2ml，振蕩10min，使結晶物充分 溶解，取IOO pl在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各樣品570nm波長OD值。每組設立3復孔。從圖 4可以看出，不同MOI的帶CPD的腺病毒對CEA陽性的腸癌細胞HR8348的生長均有不同程度 的抑制。
此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實施例，其零、部件的形狀、所取名稱 等可以不同。凡依本發(fā)明專利構思所述的構造、特征及原理所做的等效或簡單變化，均包括 于本發(fā)明專利的保護范圍內。本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做 各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結構或者超越本權利要 求書所定義的范圍，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。
雖然本發(fā)明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明的保護范圍，任何熟悉該項 技術的技術人員，在不脫離本發(fā)明的構思和范圍內所作的更動與潤飾，均應屬于本發(fā)明的保 護范圍。癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD電子序列 <110>杭州安倍生物科技有限公司
<120>癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD及其應用 <160> 1
<210>
<211>1948 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD <400> 1
AGATCTCCCG GGACCCTGCT GGGTTTCTCT GTCACAAAGG AAAATAATCC CCCTGGTGTG 60
ACAGACCCAA GGACAGAACA CAGCAGAGGT CAGCACTGGG GAAGACAGGT TGTCCTCCCA 120
GGGGATGGGG GTCCATCCAC CTTGCCGAAA AGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG 180
GAAAAAAGAG GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA GGACACCTGA240
ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC 300
TCAGGGCAGA GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG ACAAAACGTT 360
CCTGGAACTC AAGCTGGATC TGATCCAAGA AGGTATATTG CTGTTGACAG TGAGCGCCGG 420
CTTCGCTCCC TACTTCTATA GTGAAGCCAC AGATGTATAG AAGTAGGGAG CGAAGCCGTT 480
GCCTACTGCC TCGGACTTCA AGGGCTACGA TGGATCTGAT CCAAGAAGGT ATATTGCTGT 540TGACAGTGAG CGCCGGCTTC GCTCCCTACT TCTATAGTGA AGCCACAGAT GTATAGAAGT 600
AGGGAGCGAA GCCGTTGCCT ACTGCCTCGG ACTTCAAGGG CTACGATGGA TCTGATCCAA 660
GAAGGTATAT TGCTGTTGAC AGTGAGCGCC GGCTTCGCTC CCTACTTCTA TAGTGAAGCC 720
ACAGATGTAT AGAAGTAGGG AGCGAAGCCG TTGCCTACTG CCTCGGACTT CAAGGGCTAC 780
GATGGATCTG ATCCAAGAAG GTATATTGCT GTTGACAGTG AGCGACGGGA CCAGGGAGAA 840
TTAATATAGT GAAGCCACAG ATGTATATTA ATTCTCCCTG GTCCCGCTGC CTACTGCCTC 900
GGACTTCAAG GGCTACGATG GATCTGATCC AAGAAGGTAT ATTGCTGTTG ACAGTGAGCG %0
ACGGGACCAG GGAGAATTAA TATAGTGAAG CCACAGATGT ATATTAATTC TCCCTGGTCC 1020
CGCTGCCTAC TGCCTCGGAC TTCAAGGGCT ACGATGGATC TGATCCAAGA AGGTATATTG 1080
CTGTTGACAG TGAGCGACGG GACCAGGGAG AATTAATATA GTGAAGCCAC AGATGTATAT 1140
TAATTCTCCC TGGTCCCGCT GCCTACTGCC TCGGACTTCA AGGGCTACGA TGGATCTGAT 1200
CCAAGAAGGT ATATTGCTGT TGACAGTGAG CGAGGAGTCT GAGCTGTATC AGAATAGTGA 1260
AGCCACAGAT GTATTCTGAT ACAGCTCAGA CTCCCTGCCT ACTGCCTCGG ACTTCAAGGG 1320
CTACGATGGA TCTGATCCAA GAAGGTATAT TGCTGTTGAC AGTGAGCGAG GAGTCTGAGC 1380
TGTATCAGAA TAGTGAAGCC ACAGATGTAT TCTGATACAG CTCAGACTCC CTGCCTACTG 1440CCTCGGACTT CAAGGGCTAC GATGGATCTG ATCCAAGAAG GTATATTGCTGTTGACAGTG 1500
AGCGAGGAGT CTGAGCTGTA TCAGAATAGT GAAGCCACAG ATGTATTCTGATACAGCTCA1560
GACTCCCTGC CTACTGCCTC GGACTTCAAG GGCTACGATG GATCCACTAGTCCAGTGTGG 1620
TGGAATTCTG CAGATATCCA GCACAGTGGC GGCCGCTCGA GTCTAGAGGGCCCGTTTAAA1680
CCCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTTTGCCCCTCCC 1740
CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAATAAAATGAGG l細
AAATTGCATC GCATTGTCTG AGTAGGTGTC ATTCTATTCT GGGGGGTGGGGTGGGGCAGG1860
ACAGCAAGGG GGAGGATTGG GAAGACAATA GCAGGCATGC TGGGGATGCGGTGGGCTCTA1920
TGGCTTCTGA GGCGGAAAGA ACCAGCTG 1948
1權利要求
1、一種癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD，其特征是一種DNA分子，具有如SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 一種基于如權利要求1所述的CPD而改造的用于構建其他的靶向性基因表達元件。
3、 一種癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元件CPD在制備靶向性腫瘤基因治療藥物中 的應用。
4、 根據權利要求3所述的應用，其特征是所述的癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元 件CPD在制備腸癌藥物中的應用。
5、 根據權利要求3所述的應用，其特征是所述的癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元 件CPD在制備胃癌藥物中的應用。
6、 根據權利要求3所述的應用，其特征是所述的癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元 件CPD在制備乳癌藥物中的應用。
7、 根據權利要求3所述的應用，其特征是所述的癌胚抗原陽性細胞靶向性基因表達元 件CPD在制備肺癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術，涉及基因表達調控，具體地說，涉及一種特異性針對癌胚抗原陽性腫瘤細胞的靶向性基因表達元件CPD的設計、制備及其在癌胚抗原陽性的腫瘤細胞內特異表達、其產物可以有效地阻斷腫瘤細胞內的DNA復制，使細胞周期因DNA復制受阻而無法進行下去，從而達到抑制細胞增殖的作用。本發(fā)明可用于制備靶向性腫瘤基因治療藥物。本發(fā)明具有抑制腫瘤效果好、適應性廣、安全性好的優(yōu)點。
文檔編號C12N15/11GK101638654SQ20091010185
公開日2010年2月3日 申請日期2009年9月3日 優(yōu)先權日2009年9月3日
發(fā)明者江 曹, 賈振宇 申請人:杭州安倍生物科技有限公司