專利名稱：一種蘇云金芽孢桿菌及其l-薄荷醇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蘇云金芽孢桿菌及其L-薄荷醇制備方法。
背景技術(shù)：
薄荷醇是目前具有重要工業(yè)價值的化合物，它具有八個立體構(gòu)型的異構(gòu) 體，但它們之間氣味和功效存在很大差異。L-薄荷醇具有新鮮、輕快的涼氣， 很強的清涼效果，而其他的幾個異構(gòu)體卻基本不具備這兩方面的效果。由于受 季節(jié)變化和不良耕作，以及本身薄荷種植量的影響，天然的L-薄荷醇有時候往 往不能滿足需求，不足部分需要由合成薄荷醇來滿足。
如果合成得到的薄荷醇是消旋薄荷醇，其氣味和味道均明顯劣于天然存在 的L-薄荷醇，所以從消旋薄荷醇中分離L-薄荷醇的方法顯得非常重要。薄荷醇 的拆分主要包是化學(xué)拆分和生物拆分。其中生物拆分相對簡單，拆分轉(zhuǎn)化率 高，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)，因此生物拆分也吸引了大量研究者的眼光，主要有 不對稱水解和不對稱酯化兩大途徑。
不對稱水解反應(yīng)。通常將DL-薄荷醇進行酯化反應(yīng)后生成DL-薄荷酯后，再 利用酶對酯的立體選擇性水解進行拆分，獲得一個對映體薄荷醇和一個不反應(yīng) 的對映體薄荷酯。Zaks等較早報道了此類拆分，在固定化小紅酵母 (Rhodotorula minuta)細胞催化下，消旋體丁二酸薄荷酯在水飽和的正庚烷非水 介質(zhì)中水解生成L-薄荷醇，其對映體過量達100%。此反應(yīng)利用了小紅酵母細胞 產(chǎn)生的脂肪酶對消旋體丁二酸薄荷酯的高度專一性水解特性。(Zaks A., Klianov A.M. Enzymatic catalysis in organic media at 100°C[J]. Science, 1984， 224: 1249-1251) 。 Gatfield等采用自皺摺假絲酵母的重組脂肪酶對DL-苯甲酸薄荷酯 進行水解時，令人驚奇地以對映體過量(ee值)大于99。/。、選擇性(E值)大于100得 到了L-薄荷醇。相比之下，使用市售自皺摺假絲酵母脂肪酶對DL-苯甲酸薄荷酯 催化水解具有明顯低的對映選擇性(Ian-Lucas G.， Ens-Michael H.,Uwe B.,et al.Method for preparing D-or L-menthol: EP， 1223223[P〗.2002207217)。 Sandra等 也研究了從假絲酵母微生物中獲得的脂肪酶LIPl,對酯化的薄荷酯進行水解拆 分，可以獲得對映體過量(ee值)大于99M的L-薄荷醇。當(dāng)使用商用酶時選擇性(E 值)僅為15，而使用不同類型的同工酶可以獲得大于100的選擇性(E值)(Sandra V.，Uwe T.B"Ian G.，et al. Enantioselective of D,L國menthyl benzoate to L-(畫)-menthol by recombinant Candida rugosa lipase LIPI[J].Adv.Synth.Cata1.,2002, 344 (10): 1152-1155)。徐巖等開發(fā)了一種全細胞生物法立體選擇性水解"丄-脂肪 酸薄荷酯制備L-薄荷醇的方法DL-脂肪酸薄荷酯催化水解可以獲得40o/。-50%(ee>90%)的L-薄荷醇(徐巖，于麗娟.一種全細胞生物法立體選擇性水解DL-脂肪酸薄荷酯制備L-薄荷醇的方法:CN,1978659 [P].2007-06-13)。
不對稱酯化反應(yīng)拆分。Klibanow開創(chuàng)了非水介質(zhì)中酶反應(yīng)體系，大大推動了 酶拆分技術(shù)(Zaks A"Klibanov A,M.Enzymatic catalysis in organic media atl00°C[J].Science,1984,224:1249-1251)。 2005年,Lu等研究了不同反應(yīng)介質(zhì)中假 絲酵母脂肪酶不對稱酯化拆分DL-薄荷醇。結(jié)果表明對照有機溶劑體系，脂肪酶
在反膠束體系中具有更高的穩(wěn)定性，并能夠保持更長時間的活性。產(chǎn)物對映體過 量較高(ee值92.5。/。),但轉(zhuǎn)化率一般 (Lu Z.X.,Chu Y.,Han Y.C.,et al. Enzymatic esterification of DL-menthol with propionic acid by lipase from Candida cylindracea [J]丄Chem.Technol.Biotechnol.，2005,80(2): 1365-1370)。 Xu等人研究發(fā)現(xiàn)用酸酐
做?；w比用羧酸時酶具有更好的穩(wěn)定性，用分批補料反應(yīng)器進行脂肪酶催 化的DL-薄荷醇與酸酐的對映選擇性酯化，此法可獲得對映體過量(ee值)大 于98X的L-薄荷醇(Xu J.H"Kawamoto T., Tanaka A.Efficient Kinetic Resolution of DL-menthol by Lipase Catalyzed Enantioselective Esterification with Acid Anhydride in Fed國batch Reactor [J] .Applied Microbiology and Biotechnology , 1995，43(3):402-407)。對于DL薄荷醇的酯化或者轉(zhuǎn)酯化研究已有很多，但最好 的對映體選擇性基本只能保證98%以上。
上述研究都是以DL-薄荷醇酯或者DL-薄荷醇為初始底物進行水解或者酯化 拆分。而如果以八異構(gòu)體外消旋薄荷醇酯或者薄荷醇為底物直接拆分更具工業(yè) 化應(yīng)用價值。因為工業(yè)合成L-薄荷醇的初步產(chǎn)品普遍是外消旋混合物而非單一 的DL-薄荷醇，然而以八異構(gòu)體外消旋混合物為底物直接拆分對生物催化劑的 選擇性有更高的要求。當(dāng)前對八異構(gòu)體外消旋混合物直接拆分的研究很少。 1986年Takashi等研究了從土壤中分離得到的假單胞菌NOF-5(Pseudomonas NOF-5)分別催化薄荷醇八異構(gòu)體的水解情況，其中DL-乙酸薄荷酯和DL-乙酸 異薄荷酯能被催化發(fā)生不對稱水解反應(yīng)，分別可以獲得適量的L-薄荷醇和D-乙 酸薄荷酯，以及L-異薄荷醇和D-乙酸異薄荷酯；而DL-乙酸新異薄荷酯全被水 解成DL-新異薄荷醇，DL-乙酸新薄荷酯并不能被水解。該研究發(fā)現(xiàn)的酶雖然對 DL-薄荷醇有立體選擇性，但是對其它的非對映異構(gòu)體也有很大程度的水解活 力，故并未將八異構(gòu)體混合在一起進行拆分。(Takashi I., Hiroo U. Reaction ofesterase of Pseudomonassp. NOE畫5 on terpene alcohols and esters, ■ Part I. Biochemical resolution of (士)-menthol by Pseudomonas sp. NOE咖5 isolated from soil [J]. Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 1986,60(11): 921-926)。南非CSIR公司以八異構(gòu) 體薄荷醇為底物進行酶促不對稱轉(zhuǎn)酯化拆分，重點進行了醇酯分離和無效體的 再利用研究，提高了底物的利用效率，但是在實施例中未見具體的拆分過程和 結(jié)果(珍妮弗，安*査普林.制備(-)薄荷醇及類似化合物的方法CN， 1452603 [P].2003-10-29)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蘇云金芽孢桿菌及其L-薄 荷醇制備方^^。
蘇云金芽孢桿菌(^ c///^ AwW"g/m^),保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 3189。
所述的蘇云金芽孢桿菌(5ac說w Awn'打g/e"&)分泌的胞外酶為脂肪酶
L-薄荷醇的制備方法包括如下步驟
1) 從斜面接種蘇云金芽孢桿菌(^^7/w決"Wwg/ms&)于搖瓶培養(yǎng)種子液 20 30小時；
2) 將種子液以5 10%接種量接入1 2L發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)20 30小時， 培養(yǎng)溫度為20 30°C;
3) 將發(fā)酵培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液在8, 000 10，000g的離心力，4 6。C下離 心除去菌體得到含有胞外脂肪酶的發(fā)酵上清液，初始pH為7 8，用鹽酸或氫 氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3 12。
4) 在50 1000ml發(fā)酵上清液中加入50 700mmol/L八異構(gòu)體外消旋薄荷 醇酯進行不對稱水解反應(yīng)，得到L-薄荷醇及未水解的薄荷醇酯，其反應(yīng)溫度為 20 40。C。
5) 用1 3倍體積的正己烷萃取，得到的L-薄荷醇及薄荷醇醇酯混合物采 用柱狀色譜分離，洗脫液為1: 8 1:10的乙酸乙酯和正己垸混合液，分離， 在70 80。C下低壓蒸餾除去溶劑，得到L-薄荷醇。
所述的八異構(gòu)體外消旋薄荷醇酯為乙酸薄荷醇酯；丙酸薄荷醇酯。 所述的液培養(yǎng)基和發(fā)酵液培養(yǎng)基成份組成為 吐溫80 7 10g/L， 酵母抽提物 5 10g/L，
5氯化鈉 0.8 1.2g/L， 無水硫酸鎂 0.15 0.25g/L， 磷酸氫二鉀 1.5 2.5g/L。
本發(fā)明提出了一種蘇云金芽孢桿菌,并且該菌能分泌的高效的脂肪酶。其特 征在于，該胞外酶能夠高效選擇性的催化水解八異構(gòu)體外消旋乙酸薄荷醇酯或 八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯混合物，得到高純度的L-薄荷醇。


圖1 (a)是反應(yīng)前八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯原料GC譜圖； 圖1 (b)是在L-薄荷醇標準樣出峰位置即保留時間12分鐘位置比； 圖1 (C)是標準L薄荷醇樣品譜圖。
具體實施例方式
蘇云金芽孢桿菌(^^7/ws A"n'"g/e"^),于2009年7月10日，保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. 3189
依據(jù)本發(fā)明的方法，產(chǎn)物對映體過量(ee值)的大于99%，產(chǎn)物非對映體過 量(de值)大于98%。 產(chǎn)物ee值計算
產(chǎn)物de值計算 deD(%) = ^^xl00%
其中A,，A^,A,分別表示產(chǎn)物中L-薄荷醇的含量，D-薄荷醇的含量，除L-薄 荷醇外其他異構(gòu)體含量之和。本發(fā)明中采用評價的轉(zhuǎn)化率為有效轉(zhuǎn)化率，即已 水解的的L-薄荷醇酯占底物初始L-薄荷醇酯的比例。
產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和ee值以及de值通過裝載有CP手性柱的氣相色譜來測定計 算，本發(fā)明中所有氣相檢測條件均一致。140'C柱溫，進樣器溫度260°C,檢測 器溫度250aC,氮氣為載氣。L-薄荷醇標準樣購買于Alfa Aesar中國分公司， 在本發(fā)明GC條件下出峰保留時間為12分鐘。八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯出 峰保留時間在16 20分鐘之間。圖1是丙酸薄荷醇酯L-薄荷醇GC譜圖，(a) 為反應(yīng)前八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯原料GC譜圖，(b)為水解后GC譜圖。 (b)中在L-薄荷醇標準樣出峰位置即保留時間12分鐘位置比(a)圖明顯多出一 個峰，可肯定其產(chǎn)物主要為L-薄荷醇。圖(C)為標準L薄荷醇樣品譜圖。
由于本發(fā)明產(chǎn)物ee值和de值很高，分別高于99%和98%。因此從(a),(b)圖中對比原料峰的變化可以看出，除一個峰有明顯降低外，其他峰形及之間面
積比基本無變化，由此可以斷定明顯降低的峰即為L-丙酸薄荷醇酯。根據(jù)反應(yīng) 后譜圖(b)八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯其他異構(gòu)體的峰面積可計算出初始L-丙酸薄荷醇酯峰面積，而又可從(b)圖中直接讀出剩余L-丙酸薄荷醇酯峰面 積，從而計算消耗的L-丙酸薄荷醇酯峰面積，即有效轉(zhuǎn)化率。該方法完全消除 了萃取過程中的誤差，理論計算誤差小于2%。
用于本發(fā)明方法的八個薄荷醇酯衍生物，例如下式化合物
其中
R代表氫，直鏈或支化的Q d。烷基、C3 Cs環(huán)烷基、C6 C"芳基、
C7 d5芳基垸基、C! C20垸氧基或Q C20垸基氨基，其中上述烴基能夠任
選由羥基、甲?；⒀趸?、C, C6烷氧基、羧基、巰基、氨基、d C6烷氧 氨基、硝基或鹵素單取代或多取代。
優(yōu)選的八異構(gòu)體外消旋薄荷醇酯為脂肪酸的薄荷醇酯。例如，可以述及以 下酯八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯、八異構(gòu)體外消旋乙酸薄荷醇酯。
特別優(yōu)選八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的蘇云金芽孢桿菌分泌的胞外脂肪酶為本發(fā)明分離八異構(gòu)體外 消旋薄荷醇酯制備L-薄荷醇的催化劑。
本發(fā)明中八異構(gòu)體外消旋薄荷醇酯中各對異構(gòu)體含量為DL薄荷醇酯57 %,新異薄荷醇酯3%，新薄荷醇酯13%，異薄荷醇酯27% 實施例1菌種的篩選
通過對薄荷地，薄荷盆栽，日化用品工廠周邊土樣8份進行分離篩選，獲 得了 120株平板上具有不同性狀、長勢比較好的菌株，然后對120支菌株進行 初篩和復(fù)篩。用雙平板顯色法對分離得到的120菌株進行初次篩選，挑選得到 8株能優(yōu)先水解L-乙酸薄荷酯的菌株。對得到的8株菌種再進行復(fù)篩，分離純 化得到本發(fā)明所述的菌種。 實施例2菌種的鑒定本發(fā)明的菌種通過提取基因組序列，16sRNA測序。將得到的序列與 RCSB Protein Data Bank中的序列進行比對，得到相似度99%以上的菌種為蘇 云金芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌。而后又通過硝酸鹽還原，V-P，木糖利用，甘 露醇利用，卵黃利用，酪蛋白利用等生理生化實驗鑒定該菌種為蘇云金芽孢桿 菌。
實施例3菌種產(chǎn)酶部位和酶類的考察
將培養(yǎng)24小時的菌液高速離心除去菌體，離心出來的菌體重新懸浮于相 同體積的生理鹽水中配成菌懸液，分別向上清液和菌懸液中加入八異構(gòu)體丙酸 薄荷醇酯，底物濃度為50mM，反應(yīng)24小時后，產(chǎn)物由GC檢測。菌懸液中有 效轉(zhuǎn)化率為30%， ee值〉99X， de值為97.9%;上清液中有效轉(zhuǎn)化率為72%, ee 值>99%， de值為98.5%。可見這種水解酶為胞外酶。將5ml磷酸緩沖液 (pH=7.5,0.02 5mo1/1)和4ml，聚乙烯醇橄欖油乳化液加入50ml錐形瓶中，置 于37°C水浴中保溫5min，然后在瓶中加入lml該胞外酶液，并滴入3滴石蕊 指示劑，繼續(xù)保溫，30分鐘后發(fā)現(xiàn)溶液變紅色，說明該胞外酶能水解橄欖油生 成酸，即認定該酶為脂肪酶。 實施例4菌體最佳培養(yǎng)溫度的確定
菌體培養(yǎng)溫度不僅影響細菌生長，也影響了胞外酶的分泌量。選擇 25。C,30。C，35。C,40。C等溫度點對產(chǎn)酶量進行考察。將菌體分別于 25。C，30。C，35。C，40。C下培養(yǎng)24小時，加入底物，統(tǒng)一于30。C，200rpm搖床中 進行轉(zhuǎn)化。菌體濃度根據(jù)其OD值來判斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25-40°C下培養(yǎng)24小 時，菌體濃度相差不大，因為24小時后菌體生長已達到穩(wěn)定期，故最終濃度 相差不大。而酶活為在30°C下培養(yǎng)的培養(yǎng)液最高，25。C,35°C,40°C下培養(yǎng)液 的酶活分別為30。C培養(yǎng)液酶活的80%，43%和25%。因此確定30°C為菌體最 佳產(chǎn)酶溫度，即最佳培養(yǎng)溫度。 實施例5反應(yīng)液(即含胞外酶上清液)的制備
將菌種從斜面接種，進行種子液搖瓶培養(yǎng)24小時。然后將種子液按5%接 種量接入2L生物反應(yīng)器，攪拌培養(yǎng)24小時。將得到的培養(yǎng)液在10，000g的離 心力，4°C除去菌體得到上清液。此上清即作為薄荷醇酯水解的反應(yīng)液。測定 其初始pH為7.5。培養(yǎng)基成分為7.5g/L酵母抽提物，10g/L吐溫80, 0.2g/L 無水硫酸鎂，2g/L，磷酸氫二鉀，lg/L氯化鈉。 實施例6八異構(gòu)體外消旋乙酸薄荷醇酯不對稱水解
取實施例5中制備的反應(yīng)液50ml加入500ml搖瓶中，然后加入3.36g(15mmol)八異構(gòu)體外消旋乙酸薄荷醇酯,30。C下，200rpm搖床振蕩反應(yīng)20 小時。2倍體積正己烷萃取后，GC測定結(jié)果，有效轉(zhuǎn)化率為23X，生成L-薄荷 醇0.15g， ee{t>99%， de值為96X。 實施例7八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯不對稱水解
取實施例5中制備的反應(yīng)液50ml加入500ml搖瓶中，然后加入 3.54g(15mmol)八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯,30。C下，200rpm搖床振蕩反應(yīng)20 小時。2倍體積正己烷萃取后，GC測定結(jié)果，有效轉(zhuǎn)化率為21X,生成L-薄荷 醇0.14g，， ee值〉99X， de值為99X。
實施例8不同pH條件下八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯不對稱水解
取實施例5中制備的反應(yīng)液50ml加入500ml搖瓶中，然后加入 0.59g(2.5mmol)八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯,30。C下，200rpm搖床振蕩反應(yīng) 19小時。2倍體積正己垸萃取后，GC測定結(jié)果，有效轉(zhuǎn)化率為58X,生成L-薄 荷醇0.06g， ee值〉99X， de值為98.5X。
取實施例5中制備的反應(yīng)液50ml加入500ml搖瓶中，加入微量鹽酸溶液調(diào) 節(jié)pH至3，然后加入0.59g(2.5mmol)八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯,30。C下， 200rpm搖床振蕩反應(yīng)19小時。2倍體積正己烷萃取后，GC測定結(jié)果，有效轉(zhuǎn) 化率為16X,生成L-薄荷醇0.018g， ee值〉99X， de值為98.6X。
取實施例5中制備的反應(yīng)液50ml加入500ml搖瓶中，加入微量NaOH溶液 調(diào)節(jié)片pH至12，然后加入0.59g(2.5mmol)八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯,30。C 下，200rpm搖床振蕩反應(yīng)19小時。2倍體積正己烷萃取后，GC測定結(jié)果，有 效轉(zhuǎn)化率為7X,生成L-薄荷醇0.008g， ee值〉99X， de值為98.8X。 實施例9不同溫度下八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯不對稱水解
取實施例5中制備的反應(yīng)液50ml加入500ml搖瓶中，然后加入 0.59g(2.5mmol)八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯，20。C下，200rpm搖床振蕩反應(yīng) 19小時。2倍體積正己烷萃取后，GC測定結(jié)果，有效轉(zhuǎn)化率為45%,生成L-薄荷醇0.05g， ee值〉99X， de值為98.3X。
取實施例5中制備的反應(yīng)液50ml加入500ml搖瓶中，然后加入 0.59g(2.5mmol)八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯,40。C下，200rpm搖床振蕩反應(yīng) 19小時。2倍體積正己烷萃取后，GC測定結(jié)果，有效轉(zhuǎn)化率為74X，生成L-薄 荷醇0.08g， ee值92.2^， de值為90.1X。 實施例10
從斜面接種蘇云金芽孢桿菌(^^7/w ^/n'wg/e似的于搖瓶培養(yǎng)種子液20小
9時；將種子液以5%接種量接入1L發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)20小時，培養(yǎng)溫度為 20。C;培養(yǎng)基成分為:5g/L酵母抽提物，7g/L吐溫80， 0.15g/L無水硫酸 鎂，1.5g/L磷酸氫二鉀,0.8g/L氯化鈉。將發(fā)酵培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液在10,000g的 離心力，6。C下除去菌體得到含有胞外脂肪酶的發(fā)酵上清液，初始pH為7，用 鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3。取50ml發(fā)酵上清液中加入0.56g(50mmol/L)八異構(gòu)體外消 旋乙酸薄荷醇酯進行不對稱水解反應(yīng)，得到L-薄荷醇及未水解的薄荷醇酯，其 反應(yīng)溫度為20。C。 l倍體積的正己垸萃取，得到的L-薄荷醇及薄荷醇醇酯混合 物采用柱狀色譜分離，洗脫液為1: 8的乙酸乙酯和正己烷混合液，分離，在 70°C下低壓蒸餾除去溶劑，得到L-薄荷醇0.04g。 GC檢測得到的薄荷醇，e.e 值為98.7%,丄6子直為96.2%。 實施例11
從斜面接種蘇云金芽孢桿菌(^^7/ws A"n'wg/e"w力于搖瓶培養(yǎng)種子液30小 時；將種子液以10%接種量接入2L發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)30小時，培養(yǎng)溫度為 30°C;培養(yǎng)基成分為10g/L酵母抽提物，10g/L吐溫80， 0.25g/L無水硫酸 鎂,2.5g/L磷酸氫二鉀，1.2g/L氯化鈉。將發(fā)酵培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液在10,000g的 離心力，6°C下離心除去菌體得到含有胞外脂肪酶的發(fā)酵上清液，初始pH為 8，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至12。取1000ml發(fā)酵上清液中加入 165g(700mmol/L)丙酸薄荷醇酯進行不對稱水解反應(yīng)，得到L-薄荷醇及未水解 的薄荷醇酯，其反應(yīng)溫度為40。C。 3倍體積的正己烷萃取，得到的L-薄荷醇及 薄荷醇醇酯混合物采用柱狀色譜分離，洗脫液為1:10的乙酸乙酯和正己烷混 合液，分離，在80°C下低壓蒸餾除去溶劑，得到L-薄荷醇6.5g。 GC檢測得 到的薄荷醇，6.6值為98.7%，(1.6值為98.2%。 表征
薄荷醇旋光角測定
(a) 20D=-50.3o(c=1.0,CH2Cl2) 天然1^薄荷醇旋光值一般介于-49 -50°
'H國NMR(CDCl3， 500MHz)相對TMS: 0.82(d; J=6.9; 3H); 0.85(d; 1H); 0.93 (2d; 6H); 0.98 (m; 2H); 1.13 (d; 1H); 1.42-1.49 (m; 2H); 1.62 (m; 1H); 1.68 (m; 1H); 1.98 (d; 1H); 2.18 (2d; 1H); 3.42 (2d; 1H)。 13C-NMR(CDC13， 500MHz)相對TMS: 16,17; 21.02; 22.23; 23.23; 25.93; 31.68; 34.60; 45.12; 50 22; 71.62。
權(quán)利要求
1、一種蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，其特征在于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3189。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蘇云金芽孢桿菌(^^7/w A"n'wg&"^),其特 征在于所述的蘇云金芽孢桿菌(B"c///^ A"Wwg/m^)分泌的胞外酶為脂肪酶
3、 一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述蘇云金芽孢桿菌的L-薄荷醇的制備方法，其 特征在于包括如下步驟1) 從斜面接種蘇云金芽孢桿菌0^"7/w Am7>2g/era&)于搖瓶培養(yǎng)種子液 20 30小時；2) 將種子液以5 10%接種量接入1 2L發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)20 30小時， 培養(yǎng)溫度為20 30。C;3) 將發(fā)酵培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液體在8， 000 10,000g的離心力，4 6。C離 心除去菌體得到含有胞外脂肪酶的發(fā)酵上清液，初始pH為7 8，用鹽酸或氫 氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3 12。4) 在50ml 1000ml發(fā)酵上清液中加入50 700mmol/L八異構(gòu)體外消旋薄 荷醇酯進行不對稱水解反應(yīng)，得到L-薄荷醇及未水解的薄荷醇酯，其反應(yīng)溫度 為20 40。C。5) 用1 3倍體積的正己烷萃取，得到的L-薄荷醇及薄荷醇醇酯混合物采 用柱狀色譜分離，洗脫液為1: 8 1:10的乙酸乙酯和正己烷混合液，分離，在 70 80。C下低壓蒸餾除去溶劑，得到L-薄荷醇。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種L-薄荷醇的制備方法，其特征在于所述的八 異構(gòu)體外消旋薄荷醇酯為乙酸薄荷醇酯或丙酸薄荷醇酯。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種L-薄荷醇的制備方法，其特征在于所述的 液培養(yǎng)基和發(fā)酵液培養(yǎng)基成份組成為吐溫80 7 10g/L， 酵母抽提物 5 10g/L, 氯化鈉 0.8 1.2g/L， 無水硫酸鎂 0.15 0.25g/L， 磷酸氫二鉀 1.5 2.5g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蘇云金芽孢桿菌及其L-薄荷醇制備方法。蘇云金芽孢桿菌保藏號為CGMCC No.3189。方法步驟1)從斜面接種蘇云金芽孢桿菌于搖瓶培養(yǎng)種子液；2)將種子液接入1～2L發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)；3)將發(fā)酵培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液體離心除去菌體得到含有胞外脂肪酶的發(fā)酵上清液，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值；4)在發(fā)酵上清液中加入八異構(gòu)體外消旋薄荷醇酯進行不對稱水解反應(yīng)，得到L-薄荷醇及未水解的薄荷醇酯；5)用正己烷萃取，得到混合物采用柱狀色譜分離，分離，得到L-薄荷醇。提出蘇云金芽孢桿菌，并且該菌能分泌的高效的脂肪酶。能夠高效選擇性的催化水解八異構(gòu)體外消旋乙酸薄荷醇酯或八異構(gòu)體外消旋丙酸薄荷醇酯混合物，得到高純度的L-薄荷醇。
文檔編號C12N1/20GK101671639SQ20091010211
公開日2010年3月17日 申請日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者瓊 葉, 吳堅平, 彥 孟, 剛 徐, 楊立榮 申請人:浙江大學(xué)