專利名稱：：不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：超氧化物歧化酶(SOD)是一類重要的超氧陰離子自由基清除劑，可用于防治過(guò)量超氧陰離子自由基引起的疾病和機(jī)體損傷，如糖尿病、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病、放射性損傷、缺血再關(guān)注損傷等。迄今為止，科學(xué)家已從細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、藻類、昆蟲、魚類、植物和哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)都分離得到了SOD?；诮饘佥o基不同，這些SOD至少可以分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三種類型。一般來(lái)說(shuō)，F(xiàn)e-SOD是被認(rèn)為存在于較原始的生物類群中的一種SOD類型；Mn-SOD是在Fe-SOD基礎(chǔ)上進(jìn)化而來(lái)的一種蛋白類型，由于任何來(lái)源的Mn-SOD和Fe-SOD的一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性都很高，均不同于Cu/Zn-SOD的序列，可見它們來(lái)自同一個(gè)祖先；Cu/Zn-SOD分布最廣，是一種真核生物酶，廣泛存在于動(dòng)物的血、肝和菠菜葉、刺梨等生物體中。但是，以上那些天然來(lái)源超氧化物歧化酶存在一定的抗原性、體內(nèi)半衰期短、穩(wěn)定性差和不易吸收等缺陷，限制了其實(shí)際應(yīng)用。克服超氧化物歧化酶缺陷的方法主要是對(duì)其分子進(jìn)行化學(xué)修飾，天然的Cu/Zn-SOD結(jié)構(gòu)擁有20個(gè)可用于結(jié)構(gòu)修飾的胺基，這些基團(tuán)的存在為結(jié)構(gòu)修飾提供了結(jié)構(gòu)修飾的位點(diǎn)。目前的修飾主要針對(duì)天然來(lái)源豐富的Cu/Zn-SOD，采用的修飾劑有聚乙二醇(USP5066590)、右旋糖酐、低分子肝素、硫酸軟骨素、聚甘露糖等。這些物質(zhì)修飾后其免疫原性降低、體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)、穩(wěn)定性增加。但這些結(jié)合物活性保持率不高、分子量大不易吸收，且一般修飾操作復(fù)雜，反應(yīng)難于控制，反應(yīng)原料毒性較大，對(duì)于治療與超氧陰離子自由基有關(guān)的疾病療效并不十分理想。采用小分子物質(zhì)修飾超氧化物歧化酶的報(bào)道較少，如閻家麒等人采用月桂酸修飾超氧化物歧化酶(閻家麒，謝文正月桂酸修飾超氧化物歧化酶的制備及其性質(zhì)研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1994,21(2):154-157)，顯著性降低了Cu/Zn-超氧化物歧化酶的抗原性，增強(qiáng)了其穩(wěn)定性。但還存在如下不足修飾后Cu/Zn-SOD活性保持率不是很高，只有85%，此外月桂酸屬于飽和脂肪酸本身沒(méi)有生理活性，無(wú)法發(fā)揮脂肪酸和SOD的協(xié)同效應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的首要技術(shù)問(wèn)題是提供一種不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物，以提高Cu/Zn-超氧化物歧化酶的穩(wěn)定性、降低其免疫原性，使其具有更好的使用效果和使用范圍。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一類不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物，Cu/Zn-超氧化物歧化酶上的自由氨基與不飽和脂肪酸上的羧基以酰胺鍵的形式結(jié)合，一個(gè)Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子結(jié)合不多于20個(gè)不飽和脂肪酸分子。本發(fā)明所述的不飽和脂肪酸，其碳鏈結(jié)構(gòu)中至少含有一個(gè)碳-碳雙鍵的烯基鍵，其碳鏈長(zhǎng)度推薦為16-26。優(yōu)選所述的不飽和脂肪酸為亞油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。不飽和脂肪酸具有重要的生理活性，如亞油酸和亞麻酸是人體必須脂肪酸，分別是w-6和co-3不飽和脂肪酸的前體；不飽和脂肪酸中花生四烯酸參與多種生理代謝功能，二十二碳六烯酸是腦和視網(wǎng)膜的重要脂質(zhì)成分。不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜磷脂的重要成分，其成分的改變可影響膜的流動(dòng)性和某些酶的活性以及激素與受體的結(jié)合和信號(hào)的傳遞。本發(fā)明采用具有重要生理活性的小分子不飽和脂肪酸修飾Cu/Zn-超氧化物歧化酶，可以發(fā)揮小分子不飽和脂肪酸與Cu/Zn-超氧化物歧化酶的協(xié)同抗氧化作用。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種上述不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，該工藝合成方法簡(jiǎn)便，工藝穩(wěn)定性好，產(chǎn)品性能良好。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案'一種不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，先是采用二氯亞砜活化法或者N-羥基琥珀酰亞胺活化法活化不飽和脂肪酸上的羧基，得到不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物；然后將Cu/Zn-超氧化物歧化酶與不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物加入pH6.09.0緩沖溶液中，在03(TC下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完全后采用預(yù)冷丙酮沉淀和葡聚糖凝膠柱層析法分離不飽和脂肪酸超氧化物歧化酶修飾物，再經(jīng)過(guò)冷凍干燥制得粉末狀不飽和脂肪酸超氧化物歧化酶修飾物。本發(fā)明推薦所述Cu/Zn-超氧化物歧化酶與不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物的投料摩爾比為1:5100，優(yōu)選1:20-40，其中Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子量以30000計(jì)算，不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物的摩爾數(shù)以不飽和脂肪酸的當(dāng)量計(jì)。所述二氯亞砜活化法通?？砂凑杖缦逻M(jìn)行在無(wú)溶劑條件下或是在有機(jī)溶劑A中，將不飽和脂肪酸和過(guò)量的二氯亞砜在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)24小時(shí)，充分反應(yīng)后回收溶劑(除去過(guò)量的二氯亞砜或者除去有機(jī)溶劑A和過(guò)量的二氯亞砜)即得不飽和脂肪酰氯，即為所述的不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物。所述的有機(jī)溶劑A可選自下列之一石油醚、環(huán)已烷、正已烷等低級(jí)烷烴。所述的不飽和脂肪酸與二氯亞砜的投料摩爾比推薦為1:25，所述的有機(jī)溶劑A的體積用量以不飽和脂肪酸的質(zhì)量計(jì)為35ml/g。二氯亞砜活化法具有原料易得、價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明推薦所述的Cu/Zn-超氧化物歧化酶與不飽和脂肪酰氯在030'C下攪拌反應(yīng)0.5~2小時(shí)，優(yōu)選在1525'C下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。所述的N-羥基琥珀酰亞胺活化法通常可按照如下進(jìn)行將不飽和脂肪酸溶于有機(jī)溶劑B中，加入N-羥基琥珀酰亞胺和N,N，-二環(huán)己基碳酰亞胺，溶液在2040'C反應(yīng)1020小時(shí)后，過(guò)濾取濾液，經(jīng)純化得N-羥基琥珀酰亞胺不飽和脂肪酸酯，即為所述的不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物。所說(shuō)的有機(jī)溶劑B可選自下列之一N,N，-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、四氫呋喃。所述的不飽和脂肪酸、N-羥基琥珀酰亞胺和N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺的投料摩爾比推薦為1:2.54:2.54。所述的有機(jī)溶劑B的體積用量以不飽和脂肪酸的質(zhì)量計(jì)為510ml/g。所述的純化可采用硅膠柱層析，推薦洗脫劑石油醚乙醚=1:1。N-羥基琥珀酰亞胺活化合成法具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好，而且合成得到的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物具有極高的活性保持率的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明推薦所述的超氧化物歧化酶與N-羥基琥珀酰亞胺不飽和脂肪酸酯在0-3(TC下攪拌反應(yīng)i53(;小時(shí)，優(yōu)選在203(TC下攪拌反應(yīng)2025小時(shí)。本發(fā)明制得的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物可用于制備防治氧自由基引起的各類疾病的藥物，并可作為保健食品、化妝品添加劑應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明制得的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物具有極高的活性保持率，明顯高于大分子修飾的Cu/Zn-超氧化物歧化酶，同時(shí)也高于飽和脂肪酸修飾Cu/Zn-超氧化物歧化酶。與夭然Cu/Zn-超氧化物歧化酶相比不僅具有抗原性低、半衰期長(zhǎng)、穩(wěn)定性高、親脂性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且能充分發(fā)揮亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸特有的調(diào)節(jié)心血管、抗炎、抗腫瘤等特性，將其制成藥物對(duì)于防治氧自由基引起的各類疾病有重要作用，將會(huì)比天然Cu/Zn-超氧化物歧化酶及其他結(jié)合物有更好使用效果和使用范圍。此外，用作保健食品、化妝品添加劑，也比天然Cu/Zn-超氧化物歧化酶更具優(yōu)越性，如穩(wěn)定性明顯增7加，從而能在保健食品和化妝品中較長(zhǎng)時(shí)間地保持較高活性，且亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸是人體必須脂肪酸，在西方國(guó)家大量食用。圖1為實(shí)施例4得到的天然Cu/Zn-SOD(■)，亞油酸-Cu/Zn-SOD(o)和亞麻酸-Cu/Zn-SOD0)的熱穩(wěn)定性曲線圖。具體實(shí)施例方式為了更好地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，下面將描述本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例，但這些實(shí)施例絕不是對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1:二氯亞砜活化法合成不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物于四口燒瓶中裝上機(jī)械攪拌，回流冷凝器，滴液漏斗和溫度計(jì)，加入6ml石油醚，氯化亞砜2ml，通入氮?dú)猓〗禍刂?。C以下，緩慢滴加不飽和脂肪酸酸(亞油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸)1.8克，滴加時(shí)維持溫度在5'C左右，滴加完畢后，室溫下反應(yīng)3小時(shí)。蒸除石油醚和過(guò)量氯化亞砜，得不飽和脂肪酰氯。取1.2gCu/Zn-SOD溶于弱堿性磷酸緩沖溶液中，20'C下攪拌溶解。氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢加入活化的不飽和脂肪酸，并加入少量氫氧化鈉溶液維持pH為9.0，隨即升溫至25°C，攪拌60min迅速降至室溫，加入3倍體積預(yù)冷(-20C)丙酮，離心取沉淀經(jīng)葡聚糖G-100凝膠柱分離，'以水為洗脫溶劑，收集活性洗脫液，冷凍干燥制得粉末狀不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物。對(duì)比例1:飽和脂肪酸月桂酸修飾的Cu/Zn-SOD的制備于四口燒瓶中裝上機(jī)械攪拌，回流冷凝器，滴液漏斗和溫度計(jì)，加入6ml石油醚，氯化亞砜2ml，通入氮?dú)猓〗禍刂?t:以下，緩慢滴加月桂酸1.8克，滴加時(shí)維持溫度在5。C左右，滴加完畢后，室溫下反應(yīng)3小時(shí)。蒸除石油醚和過(guò)量氯化亞砜，得不飽和脂肪酰氯。取1.2gCu/Zn-SOD溶于弱堿性磷酸緩沖溶液中，2(TC下攪拌溶解。氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢加入活化的月桂酸，并加入少量氫氧化鈉溶液維持pH為9.0，隨即升溫至25°C，攪拌60min迅速降至室溫，加入3倍體積預(yù)冷(-20°C)丙酮，離心取沉淀經(jīng)葡聚糖G-100凝膠柱分離，以水為洗脫溶劑，收集活性洗脫液，冷凍干燥制得粉末狀月桂酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物。實(shí)施例2:N-羥基琥珀酰亞胺法合成不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物取lg不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸)溶于8ml1,4-二氧六環(huán)中，然后加入200mgN-羥基琥珀酰亞胺和400mgN',N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，25°C條件下反應(yīng)24小時(shí)。過(guò)濾取濾液旋蒸得白色固體，乙酸乙酯乙醚=10:1硅膠柱分離得活化的不飽和脂肪酸酯。稱取500mgCu/Zn-超氧化物歧化酶溶于10ml0.1mol/L的磷酸緩沖溶液中(pH8.0)，攪拌下加入N-羥基琥珀酰亞胺不飽和脂肪酸酯，25'C攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)液倒入20ml預(yù)冷丙酮(-2(TC)，離心取沉淀經(jīng)葡聚糖凝膠G-100柱分離，以水為洗脫溶劑，收集活性洗脫液，冷凍干燥制得粉末狀不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶結(jié)合物。'實(shí)施例3:飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸修飾的Cu/Zn-SOD性能比較本發(fā)明采用了對(duì)比例1合成的飽和脂肪酸-Cu/Zn氧化物歧化酶結(jié)修飾物(月桂酸-Cu/Zn-SOD)和實(shí)施例1合成的不飽和脂肪酸-Cu/Zn氧化物歧化酶修飾物(亞油酸-Cu/Zn-SOD、亞麻酸-Cu/Zn-SOD)。其性能如表1所示表1月桂酸-Cu/Zn-SOD修飾物、不飽和脂肪酸-Cu/Zn-SOD修飾物的性能比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表l可以看出，在氨基修飾率基本相同的情況下，亞油酸-Cu/Zn-SOD和亞麻酸-Cu/Zn-SOD活性回收率高達(dá)104%和98%，均明顯高于飽和脂肪酸(月桂酸)修飾的Cu/Zn-SOD。也明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道的大分子物質(zhì)修飾Cu/Zn-SOD，如羧甲基半胱氨酸(CMCH)修飾Cu7Zn-SOD活性回收率為57X，低分子肝素(LMW)修飾Cu/Zn-SOD活性回收率為63.9%，聚甘露糖修(Man)飾Cu/Zn-SOD活性回收率為52%。這可能是因?yàn)閮煞矫娴脑蛞环矫嫘》肿硬伙柡椭舅嵝揎桟u/Zn-SOD較好地保留了酶的催化活化結(jié)構(gòu)；另一方面不飽和脂肪酸本身具有抗氧化作用，修飾Cu/Zn-SOD后發(fā)揮了協(xié)同抗氧化作用。實(shí)施例4:天然Cu/Zn-SOD與不飽和脂肪酸修飾的Cu/Zn-SOD的熱穩(wěn)定性比較由圖1可以看出，未修飾的天然Cu/Zn-SOD與實(shí)施例2制得的不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸)修飾的Cu/Zn-SOD在耐熱穩(wěn)定性方面比較，差異顯著。在75°C水浴保溫下天然Cu/Zn-SOD迅速失活，保溫2小時(shí)后活性保持率僅為49%。亞油酸、亞麻酸修飾的Cu/Zn-SOD均可以顯著增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性，保溫兩小時(shí)后活性保持率分別為77%和76%。實(shí)施例5:天然Cu/Zn-SOD與不飽和脂肪酸修飾的Cu/Zn-SOD的耐酸堿穩(wěn)定性天然Cu/Zn-SOD、實(shí)施例2制得的亞油酸-Cu/Zn-SOD和亞麻酸-Cu/Zn-SOD在25。C分別置于pH5.2的酸性溶液和pH10.8的堿性溶液中進(jìn)行處理，結(jié)果如表2所示表2天然Cu/Zn-SOD、亞油酸和亞麻酸-Cu/Zn-SOD25°C的耐酸堿穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表2可以看出，經(jīng)過(guò)6h的酸堿處理，兩種修飾Cu/Zn-SOD在酸性環(huán)境和堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性均比天然Cu/Zn-SOD穩(wěn)定性高。在pH5.2時(shí)，亞油酸-Cu/Zn-SOD和亞麻酸-Cu/Zn-SOD剩余活力分別為78%和79%，遠(yuǎn)高于天然的Cu/Zn-SOD的53%;在pH10.8亞油酸-Cu/Zn-SOD和亞麻酸-Cu/Zn-SOD剩余活力分別為73%和78%，亦高于天然Cu/Zn_SOD的58%。實(shí)施例6:天然Cu/Zn-SOD與不飽和脂肪酸修飾的Cu/Zn-SOD的抗蛋白酶穩(wěn)定性取天然Cu/Zn-SOD、實(shí)施例2的亞油酸修飾的Cu/Zn-SOD和亞麻酸修飾的Cu/Zn-SOD，進(jìn)行了抗蛋白酶穩(wěn)定性研究(胃蛋白酶、胰蛋白酶)，結(jié)果如表3所示:表3天然CWZn-SOD、不飽和脂肪酸修飾的Cu/Zn-SOD抗蛋白酶穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表3可知，天然Cu/Zn-SOD在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下迅速失活，當(dāng)作用60分鐘時(shí)活性保持率分別為22%和55%，相同條件下亞油酸修飾Cu/Zn-SOD和亞麻酸修飾Cu/Zn-SOD活性保持率分別高于50%和70%。表明Cu/Zn-SOD經(jīng)過(guò)不飽和脂肪酸修飾后，其對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受性明顯提高,可以明顯提高其體內(nèi)實(shí)際使用效果。權(quán)利要求1、一類不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物，其特征是Cu/Zn-超氧化物歧化酶上的自由氨基與不飽和脂肪酸上的羧基以酰胺鍵的形式結(jié)合，一個(gè)Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子結(jié)合不多于20個(gè)不飽和脂肪酸分子；所述的不飽和脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度為16～26。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物，其特征在于所述的不飽和脂肪酸為亞油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。''3、—種如權(quán)利要求1所述的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，其特征在于釆用二氯亞砜活化法或者N-羥基琥珀酰亞胺活化法活化不飽和脂肪酸上的羧基，得到不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物；將Cu/Zn-超氧化物歧化酶與不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物加入pH6.0~9.0緩沖溶液中，在03(TC下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完全后采用預(yù)冷丙酮沉淀和凝膠柱層析法分離不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物，再經(jīng)過(guò)冷凍干燥制得粉末狀不飽和脂肪酸-CWZn-超氧化物歧化酶修飾物。4、如權(quán)利要求3所述的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，其特征在于所述Cu/Zn-超氧化物歧化酶與不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物的投料摩爾比為l:5100，其中Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子量以30000計(jì)算，不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物的摩爾數(shù)以不飽和脂肪酸的當(dāng)量計(jì)。5、如權(quán)利要求3或4所述的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，其特征在于所述二氯亞砜活化法具體如下在無(wú)溶劑條件下或在有機(jī)溶劑A中，不飽和脂肪酸和過(guò)量的二氯亞砜在氮?dú)獗Ｗo(hù)下在204(TC反應(yīng)24小時(shí)，回收溶劑即得不飽和脂肪酰氯，即為所述的不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物。6、如權(quán)利要求5所述的不飽和脂肪酸Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑A選自下列之一石油醚、環(huán)己垸、正己烷。7、如權(quán)利要求5所述的不飽和脂肪酸Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，其特征在于所述的Cu/Zn-超氧化物歧化酶與不飽和脂肪酰氯在0-3(TC下攪拌反應(yīng)0.52小時(shí)。8、如權(quán)利要求3或4所述的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，其特征在于所述的N-羥基琥珀酰亞胺活化法具體如下將不飽和脂肪酸溶于有機(jī)溶劑B中，加入N-羥基琥珀酰亞胺和N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，在204(TC反應(yīng)10~20小時(shí)后，過(guò)濾取濾液，經(jīng)純化得N-羥基琥珀酰亞胺不飽和脂肪酸酯，即為所述的不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物。9、如權(quán)利要求8所述的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑B選自下列之一N,N，-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、四氫呋喃。10、如權(quán)利要求8所述的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物的制備方法，其特征在于所述的Cu/Zn-超氧化物歧化酶與N-羥基琥圯酰亞胺不飽和脂肪酸酯在030。C下攪拌反應(yīng)10~30小時(shí)。全文摘要本發(fā)明公開了一類不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物及其制備，所述Cu/Zn-超氧化物歧化酶上的自由氨基與不飽和脂肪酸上的羧基以酰胺鍵的形式結(jié)合，一個(gè)Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子結(jié)合不多于20個(gè)不飽和脂肪酸分子；所述的不飽和脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度為16～26。所述的制備方法是采用二氯亞砜活化法或者N-羥基琥珀酰亞胺活化法活化不飽和脂肪酸上的羧基，得到不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物；將Cu/Zn-超氧化物歧化酶與不飽和脂肪酸的活化產(chǎn)物加入pH6.0～9.0緩沖溶液中，在0～30℃下攪拌反應(yīng)，制得目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明所述的不飽和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修飾物，充分發(fā)揮不飽和脂肪酸和Cu/Zn-SOD的協(xié)同作用，提高了Cu/Zn-超氧化物歧化酶的穩(wěn)定性，降低其免疫原性，具有更好的使用效果和使用范圍。文檔編號(hào)C12N9/96GK101633919SQ20091010215公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2009年8月17日優(yōu)先權(quán)日2009年8月17日發(fā)明者于海寧,侯曉蓉,單偉光,占扎君,周志剛,嵐唐,李成平,王建偉申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)