專利名稱：一種新型米根霉固定化發(fā)酵載體單元及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵用載體，尤其涉及一種米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵載體。
背景技術(shù)：
目前，利用米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸是目前工業(yè)生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的主要方法，發(fā)酵方式主要分為游離發(fā)酵和固定化發(fā)酵([l]Lorenzo M. L. D., Crystallization behavior of poly (L-lactic acid). European Polymer J. 2005,41: 569 — 575; [2]Maas, R.H.， Bakker R.R., Eggink G"Lactic acid production from xylose by the fungus朋/z甲w o，ae, Appl. Microbiol.Biotechnol., 2006,72: 861-868)。其中固定化發(fā)酵有菌體密度高、反應(yīng)速率快、穩(wěn)定性好、使用壽命長、可重復(fù)利用、便于實(shí)現(xiàn)催化劑與發(fā)酵液分離等優(yōu)點(diǎn)，越來越引起研究者們的關(guān)注。
目前的固定載體類型主要有纖維吸附([3]寧尚勇，李十中，真菌固定床反應(yīng)器發(fā)酵L(+)-乳酸的初步研究，食品與發(fā)酵工業(yè)，2006， 32(3):22-25; [4]張定豐，林建平，金志華，岑沛霖，用于固定化米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的轉(zhuǎn)盤反應(yīng)器及其放大，化學(xué)工程，2004， 32 (1): 34-37)，海藻酸鹽凝膠包埋([5]出處Hang Y., Hamamci H., Woodams E.E.,Production of L(+)-lactic acid by 7 /z/zopws o，ae immobilized in calcium alginate gels,Biotechnol Lett.,1989, 11:119-120)，聚氨酯吸附([6]陳育如，夏黎明，岑沛霖，聚氨酯吸附固定米根霉發(fā)酵L-乳酸的優(yōu)化，南京師范大學(xué)學(xué)報(工程技術(shù)版)，2002， 2( 1): 52-55)等。纖維式載體又由于其來源廣泛、價格低廉、固定效果優(yōu)良等被廣泛研究。
以纖維為載體的反應(yīng)器有床式反應(yīng)器([7] A.Tay and S.T.Yang， Production of L(+)-lacticacid from glucose and starch by immobilized cells of朋/zopws in a rotating fibrous bedbioreactor,Biotechnol.Bioeng., 2002， 80:1-12)、轉(zhuǎn)盤式反應(yīng)器(見文獻(xiàn)[4])等。
但它們共同的缺陷在于(1)需要大量的動力消耗；(2)當(dāng)擴(kuò)大試驗(yàn)時，所有參數(shù)和指標(biāo)難以重現(xiàn)，甚至無法達(dá)到。主要原因在于反應(yīng)器中的菌體載體與反應(yīng)器尺寸成比例，但是發(fā)酵動力學(xué)及流體力學(xué)的影響卻沒有對應(yīng)的比例關(guān)系，使得優(yōu)化數(shù)據(jù)難以重現(xiàn)，從而
難以擴(kuò)大工業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的纖維式固定發(fā)酵反應(yīng)器擴(kuò)大時，載體與反應(yīng)器擴(kuò)大相應(yīng)比例難以控
制的困難，本發(fā)明專利提供一種固定化發(fā)酵載體以及使用方法，該載體不僅能在三角瓶中進(jìn)行小型平行篩選實(shí)驗(yàn)，而且能進(jìn)行組合和改造，在現(xiàn)有的柱式及罐式反應(yīng)器中擴(kuò)大試驗(yàn)。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是
一種新型米根霉固定化載體單元，它以不銹鋼網(wǎng)片為支撐骨架，形成六枝杈星狀骨架結(jié)構(gòu)，以棉布為表面材料，包裹在不銹鋼網(wǎng)片表面，形成六枝杈星狀載體單元。
發(fā)酵時，只需直接將所述載體單元滅菌后置于發(fā)酵裝置內(nèi)的發(fā)酵液中，細(xì)胞就會吸附固定在棉布上；所述發(fā)酵裝置采用三角瓶、柱式反應(yīng)器或發(fā)酵罐，使用同樣大小的載體單元，并根據(jù)發(fā)酵的直徑及裝液深度，選取相應(yīng)數(shù)量的載體單元。多個載體單元之間上下串聯(lián)，長度與反應(yīng)器中的裝液深度一致。根據(jù)反應(yīng)器直徑可以增加載體單元串的數(shù)量，將其縱向連接、平行排列，達(dá)到對發(fā)酵空間的最大化利用。
本發(fā)明的有益效果是，采用以棉布纖維為載體、不銹鋼支架作支撐的固定化發(fā)酵載體結(jié)構(gòu)，達(dá)到米根霉菌絲層既均勻生長又能維持六枝星狀空間結(jié)構(gòu)。載體單元采用了六枝杈星狀載體單元，可以在三角瓶、柱式反應(yīng)器、發(fā)酵罐中使用同樣大小的發(fā)酵單元，唯一改變的只是所用載體單元的數(shù)量，在米根霉的形態(tài)控制和產(chǎn)率提高方面有顯著效果。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。圖l是本發(fā)明的載體單元。A是未包裹棉布前的不銹鋼網(wǎng)片圖，B為棉布包裹后的水平截面圖，C為載體單元的三維圖。
圖2載體單元上下連接成串的示意圖。圖3載體單元平行排列成布置的示意圖。
圖中1、不銹鋼網(wǎng)片，2、棉布，3、載體單元，4、載體單元串，5、發(fā)酵罐。
具體實(shí)施例方式
(一) 載體單元的制作和使用，參見圖l、圖2和圖3:
新型米根霉固定化載體單元是以不銹鋼網(wǎng)片1為支撐骨架，形成六枝杈星狀骨架結(jié)構(gòu)，以棉布2為表面材料，包裹在不銹鋼網(wǎng)片1表面，形成六枝杈星狀載體單元3。
具體制作中，可以先制得長2至3cm，寬0.5cm不銹鋼網(wǎng)片1，再將棉布2包裹于表面，最后將三片網(wǎng)片的中心點(diǎn)合并，得到六枝之間的固定夾角為60。的載體單元3。
使用時，載體單元的大小相同，根據(jù)發(fā)酵容器的直徑及裝液深度，選取相應(yīng)數(shù)量的載體單元。參見圖2，從長度方向上，多個載體單元之間可以上下串聯(lián)，形成載體單元串4，使長度與反應(yīng)器中的裝液深度一致。參見圖3，從寬度方向上，根據(jù)發(fā)酵罐5的直徑可以增加載體單元串4的數(shù)量，將其平行排列，達(dá)到對發(fā)酵空間的最大化利用。
(二) 三角瓶中實(shí)驗(yàn)
實(shí)例l:將米根霉菌種As 3. 3462的孢子懸液接種至250ml三角瓶(含有50ml種子培養(yǎng)基，巳經(jīng)單獨(dú)滅菌的三個載體單元)，孢子濃度為107ml，在30。C， 180rpm搖床條件下培養(yǎng)。6小時以后，培養(yǎng)基中無孢子存在，表明已經(jīng)完全吸附在載體表面。24小時以后，將載體單元用無菌水沖洗，再轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基(80g/L葡萄糖)。48小時以后，葡萄糖消耗至零，L-乳酸濃度達(dá)到最大(49.5g/L)。同等條件下游離發(fā)酵的終產(chǎn)物濃度為30g/L,發(fā)酵時間為72小時。載體實(shí)驗(yàn)與同等條件下的游離發(fā)酵相比，產(chǎn)物濃度提高了 66. 7%，得率提高了 154%。(三) 生物反應(yīng)柱中實(shí)驗(yàn)
實(shí)例l:將八個載體單元上下串聯(lián)至15厘米，長度等于與200tnl的生物反應(yīng)柱中的裝 液深度。實(shí)驗(yàn)開始之前，載體單元串與反應(yīng)器一起空罐滅菌。隔夜放置以后，裝入種子培 養(yǎng)基，在12rC條件下，滅菌30分鐘。在3(TC下，將米根霉As 3.3462孢子懸液注入培 養(yǎng)基.濃度為107ml。靜置5-6小時，開始通入氧氣，通氣比為0.5vvm。 24小時后，菌 絲層明顯，發(fā)酵液中無可見的菌球或菌絲，檢測出乳酸濃度2.4gZL。將種子培養(yǎng)基放出， 并用無菌水沖洗載體串，再將培養(yǎng)基換為發(fā)酵培養(yǎng)基(80g/L葡萄糖)，并用NaOH調(diào)節(jié)pH。 36小時以后，葡萄糖濃度降節(jié)零，乳酸濃度達(dá)到最大(40g/L)。載體實(shí)驗(yàn)與游離發(fā)酵相 比，產(chǎn)物濃度提高了33%,得率提高了 166.6%。
將反應(yīng)柱繼續(xù)進(jìn)行分批填料的半連續(xù)發(fā)酵，在前5批(IO天)中，該體系的發(fā)酵最終 產(chǎn)物濃度都超過35g/L。而游離發(fā)酵因?yàn)樯L形態(tài)為菌絲菌團(tuán)，難以與菌液分離，只能進(jìn) 行單批實(shí)驗(yàn)。
(四) 發(fā)酵罐中實(shí)驗(yàn)
實(shí)例l:將三串載體串(每串含有八個載體單元)平行置于1L生物發(fā)酵罐中。實(shí)驗(yàn)丌
始之前，載體串與發(fā)酵罐一起空罐滅菌。隔夜放置以后，裝入種子培養(yǎng)基(50g/L葡萄糖)， 在121XJ條件下，滅菌30分鐘。在3(TC.下，將米根霉As 3.3462孢子懸液注入培養(yǎng)基， 濃度為106,/ml。靜置5-6小時，開始通入氧氣，通氣比為O. 5vvm。 24小時后，菌絲層明 顯，發(fā)酵液中無可見的菌球或菌絲，檢測出乳酸濃度3. lg/L。將種子培養(yǎng)基放出，并用 無菌水沖洗載體串，再將培養(yǎng)基換為發(fā)酵培養(yǎng)基(80g/L葡萄糖)，并用NaOH調(diào)節(jié)pH。 96 小時以后，葡萄糖濃度降至零，乳酸濃度達(dá)到最大(68.8g/L)。載體實(shí)驗(yàn)與游離發(fā)酵相比， 產(chǎn)物濃度提高了 129. 3%,得率提高了 72. 2%。
將發(fā)酵罐繼續(xù)進(jìn)行分批填料的半連續(xù)發(fā)酵，在前6批(24天)中，該體系的發(fā)酵最終 產(chǎn)物濃度都超過56g/L，得率超過70%。
權(quán)利要求
1、一種新型米根霉固定化載體單元，其特征在于，它以不銹鋼網(wǎng)片為支撐骨架，形成六枝杈星狀骨架結(jié)構(gòu)，以棉布為表面材料，包裹在不銹鋼網(wǎng)片表面，形成六枝權(quán)星狀載體單元。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型米根霉固定化載體單元，其特征在于，相鄰的枝杈夾角均為60。。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的新型米根霉固定化載體單元，其特征在于，所述不 銹鋼網(wǎng)片為矩形。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的新型米根霉固定化載體單元，其特征在于，所述形 成六枝杈星狀結(jié)構(gòu)一個枝杈的不銹鋼網(wǎng)片長2至3厘米，寬0. 5至1厘米。
5、 權(quán)利要求l所述米根霉固定化載體單元的使用方法，其特征在于，發(fā)酵時，只需 直接將所述載體單元滅菌后置于發(fā)酵裝置內(nèi)的發(fā)酵液中，細(xì)胞就會吸附固定在棉布上； 所述發(fā)酵裝置采用三角瓶、柱式反應(yīng)器或發(fā)酵罐，使用同樣大小的載體單元，并根據(jù)發(fā) 酵的直徑及裝液深度，選取相應(yīng)數(shù)量的載體單元。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述米根霉固定化載體單元的使用方法，其特征在于，根據(jù)反應(yīng) 器的裝液深度，多個載體單元之間從長度方向上上下串聯(lián)，長度與反應(yīng)器中的裝液深度 一致；根據(jù)反應(yīng)器的直徑，多個載體單元之間在寬度方向上平行排列，達(dá)到空間的最大 利用。
全文摘要
本發(fā)明提出一種新型米根霉固定化載體單元，它以不銹鋼網(wǎng)片為支撐骨架，形成六枝杈星狀骨架結(jié)構(gòu)，以棉布為表面材料，包裹在不銹鋼網(wǎng)片表面，形成六枝杈星狀載體單元。發(fā)酵時直接將所述載體單元滅菌后置于發(fā)酵裝置內(nèi)的發(fā)酵液中，細(xì)胞就會吸附固定在棉布上；在三角瓶、柱式反應(yīng)器、發(fā)酵罐中，均可以根據(jù)反應(yīng)器形狀和尺寸，通過串聯(lián)或增加載體數(shù)量達(dá)到篩選和放大的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br> 文檔編號C12N11/12GK101624589SQ20091010357
公開日2010年1月13日 申請日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者楊尚天, 珍 王, 王遠(yuǎn)亮 申請人:重慶大學(xué)