專利名稱：大豆檢疫性病毒病害多重實時熒光pcr檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種同時檢測煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒四種中一種或多種大豆病毒病害的簡單、快速、特異、靈敏的實時熒光PCR檢測 方法及其試劑盒。適合于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護等部門使用。
背景技術(shù)：
大豆(Glycine max)是我國重要的油料作物和糧食作物，也是世界上食用油和植 物蛋白的主要來源，在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位。目前我國大豆產(chǎn)量居世界第四位，但 仍然不能滿足國內(nèi)植物油及飼料蛋白加工的需要。隨著我國進口大豆的數(shù)量逐年遞增，各 種危害大豆生產(chǎn)的病害傳入的風險也逐漸增大。其中本發(fā)明涉及的四種大豆病毒病害是目 前嚴重影響大豆生產(chǎn)及貿(mào)易的病毒病害，具有重要的檢疫重要性和經(jīng)濟重要性。煙草環(huán)斑病毒(Tobacco Ringspot Virus,簡稱TRSV)是豇豆花葉病毒科 (Comoviridae)，線蟲傳多面體病毒屬(N印ovirus)的成員。其寄主范圍很廣，能夠侵染包 括豆類、瓜類、薯類、花卉和果樹等在內(nèi)的54科300余種植物，并引起重大經(jīng)濟損失。TRSV 可經(jīng)汁液摩擦接種、介體及種子傳播。其癥狀變化多樣，常有隱癥現(xiàn)象等，給常規(guī)診斷帶來 困難，甚至出現(xiàn)漏檢。該病毒分布于美國、加拿大、巴西、阿根廷等的30多個國家，中國僅山 東、寧夏和陜西有發(fā)生報道。南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus,簡稱ArMV)是豇豆花葉病毒科 (Comoviridae)，線蟲傳多面體病毒屬(^povirus)成員。ArMV寄主范圍廣泛，可侵染174 屬215種植物，自然侵染并危害多種瓜類、豆類、花卉和果樹，引起花葉、黃化褪綠、矮化、皺 縮甚至壞死等癥狀?？梢酝ㄟ^種子及鱗球、塊莖及苗木等無性繁殖材料遠距離傳播。目主 要分布在美國、加拿大、澳大利亞、荷蘭、比利時、新西蘭、南非、日本等20多個國家，中國尚 未有發(fā)生的報道。番茄環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus,簡稱ToRSV)是豇豆花葉病毒科 (Comoviridae)，線蟲傳多面體病毒屬(^povirus)的成員。1936年Price等首次報道在美 國新澤西州發(fā)現(xiàn)ToRSV。該病毒寄主范圍廣泛，能侵染105個屬157種單、雙子葉植物，常見 的自然寄主有番茄、煙草、大豆、葡萄、蘋果等具有重要經(jīng)濟價值的作物和果樹，造成嚴重的 經(jīng)濟損失。ToRSV在不同寄主上表現(xiàn)癥狀不同，但一般都引起植株矮化、葉片斑點、果實畸 形。ToRSV有多種傳播方式，在田間通過介體劍線蟲等昆蟲和嫁接傳播，而遠距離傳播主要 是靠種子、苗木調(diào)運。目前在美國、巴西、加拿大、澳大利亞等30多個國家有分布，中國尚無 發(fā)生報道。南芥菜花葉病毒(Southern bean mosaic virus,簡稱SBMV)屬于南芥菜花葉病毒 屬成員，侵染能力強，適應性廣。1942年Zawmey和Harter首先報道。該病毒自然狀況下可 引起菜豆、大豆、豇豆和黑綠豆的花葉、斑駁病害，導致花、果、種子數(shù)量下降，產(chǎn)量降低。該 病毒傳播途徑多樣，汁液和種子均能傳毒。主要包括SBMV-B和SBMV-C兩個株系，前者能侵 染菜豆的大多數(shù)品種，后者只能侵染豇豆。該病毒一直引起世界各國的高度重視。分布在美國、巴西、墨西哥、法國、印度等國家，中國僅貴州有分布。目前對上述四種病毒都存在多種檢測方法，但各個病毒采用不同的體系，不利于 高通量檢測工作的進行。并且在對同一種病毒檢測中，不同的檢測體系之間存在的誤差嚴 重影響檢測的準確性和可靠性。此外，在國內(nèi)外大豆上重要病毒病害檢測中還沒有實現(xiàn)了 多種病毒的同時檢測。隨著我國對進口大豆需求的增加，各種大豆病害傳入的風險也不斷 增加，對我國的大豆生產(chǎn)構(gòu)成巨大的潛在威脅。因此，在口岸檢疫部門采用簡單、快速、特 異、靈敏的檢測方法對其中具有嚴重影響的病害進行檢測，對保護我國大豆生產(chǎn)，防止其重 要檢疫性病原的傳入具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出快速、可靠、靈敏度 高、特異性強和價格便宜的檢測煙草環(huán) 斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒四種大豆病毒重要病害的引 物、寡核苷酸探針、試劑盒及多重實時熒光PCR檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的引物和寡核苷酸探針， 至少包括選自表1兩組以上病毒的一對引物和對應的寡核苷酸探針。表1多重實時熒光PCR檢測各種大豆病毒病害對應各組的引物和寡核苷酸探針一 覽表
引物和寡核
苷酸探針序列探針說明名稱
TRSY-ZFP 5 ’ - AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT -3'煙草環(huán)斑病毒
TRSV-ZRP 5，- TCCCC ATAGTTGA ACTGCC A -3'特異性檢測引 上表中探針5’和3’端標記的MAR、URA、JUP、SAT為熒光自淬滅基團，即其5’和3’ 標記的是同一基團，通過寡核酸連接進行熒光諧振能量傳遞。在擴增反應中，由于擴增酶的 5’外切酶作用將與模板匹配的探針切割，使兩個基團分開；在一定激發(fā)光條件下，熒光基團 發(fā)出自身波長的光子。不同的熒光信號標記類型其需要的激發(fā)光條件不同，能夠被收集到 的熒光信號也有所不同，從而實現(xiàn)多重檢測。本發(fā)明又提供了一種用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的試劑盒，至少包括根 據(jù)表1所述的兩組以上的病毒的一對引物和對應的寡核苷酸探針。本發(fā)明再提供了一種大豆病毒病害實時熒光PCR檢測方法采用的技術(shù)方案，包括 如下步驟步驟一設計檢測選自煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜 花葉病毒中兩種以上病毒的引物和寡核苷酸探針；步驟二 將步驟一中設計的兩種以上病毒的引物和寡核苷酸探針同時進行實時熒 光PCR反應，并優(yōu)化出合適的反應體系和反應條件；步驟三根據(jù)熒光信號類型判定檢測樣品的病毒。采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明突出的技術(shù)進步在于(1)設計出了同時檢測大豆上 四種重要病毒病害的多重實時熒光PCR快速檢測的引物、寡核苷酸探針和試劑盒，克服了 現(xiàn)有的分子檢測方法操作復雜或檢測靈敏度不高、或特異性不強、或重復性不好等缺點。 (2)本發(fā)明的多重實時熒光PCR檢測方法能同時檢測大豆上的四種重要病毒病害，在國內(nèi)外大豆檢疫性病毒病害的檢測中尚屬先例。(3)本發(fā)明適合大豆上四種重要病毒病害的多 重檢測。(4)由于本發(fā)明檢測快速、特異性強，特別適用于口岸檢疫等時效性要求特別強的 場合使用。綜上所述，采用本發(fā)明，能對實際檢疫和田間調(diào)查過程中所發(fā)現(xiàn)的病組織進行煙 草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒以及南芥菜花葉病毒四種病毒進行分子生 物學鑒定或檢測，其意義重大。


圖1四重實時熒光PCR特異性檢測結(jié)果。1為煙草環(huán)斑病毒TRSV組特異擴增結(jié)果；2為南方菜豆花葉病毒SBMV組特異擴增 結(jié)果；3為番茄環(huán)斑病毒ToRSV組特異擴增結(jié)果；8為南芥菜花葉病毒ArMV組特異擴增結(jié)果
具體實施例方式下面通過具體的實施例并對本發(fā)明作進一步詳細的描述。實例1大豆上四種重要病毒病害多重實時熒光PCR檢測及試劑盒一種用于大豆上四種重要病毒病害檢測的多重實時熒光PCR檢測的引物、寡核苷 酸探針及試劑盒，用于大豆上四種重要病毒病害的特異性檢測。先對煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒四種病毒 其近似種屬的外殼蛋白(Coat Protein簡稱CP)基因序列進行測序、比對分析，分別找出四 種病毒不同于其它病原菌及近似種的獨有的堿基位點。設計出的用于大豆病毒病害實時熒 光PCR檢測的引物具有如下的核酸序列 設計出的用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的寡核苷酸探針具有如下的核酸序列 應用上述引物和寡核苷酸探針可制成用于大豆上四種重要病毒病害多重實時熒 光PCR檢測的試劑盒。實施例2利用四重實時熒光PCR檢測方法對從寄主中提取的四種病毒RNA進行檢 測所用引物和寡核苷酸探針是實施例1中的引物和寡核苷酸探針。反轉(zhuǎn)錄PCR擴增(RT-PCR)體系總體積為10 μ L，各成分為RT buffer 5yL(T0Y0B0 公司)，5 μ M 引物對 0. 5 μ L，Enzyme mix 0· 5 μ L。反應條件37°C溫浴15min。四重實時熒光PCR檢測反應見表2。其檢測反應條件見表3。表2四重實時熒光PCR檢測反應體系(20ul)
ddH20補至20 μ 1體積
表3檢測反應條件 以四種病毒RT-PCR產(chǎn)物為陽性對照，以其它近似種屬病毒RT-PCR產(chǎn)物為陰性對 照，并設置水空白對照。按照表1提供的探針標記信息對實時熒光PCR進行相應熒光收集設置。實時熒光PCR檢測結(jié)果為定量PCR儀檢測到陽性對照報告熒光有明顯信號增長， 陰性對照和空白對照的報告熒光沒有熒光信號增長，而檢測樣品的報告熒光信號有明顯增 長，則根據(jù)檢測樣品的熒光信號類型判定檢測樣品屬于哪種病毒(見圖1)。采用本發(fā)明的方法能同時檢測大豆上的四種病毒病害比以前的檢測方法更加快 速、準確，且易于推廣應用。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。
權(quán)利要求
一種對大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的方法，包括如下步驟步驟一設計檢測選自煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒中兩種以上病毒的引物和寡核苷酸探針；步驟二將步驟一中設計的兩種以上病毒的引物和寡核苷酸探針同時進行實時熒光PCR反應；步驟三根據(jù)熒光信號類型判定檢測樣品的病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的方法，其特征在于所 述煙草環(huán)斑病毒的一對引物是TRSV-ZFP :5’ -AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT-3’ SEQ ID NO 1 TRSV-ZRP :5’ -TCCCCATAGTTGAACTGCCA-3’ SEQ ID NO :2， 所述南方菜豆花葉病毒的一對引物是 SBMV-1F :5’ -TGGTCCTTCGACGCAGTCT-3’ SEQ ID NO 3 SBMV-1R :5，-TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3，SEQ ID NO :4， 所述番茄環(huán)斑病毒的一對引物是ToRSV-2-FP :5’ -TTGGCAAAGGAGTGGAGGAA-3’ SEQ ID NO 5 ToRSV-2-RP :5’ -TCCACAGGTATACGGGCTTCA-3’ SEQ ID NO :6， 所述南芥菜花葉病毒的一對引物是 ARMV-1-FP1 :5’ -AGGCCACTGGCATGGATG-3’ SEQ ID NO 7 ARMV-1-RP1 :5’ -CGCATCCCATGTTTTGCA-3’ SEQ ID NO :8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述對大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的方法，其特征在于 所述煙草環(huán)斑病毒的寡核苷酸探針是TRSV-ZP :5’ -MAR-AGATGCAGATGTGCATGA-MAR-3‘ SEQ IDN0 :9， 所述南方菜豆花葉病毒的寡核苷酸探針是 SBMV-1Q :5’ -URA-AGTCTGCAAGAAGGCGCA-URA-3‘ SEQ IDN0 :10， 所述番茄環(huán)斑病毒的寡核苷酸探針是ToRSV-2-Q 5' -JUP-CAGCCACTGCTTGGT-JUP-3，SEQ ID NO: 11，所述南芥菜花葉病毒的寡核苷酸探針是ARMV-1-1Q :5’ -SAT-CGTCCCGTGTCTGTGCT-SAT-3，SEQ IDN0 :12。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述對大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的方法，其特征在于所述 檢測煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒四種病毒的引物和 寡核苷酸探針為所述煙草環(huán)斑病毒的一對引物是TRSV-ZFP :5’ -AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT-3’ SEQ ID NO 1 TRSV-ZRP :5’ -TCCCCATAGTTGAACTGCCA-3’ SEQ ID NO :2， 所述南方菜豆花葉病毒的一對引物是 SBMV-1F :5’ -TGGTCCTTCGACGCAGTCT-3’ SEQ ID NO 3 SBMV-1R :5，-TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3，SEQ ID NO :4， 所述番茄環(huán)斑病毒的一對引物是ToRSV-2-FP :5’ -TTGGCAAAGGAGTGGAGGAA-3’ SEQ ID NO 5ToRSV-2-RP :5’ -TCCACAGGTATACGGGCTTCA-3’ SEQ ID NO :6，所述南芥菜花葉病毒的一對引物是ARMV-1-FP1 :5’ -AGGCCACTGGCATGGATG-3’ SEQ ID NO 7ARMV-1-RP1 :5’ -CGCATCCCATGTTTTGCA-3’ SEQ ID NO 8所述煙草環(huán)斑病毒的寡核苷酸探針是TRSV-ZP :5’ -MAR-AGATGCAGATGTGCATGA-MAR-3‘ SEQ IDN0 :9，所述南方菜豆花葉病毒的寡核苷酸探針是SBMV-1Q 5' -URA-AGTCTGCAAGAAGGCGCA-URA-3' SEQ IDN0 :10，所述番茄環(huán)斑病毒的寡核苷酸探針是ToRSV-2-Q 5' -JUP-CAGCCACTGCTTGGT-JUP-3，SEQ ID NO: 11，所述南芥菜花葉病毒的寡核苷酸探針是ARMV-1-1Q :5’ -SAT-CGTCCCGTGTCTGTGCT-SAT-3，SEQ IDN0 :12。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大豆病毒病害實時熒光PCR檢測方法，其步驟二中所述反應 體系為實時熒光反應混合液2XPCR 11^為10111^，511|1的11 乂組引物和寡核苷酸10父為 0. 25111，51^的581^組引物和寡核苷酸肌乂為2111，51^的1101 乂組引物和寡核苷酸10父 為2 iil，5 ii M ArMV組引物和寡核苷酸MIX為2 y 1，待檢樣品RT-PCR產(chǎn)物為1 y 1，加雙蒸 水將總體系補至20 u 1體積。
6.一種用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的引物，至少包括選自如下兩對以上病毒 的引物一對用于檢測煙草環(huán)斑病毒的引物TRSV-ZFP :5’ -AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT-3’ SEQ ID NO 1TRSV-ZRP :5’ -TCCCCATAGTTGAACTGCCA-3’ SEQ ID NO :2，一對用于檢測南方菜豆花葉病毒的引物是SBMV-1F :5’ -TGGTCCTTCGACGCAGTCT-3’ SEQ ID NO 3SBMV-1R :5，-TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3，SEQ ID NO :4，一對用于檢測番茄環(huán)斑病毒的引物是ToRSV-2-FP :5’ -TTGGCAAAGGAGTGGAGGAA-3’ SEQ ID NO 5ToRSV-2-RP :5’ -TCCACAGGTATACGGGCTTCA-3’ SEQ ID NO :6，一對用于檢測南芥菜花葉病毒的寡核苷酸探針是ARMV-1-FP1 :5’ -AGGCCACTGGCATGGATG-3’ SEQ ID NO 7ARMV-1-RP1 :5’ -CGCATCCCATGTTTTGCA-3’ SEQ ID NO :8。
7.一種用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的寡核苷酸探針，至少包括選自如下寡核 苷酸探針中的兩條以上一條用于檢測煙草環(huán)斑病毒的寡核苷酸探針TRSV-ZP :5’ -MAR-AGATGCAGATGTGCATGA-MAR-3‘ SEQ IDN0 :9，一條用于檢測南方菜豆花葉病毒的寡核苷酸探針是SBMV-1Q 5' -URA-AGTCTGCAAGAAGGCGCA-URA-3' SEQ IDN0 :10，一條用于檢測番茄環(huán)斑病毒的寡核苷酸探針是ToRSV-2-Q :5，-JUP-CAGCCACTGCTTGGT-JUP-3，SEQ ID NO :11，一條用于檢測南芥菜花葉病毒的寡核苷酸探針是 ARMV-1-1Q :5’ -SAT-CGTCCCGTGTCTGTGCT-SAT-3’ SEQ IDN0 :12。
8.一種用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的引物和寡核苷酸探針，至少包括選自如 下兩組以上病毒的一對引物和對應的寡核苷酸探針第一組一對用于檢測煙草環(huán)斑病毒的引物TRSV-ZFP :5’ -AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT-3’ SEQ ID NO 1TRSV-ZRP :5’ -TCCCCATAGTTGAACTGCCA-3’ SEQ ID NO :2，一條用于檢測煙草環(huán)斑病毒的寡核苷酸探針TRSV-ZP :5’ -MAR-AGATGCAGATGTGCATGA-MAR-3‘ SEQ IDN0 :9，第二組一對用于檢測南方菜豆花葉病毒的引物 SBMV-1F :5’ -TGGTCCTTCGACGCAGTCT-3’ SEQ ID NO 3 SBMV-1R 5' -TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3，SEQ ID NO :4， 一條用于檢測南方菜豆花葉病毒的寡核苷酸探針 SBMV-1Q :5’ -URA-AGTCTGCAAGAAGGCGCA-URA-3‘ SEQ IDN0 :10， 第三組一對用于檢測番茄環(huán)斑病毒的引物ToRSV-2-FP :5’ -TTGGCAAAGGAGTGGAGGAA-3’ SEQ ID NO 5ToRSV-2-RP :5’ -TCCACAGGTATACGGGCTTCA-3’ SEQ ID NO :6，一條用于檢測番茄環(huán)斑病毒的寡核苷酸探針ToRSV-2-Q 5' -JUP-CAGCCACTGCTTGGT-JUP-3，SEQ ID NO: 11，第四組一對用于檢測南芥菜花葉病毒的引物ARMV-1-FP1 :5’ -AGGCCACTGGCATGGATG-3’ SEQ ID NO 7ARMV-1-RP1 :5’ -CGCATCCCATGTTTTGCA-3’ SEQ ID NO :8，一條用于檢測南芥菜花葉病毒的寡核苷酸探針ARMV-1-1Q :5’ -SAT-CGTCCCGTGTCTGTGCT-SAT-3，SEQ IDN0 :12。
9.一種用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的試劑盒，至少包括根據(jù)權(quán)利要求8所述 的兩組以上的病毒的一對引物和對應的寡核苷酸探針。
10.一種用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求7所述的四 組病毒的一對引物和對應的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同時檢測煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒四種中一種或多種大豆病毒病害的簡單、快速、特異、靈敏的實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒。所述實時熒光PCR檢測方法使用SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8中的引物序列和SEQID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12中的寡核苷酸探針。本發(fā)明的實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒適合于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護等部門使用。
文檔編號C12N15/11GK101857904SQ20091010653
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者王穎, 程穎慧, 章桂明, 陳枝楠 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心