專利名稱：：一種用于檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒及其混合感染的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒及其混合感染的試劑盒和方法，更具體地，涉及四重PCR法檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒及其混合感染的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
：豬細(xì)小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一。豬細(xì)小病毒感染的主要特征是孕豬尤其是初產(chǎn)母豬及血清學(xué)陰性經(jīng)產(chǎn)母豬在懷孕前期容易受到感染，引起胚胎或胎兒的感染和死亡，導(dǎo)致母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、胎兒木乃伊化及新生仔豬的死亡。有研究證實(shí)PPV與豬的多系統(tǒng)衰竭綜合征和豬的非化膿性心肌炎有關(guān)，同時還可引起仔豬腹瀉和發(fā)生皮炎。豬圓環(huán)病毒(porcinecircovirus,PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是迄今已知最小的動物病毒之一。根據(jù)其抗原性瓦基因組成不同，PCV可分為2種血清型，即PCV1及PCV2。動物實(shí)驗(yàn)表明PCV1無致病性，廣泛存在于正常豬體內(nèi)各組織器官中。PCV2具有致病性，可引起斷奶4子豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS),雖然認(rèn)為PMWS是一種多因子疾病，但大多數(shù)研究者認(rèn)為PCV2是源發(fā)性病因，因此PCV2近年來引起了人們廣泛關(guān)注。PCV2主要侵犯機(jī)體免疫系統(tǒng)，臨床上常呈并發(fā)或繼發(fā)感染，使病情加重，以至死亡，從而造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。同時，豬呼吸與繁殖障礙綜合征、豬細(xì)小病毒(PPV)和傳染性先天性震顫等也都與PCV-2感染有密切關(guān)系。偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由7為狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)引起的一種或多種動物感染的急性傳染病。PRV感染豬后，仔豬表現(xiàn)出嚴(yán)重的中樞神經(jīng)癥狀，并導(dǎo)致高死亡率，成年豬則長期潛伏，并可導(dǎo)致妊娟^母豬流產(chǎn)和死亡。豬感染PRV后，免疫系統(tǒng)受到損害，因而更易繼發(fā)其它疾病，如豬瘟或豬繁殖與呼吸綜合征等。豬PR在我國流行范圍很廣，迄今已有20多個省份發(fā)生該病。自上世紀(jì)70年代以來，人工篩選的自然弱毒疫苗瓦基因工程缺失疫苗的廣泛應(yīng)用對防治偽狂犬病做出了重要貢獻(xiàn)。美國研制出的世界上第一個偽狂犬病病毒基因工程缺失疫苗(OMNIVAC-PRV)在1986年獲得了美國政府頒發(fā)的生產(chǎn)許可證，該疫苗缺失了gE基因。我國使用Bartha-k61林弱毒疫苗，其基因中整個gE和大部分gl序列的缺失。卯年代以后，歐美等國家則只允許gE基因缺失的疫苗上市。這些弱毒疫苗和基因工程疫苗可使豬免于發(fā)病，但不能阻止野毒潛伏感染，潛伏感染的野毒在一定條件下又會傳染給其它豬進(jìn)而使其發(fā)病。由于上述幾種疾病在臨床上表現(xiàn)出相似的癥狀，因此常規(guī)診斷方法4艮難將這些癥狀相似的一類疾病加以區(qū)分，而混合感染多種病原時，則更難以進(jìn)行早期快速檢測。同時，常規(guī)的病原學(xué)和血清學(xué)檢測方法又存在著操作繁雜、費(fèi)時費(fèi)力和敏感性低等不足。因此，建立準(zhǔn)確快速的診斷方法對這些疾病的防治具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于實(shí)現(xiàn)對豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)及其混合感染的早期快速檢測。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一方面提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括10xPCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、陽性對照試樣以及選自SEQIDN0:1至SEQIDN0:8序列的引物混合物、SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列的5，端和/或3'端延長序列的引物混合物、與SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列同源性大于85%的序列的引物混合物或者與SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列堿基互補(bǔ)的序列的引物混合物中任一種的引物。其中所述10xPCRbuffer包含500mmol/LKCl、100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2,所述dNTP包含濃度各為25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP,所述Taq酶的濃度為5u/pL。其中所述陽性對照試樣包含23.5嗎/mLPPV、25pg/mLPCV2和20pg/mLPRV。其中所述引物為SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列的引物混合物，各引物的濃度分別為10pM。本發(fā)明另一方面提供了一種檢測方法，所述方法包括以下步驟a.提取樣品總DNA;b.使用權(quán)利要求1所述試劑盒分樣品組、空白對照和陽性對照進(jìn)行四重PCR擴(kuò)增；c.電泳；d.實(shí)驗(yàn)結(jié)杲分析。其中所述lOxPCRbuffer包含500匪ol/LKC1、100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2,所述dNTP包含濃度各為25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP,所述Taq酶的濃度為5u/|iL。其中所述陽性對照試樣包含23.5pg/mLPPV、25pg/mLPCV2和20pg/mLPRV。其中引物為SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列的引物混合物，各引物的濃度為10^M。其中樣品組中10xPCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、樣品總DNA和滅菌水的體積分別為2^L、2(oL、1.5pL、0.5〖iL、3&、4nL和7pL;空白對照中l(wèi)OxPCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、滅菌水和滅菌水的體積分別為2pL、2pL、1.5pL、0.5nL、3(xL、4(xL和7pL;陽性對照中10xPCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、陽性對照試樣和滅菌水的體積分別為2(xL、2|iL、1.5^L、0.5jiL、3^L、4pL和7^L。其中所述步驟b中擴(kuò)增的條件為95。C預(yù)變性5min，95。C變性506s，58。C退火lmin,72。C延伸50s,30-35個循環(huán)，72。C延伸10min。本發(fā)明試劑盒和檢測方法具有快速高效、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高和敏感性高等優(yōu)勢，適用于我國各級防控單位、基層獸醫(yī)站和大中型養(yǎng)殖場等，具有廣泛的應(yīng)用前景。圖1為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4和陽性對照試樣擴(kuò)增產(chǎn)物的電;永圖。具體實(shí)施例方式1.試劑來源引物由上海生工生物工程有限公司合成；UNIQ-10柱式病毒DNA抽提試劑盒來源于上海生工；擴(kuò)增用dNTP和高保真7b《酶來源于Takara公司。2.引物i殳計參照GenBank查找多個毒抹，進(jìn)行序列比對，根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計出四對相對保守的特異引物，引物序列如表1所示表1引物編號引物序列產(chǎn)物長度1F5'-catgggccagcatctacagg-3'657bp1R5'-tgttggctcgctccacggct畫3'2F5'-gagaagggctgggttatggtatgg誦3'490bp2R5'-acagcgcacttctttcgttttcag隱3'3F5'-agtactcgcaggggcgcaact-3'372bp3R5'-cgccgatcttggtgtaggtgt-3'4F5'-gcccacgcacgaggactactacga-3'"298bp4R5'-ttaagcggggcgggacatcaacag-3'為避免產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，本發(fā)明所設(shè)計4對引物的Tm值相近，從而保證了可在相同的退火溫度下對4個基因進(jìn)行較好的擴(kuò)增。3.樣品總DNA的提取采集甘肅、寧夏等地豬場病豬的組織樣品(心、肝、脾、肺和腎等)。取2-3mg新鮮組織，用高壓滅菌過的石英砂和研缽充分研磨，加入適量TEBuffer(pH8.0)，4。C浸泡過夜，2500r/min離心10min,取上清液。細(xì)胞毒及其他液體樣本無需處理。可使用UNIQ-10柱式病毒DNA抽提試劑盒依照試劑盒使用說明書進(jìn)行樣品總DNA的提取。將制得的部分樣品總DNA溶解在滅菌水或TE(pH8.0)中，濃度為1.3-3)ig/mL。其余樣品總DNA于-20。C保存?zhèn)溆?。也可利用SalahM.Aljanabi和IciarmArtinez的方法進(jìn)行樣品總DNA的提取，具體操作如下1)取200組織樣品研磨上清液或者細(xì)胞毒等液體樣本置1.5mL印pendorf管中，加入400DNA提取緩沖液，充分混勻；2)加入820mg/mL蛋白酶K(終濃度為400|ag/mL)，充分混勻，置于55-65。C水浴鍋中溫浴2小時；3)加300jiL6mol/LNaCl，在旋渦混合器上高速混合30秒，10000r/min離心!30分鐘，移上清至另一eppendorf管中；4)加入等體積異丙醇，混勻，-20。C靜置1小時，然后10000r/min離心15分鐘，棄上清；5)用70%乙醇洗滌沉淀，干燥。將制得的部分樣品總DNA溶解在滅菌水或TE(pH8.0)中，濃度為1.3-3]ug/mL。其余樣品總DNA于-20。C保存?zhèn)溆谩?.四重PCR擴(kuò)增利用本發(fā)明試劑盒對如上所述獲得的4個樣品總DNA進(jìn)行四重PCR擴(kuò)增。所述試劑盒包括10xPCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、陽性對照試樣以及SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列的引物混合物，其中10xPCRbuffer包含500mmol/LKC1、100mmol/LTris-Cl(pH8.3,室溫下)和15mmol/LMgCl2;dNTP包含濃度各為25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP;Taq酶的濃度為5u/SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列的引物混合物中各引物的濃度均為10陽性對照試樣包含23.5pg/mLPPV、25|ig/mLPCV2和20pg/mLPRV。反應(yīng)總體系為20jiL，各試劑的用量如表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>樣品組2-5中各樣品總DNA的濃度分別為2pg/mL。用陽性對照試樣代替樣品總DNA作為陽性對照1,用滅菌水代替樣品總DNA作為空白對照6。配好反應(yīng)液后，高速離心10秒，將反應(yīng)管置于擴(kuò)增儀中，如下進(jìn)行擴(kuò)增95。C預(yù)變性5min,95。C變性50s，58。C退火1min,72°C延伸50s,30-35個循環(huán)，72。C延伸10mm。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)由于偽狂犬病毒GC含量高達(dá)73%，利用常規(guī)10xPCRbuffer對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增存在著困難，而加入適量DMSO能增強(qiáng)對模板DNA的變性效果，使PCR擴(kuò)增變得更加容易，擴(kuò)增穩(wěn)定且效率較高。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析本發(fā)明利用凝膠電泳對上文所述四重PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物進(jìn)行分析。稱取2.0g瓊脂糖，加入100mLlxTAE緩沖液，加熱溶解，加入5pL(lOOmg/mL)溴化乙錠，混勻，加入水平放置的凝膠盤中，膠板厚度為約5mm。依據(jù)樣品數(shù)選用合適的梳子，待凝膠冷卻后拔出梳子以在膠中形成加樣孔，將膠板放入電泳槽中，力口lxTAE緩沖液淹沒膠面。取5-8PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2緩沖液混勻后加入一個加樣孔中，每次電泳同時上樣標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker和空白對照。80V-100V電壓或40mA-50mA電流電泳15min-25min。電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上觀察。如圖1所示，第1、2、3、4和5泳道分別對應(yīng)于陽性對照1、樣品組2、樣品組3、樣品組4和樣品組5。陽性對照1的電泳結(jié)果為四條大小不一的條帶，分別對應(yīng)于657bp、490bp、372bp、298bp?？瞻讓φ?無擴(kuò)增條帶(沒有示出)。樣品組2的電泳結(jié)果出現(xiàn)了657bp大小的條帶，而空白對照無擴(kuò)增條帶，可判定其中的樣品1為PPV陽性。樣品組3的電泳結(jié)果出現(xiàn)了490bp大小的條帶，而空白對照無擴(kuò)增條帶，可判定其中的樣品2為PCV2陽性。樣品組4的電泳結(jié)果出現(xiàn)了372bp和298bp大小的條帶，同時空白對照無擴(kuò)增條帶，可判定其中的樣品3為PRV陽性。樣品組5的電泳結(jié)果出現(xiàn)了657bp、490bp和372bp大小的條帶，而沒有出現(xiàn)298bp大小的條帶，同時空白對照無擴(kuò)增條帶，可判定其中的樣品4為PPV、PCV2和PRV疫苗毒陽性。<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所<120>—種用于檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒及其混合感染的試劑盒和方法<160>12<170>Patentlnversion3.5<210><211><212><213>120DNA人工序列<400>1catgggccagcatctacagg<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2tgttggctcgctccacggct<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>32020gagaagggctgggttatggtatgg<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4acagcgcacttctttcgttttcag<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5agtactcgcaggggcgcaact<210>6<211>21<212〉DNA<213>人工序列<400>6cgccgatcttggtgtaggtgt<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7gcccacgcacgaggactactacga24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8ttaagcggggcgggacatcaacag24<210>9<211>657<212>DNA<213>豬細(xì)小病毒<400>9catgggccagcatctacaggaaaaagtataattgctcaacacattgcaaacttagttggt60aatgttggttgctacaatgcagccaatgtgaactttccatttaatgactgtacaaataaa120aacttaatatggattgaagaagcaggaaacttctctaaccaagtaaaccaattcaaagcc180atatgttcaggtcaaacaattagaattgaccaaaaaggtaaaggaagcaaacaaattgaa240ccaactcctgtaataatgactacaaatgaagacattactaaagttagagtaggatgcgag300gaaagaccagaacatacacaaccaataagagacagaatgttaaacataaacctaaccaga360aaactgccaggtgattttggacttttagaagaaactgaatggccactaatatgtgcttgg420ttggtaaagaaaggttaccaagcaacaatggctagctatatgcatcattggggaaatgta480cctgattggtcagaaaaatgggaggagccaaaaatgcaaaccccaataaatacaccaaca540gactctcagatttccacatcagtgaaaacttcgccagcggacaacaactacgcagcaact600ccaatacaggaggacctggatttagctttagccttggagccgtggagcgagccaaca657<210>10<211>490<212>DNA<213>豬圓環(huán)病毒2型<400>10gagaagggctgggttatggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagg60gctgtggcctttgttacaaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctg120tcaccctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtag180tattcaaagggcacagagcgggggtttgagccccctcetgggggaagaaagteattaata240ttgaatctcatcatgtctaccgcccaggagggcgttctgactgtcgttcgcttgatagta300tatccgaaggtgcgggagaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggtaa360cggtggcgggggtggacgagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgg420gggcggtgtcttcttctccggtaacgcctccttggatacgtcatatctga雄cgaaaga480agtgcgctgt490<210>11<211>372<212>DNA<213>豬偽狂犬病毒<400>11agtactcgcaggggcgcaacttcacggaggggatcgccgtgctcttcaaggagaacatcg60ccccgcacaagttcaaggcccacatctactacaagaacgtcatcgtcacgaccgtgtggt120ccgggagcacgtacgcggccatcacgaaccgcttcacagaccgcgtgcccgtccccgtgc180aggagatcacggacgtgatcgaccgccgcggcaagtgcgtctccaaggccgagtacgtgc240gcaacaaccacaaggtgaccgccttcgaccgcgacgagaaccccgtcgaggtggacctgc300gcccctcgcgcctgaacgcgctcggcacccgcggctggcacaccaccaacgacacctaca360ccaagatcggeg372<210>12<211>298<212>DNA<213>豬偽狂犬病毒<400>12gcccacgcacgaggactactacgacggcgacgacgacgacgacgacgaggaggcgggcgt60catccgccggcggcccgcctcccccggcggggacageggetacgaggggcegtacgegag120cctggaccccgaggacgagttcagcagcgacgaggacgacgggctgtacgtgcgceccga180gaaggcgccccgctccggcttcgacgtctggttccgcgatccggagaaaccggaagtgac240gaatggacccaactatggcgtgaccgccaaccgcctgttgatgtcccgccccgcttaa298權(quán)利要求1.一種用于檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒及其混合感染的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括10×PCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、陽性對照試樣以及選自SEQIDNO1至SEQIDNO8序列的引物混合物、SEQIDNO1至SEQIDNO8序列的5’端和/或3’端延長序列的引物混合物、與SEQIDNO1至SEQIDNO8序列同源性大于85％的序列的引物混合物或者與SEQIDNO1至SEQIDNO8序列堿基互補(bǔ)的序列的引物混合物中任一種的引物。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中所述10xPCRbuffer包含500mmol/LKC1、100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2,所述dNTP包含濃度各為25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP,所述Taq酶的濃度為5u/^L。3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中所述陽性對照試樣包含23.5pg/mLPPV、25jag/mLPCV2和20|ag/mLPRV。4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中所述引物為SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列的引物混合物，各引物的濃度分別為10^M。5.—種用于檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒及其混合感染的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a.提取樣品總DNA;b.使用權(quán)利要求1所述試劑盒分樣品組、空白對照和陽性對照進(jìn)行四重PCR擴(kuò)增；c.電泳；d.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。6.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述10xPCRbuffer包含500讓ol/LKC1、100mmol/LTris-Cl和15mmol/LMgCl2,所述dNTP包含濃度各為25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP,所述Taq酶的濃度為5u/pL。7.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述陽性對照試樣包含23.5昭/mLPPV、25pg/mLPCV2和20|ig/mLPRV。8.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中引物為SEQIDNO:l至SEQIDNO:8序列的引物混合物，各引物的濃度為10fxM。9.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中樣品組中10xPCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、樣品總DNA和滅菌水的體積分別為2|iL、2pL、1.5^L、0.5pL、3^L、4|xL和7jiLj空白對照中10xPCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、滅菌水和滅菌水的體積分別為2pL、2|iL、1.5pL、0.5pL、3pL、4和7jiL;陽性對照中10xPCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、陽性對照試樣和滅菌水的體積分別為2(^L、2pL、1.5^L、0.5pL、3pL、4pL和7|iL。10.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述步驟b中擴(kuò)增的條件為95。C預(yù)變性5min,95。C變性50s，58。C退火1min，72°C延伸50s,30-35個循環(huán),72。C延伸10min。全文摘要一種用于檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒及其混合感染的試劑盒和使用所述試劑盒的檢測方法，所述試劑盒包括10×PCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、陽性對照試樣以及選自SEQIDNO1至SEQIDNO8序列的引物混合物、SEQIDNO1至SEQIDNO8序列的5’端和/或3’端延長序列的引物混合物、與SEQIDNO1至SEQIDNO8序列同源性大于85％的序列的引物混合物或者與SEQIDNO1至SEQIDNO8序列堿基互補(bǔ)的序列的引物混合物中任一種的引物。所述試劑盒和檢測方法具有快速高效、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高和敏感性高等優(yōu)勢。文檔編號C12R1/93GK101565761SQ20091010725公開日2009年10月28日申請日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者劉湘濤,尚佑軍,尹雙輝,芳藺申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所