專利名稱：利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物絮凝劑，尤其是涉及一種利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法。
背景技術：
生物絮凝劑是一類由微生物產生的可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細胞及膠 體粒子等凝集、沉淀的特殊高分子代謝產物，主要含有蛋白、粘多糖、纖維素和DNA等高
分子化合物。生物絮凝劑是利用生物技術，通過微生物發(fā)酵、分離提取而得到的一種新型、 高效、廉價的水處理劑(陳元彩，肖錦.天然有機高分子絮凝劑研究與應用，工業(yè)水處理，1999， 19 (4): 11-13)。與傳統(tǒng)的無機和有機合成高分子絮凝劑相比，生物絮凝劑具有許多獨特的 性質和優(yōu)點①無毒無害，安全性高；②易被微生物降解，無二次污染；③具有很強的除濁 和脫色性能；④適用范圍廣；⑤易于固液分離，形成沉淀物少；⑥有些生物絮凝劑還具有pH 和熱穩(wěn)定性強，用量小的特點(Takagi H， Kadowaki K. Poly-galactosamine produced by a microorganism. Nat Technol. 1985a,49(3): 121 -128)。
隨著工業(yè)和科學技術的發(fā)展，無機和有機高分子絮凝劑的生產和應用在取得長足進步的 同時，其使用過程中的不安全性和給環(huán)境造成的二次污染也越來越引起人們的重視。如無機 絮凝劑在實際應用中易給被處理液帶入大量無機離子，增加了脫鹽工序，過量的無機離子不 僅影響產品的風味、口感，而且不利于人的健康，尤其是A產的攝入，與目前日益增多的老 年癡呆癥的引發(fā)有直接關系；鐵鹽類絮凝劑不僅對所用設備具有強腐蝕性，而且容易殘留鐵 離子，使被處理液帶有顏色，影響水質；當處理含有較多硫化物的工業(yè)廢水(如紡織印染廢 水，石油工業(yè)廢水，酸法造紙廢水等)時，由于F^+會被還原為Fe2+，同時生成膠體狀態(tài)的 FeS和Fe2S3的混合物，很難形成絮凝沉淀。
有機合成高分子絮凝劑丙烯酰胺多聚體雖然本身沒有任何毒性，但是其難降解性卻易造 成二次污染，而且聚合單體丙烯酰胺的殘留也是一個令人十分擔憂的問題，它不僅具有強烈 的神經毒性，而且是強致癌物，現(xiàn)在許多國家和領域已禁止或限量使用此類絮凝劑，如美國 批準使用的聚丙烯酰胺Separum Nplo最大容許濃度為1 mg/mL;英國規(guī)定PAM的投加劑量 平均不得超過0.5 mg/mL，最大投加劑量不得超過1 mg/mL。
天然高分子絮凝劑作為一類較新的水處理劑，是利用蛋白質、多聚糖、木質素、幾丁質等生物體分泌的天然有機高分子，通過化學改性制成。由于天然有機高分子物質具有無毒， 能安全降解的特點，所以曾一度引起重視，但天然絮凝劑較弱的絮凝活性卻限制了其進一步 的推廣應用，致使多年來在此領域能真正大規(guī)模用于工業(yè)生產的種類并不多。
目前己有一些關于生物絮凝劑產生菌的報道，涉及到細菌、真菌和藻類等。1984年，F(xiàn)attom A.等(Ali Fattom, Moshe Shilo. /V or附/c^'ww J隱l bioflocculant: production and activity.Archives of Microbiology, 1984,139(4):421-426)利用從排水渠內獲得的絲狀藻青菌/Vwww'^ww ,7研制出 對斑脫土有良好絮凝效果的高分子生物絮凝劑。1986年，Kurane等(Kur加e R， Toeda K, Takeda
Agric Biol Chem， 1986,50:2309-2313)研究活性污泥法處理酞酚酯廢水時發(fā)現(xiàn)紅平紅球菌 J / wfococcw《e7Arap0fc，用特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件研制出了微生物絮凝劑NOC-1 ，該產品 可用于畜產廢水處理、膨脹污泥的沉降、瓦廠廢水及紙漿廢水處理。Nakamura等(NakamuraJ， Miyashiro S， Hirose Y. Purification and chemical analysis of microbial cell flocculant produced by ^y/ e^///^ w/"e AJ7002. Agric Biol Chem， 1976,40:619冒624)又用醬油曲霉^5^《/〃附ra/ae制 備出了生物絮凝劑AJ7002。Takagi(Takagi H, Kadowaki K. Purification and chemical properties of a flocculant produced by PaecZ/o/^cey. Agric Biol Chem， 1985, 49(11):3159-3164)利用擬青霉菌 尸^d/o附y(tǒng)c" /-7研制出生物絮凝劑PF101 。近年來國內研究者也發(fā)現(xiàn)了一些能產生絮凝劑的 菌株。陸茂林等(陸茂林，施大林，王蕾，陳金林.微生物絮凝劑產生菌的篩選和發(fā)酵條件研究. 工業(yè)微生物，1997,27(2):25-28)從土壤和污泥中篩選出兩株活性較高的諾卡氏菌，并對其適宜 培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)液pH變化與絮凝活性之間的關系進行了研究；宮小燕等(宮小燕， 王競，周集體.絮凝劑產生菌的篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu).環(huán)境科學研究，1999， 12 (4): 9-ll)從 污水處理廠活性污泥中分離篩選到1株具有穩(wěn)定絮凝性狀的菌株，經初步鑒定為假單胞菌 /^wMowomww.GA^-/,對絮凝活性條件進行了初步研究；何寧等(何寧，李寅，陳堅.新型 生物絮凝劑REA-ll的代謝模型建立與代謝網絡分析.化工學報，2005， 56 (4): 687-694)研 究了谷氨酸棒桿菌Cw7ne6a"m'訓g/Wfl附/c歸產生新型蛋白聚糖生物絮凝劑REA-ll的代謝 過程。2001年，Shih等(I丄.Shil, YT.Van, L.C.Yeh， H.G丄in, Y.N.Chang. Production of a biopolymer flocculant from 5ac/〃w /fc/ ewzyj nw'j and its flocculation properties. Bioresource Technology 2001,78: 267-272)利用谷氨酸、檸檬酸和甘油作為發(fā)酵培養(yǎng)基主要組分培養(yǎng) /k^m/ora^ CCRC 12826合成一種聚谷氨酸類生物絮凝劑，表現(xiàn)出較高的絮凝活性， 可望在廢水、飲用水以及食品發(fā)酵工業(yè)下游過程得到推廣應用。
生物絮凝劑作為一類高效安全絮凝劑，在人們亟待尋求一種新型絮凝劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)絮凝劑的今天，已得到了諸多研究者的重視和認可，它終將取代或部分取代合成絮凝劑是大勢所趨。 因此，開發(fā)一種安全無毒、絮凝活性高、無二次污染、成本低廉、產量高的新型絮凝劑對物 質產品的生產工藝改進、人類的健康和環(huán)境保護都有很重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對目前微生物絮凝劑生產所存在的原料成本高、發(fā)酵周期長、絮凝 效率低等問題，提供一種具有較高絮凝活性、原料成本低、工業(yè)應用潛力較大的利用地衣芽 孢桿菌制備生物絮凝劑的方法。
本發(fā)明采用的微生物為地衣芽孢桿菌(5"c 7/w/^/iem/w7m》，該微生物己于2009年01月 14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為 CGMCCNo.2876。
地衣芽孢桿菌(萬acz7/^ //c/ em/w附的的篩選及鑒定采用以下方法
從實驗室染菌培養(yǎng)基中，分離得到一株具有高絮凝活性的菌株。經生理生化和16SrDNA 鑒定為地衣芽孢桿菌(5drc/腸//cAe"一/mX)。
篩選培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5 10，酵母膏1 3，尿素1 3， KH2PO40.1 0.5， K2HP04 0.1 0.5， NaC10.1 0.5， MgS04'7H20 0.2 0.5，蒸餾水，pH7.2 8.0。
斜面培養(yǎng)基(g/L):酵母膏1 3，牛肉膏1 3，胰蛋白胨2 7，葡萄糖10 20， FeS04 微量，瓊脂15 20，蒸餾水，pH7.2 7.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):糖蜜7 12，酵母膏1 3，尿素1 3， KH2PO40.1 0.3， K2HPO40.1 0.3， NaC10.1 0.3， MgS04.7H20 0.2 0.5，蒸餾水，pH7.2 8.0。
選擇性培養(yǎng)基制作平板時加入1.5% 2%瓊脂。
初篩方法用篩選培養(yǎng)基制作平板，將樣品稀釋涂布，37'C培養(yǎng)16 20h，挑取生長快、 透明圈大且有粘性的菌落轉接于固體斜面培養(yǎng)基上，37'C培養(yǎng)16 20h后，4"C保存。
復篩方法從斜面上挑取菌苔接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于37'C， 150-200 r/min培養(yǎng)1-2 d，測 定發(fā)酵液絮凝活性，挑選絮凝活性高的菌株。
菌種特征
菌落較大、透明、粘性很強；
孢子萌發(fā)時，營養(yǎng)細胞發(fā)生的位置從赤道到頂端各種情況都有，孢子殼不是多處破裂， 也不迅速消解；
許多菌株在含有足夠的鐵水化合物培養(yǎng)基上形成紅色素，老培養(yǎng)物呈褐色； 大多數(shù)菌株精氨酸水解酶呈陽性。
616S rDNA測定提取菌株基因組，根據(jù)細菌通用引物對基因組進行PCR擴增，獲得 1500bp左右的基因片段，測定堿基序列并做系統(tǒng)發(fā)育樹。 本發(fā)明的具體操作步驟如下-
1) 生物絮凝劑的發(fā)酵合成
將新鮮斜面上的菌苔轉接至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，得生物絮凝劑 發(fā)酵液；
2) 生物絮凝劑的制備
將生物絮凝劑發(fā)酵液第一次離心，除去沉淀，收集上清液，向上清液中加入乙醇，靜置 后第二次離心，除去上清液，向第二次離心后的沉淀物中再加入無水乙醇，攪拌，第三次離 心，除去上清液，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化銨，第四次離心，除去上清液得 到沉淀物，將沉淀物溶解于NaCl溶液中，加入無水乙醇，攪拌，靜置，第五次離心除去上清 液得沉淀物，將沉淀物冷凍真空干燥得到純品生物絮凝劑。
所述將新鮮斜面上的菌苔轉接至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度最好為35 40°C，搖床轉速最好 為150 200 r/min，培養(yǎng)時間最好為16 20 h;所述轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的接種量最好為 1% 8%，培養(yǎng)的溫度最好為30 40'C，搖床轉速最好為150 200r/min，培養(yǎng)的時間最好為 1 2d;
所述種子培養(yǎng)基由以下配比原料組成(g/L):
葡萄糖7 12，酵母膏0.3 0.6,尿素0.3 0.6， KH2P04 0.1 0.3， NaCl 0.1 0.3， MgSOr7H2O0.2 0.5，蒸餾水，pH7.2 8.0
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下配比原料組成(g/L):
糖蜜7 12'酵母膏1 3，尿素1 3， KH2PO40.1~0.3， K2HP04 0.1 0.3， NaCl 0.1 0.3， MgSO4-7H2O0.2 0.5，蒸餾水，pH7.2 8.0。
向上清液中加入乙醇的量最好按體積比為上清液的2 3倍，乙醇的濃度最好按體積百分 比為95%，靜置的溫度最好為4'C，向乙醇沉淀物中加入十六垸基三甲基溴化銨的量最好按 體積比為乙醇沉淀物的0.5 1倍，十六垸基三甲基溴化銨的濃度最好按體積百分比為2%; 將沉淀物溶解于NaCl溶液中的NaCl溶液的濃度按體積百分比為3% 5%，加入無水乙醇的 量按體積比最好為2 3倍。所述第一、二、三、四、五次離心的轉速最好為4000 4500r/min， 離心的時間最好為20 min。
生物絮凝劑的絮凝活性(FlocculationRate)可采用以下方法測定
取40 mL lg/L高嶺土溶液加至50 mL刻度試管中，依次加入2.5 mLCaCl2溶液(1 g/L)和lmL待測液，蒸餾水加至滿刻度，充分混合后，迅速置于比色杯中，靜止5min后，用紫外 可見光光分光度計在波長550nm下測定吸光度。以空白發(fā)酵培養(yǎng)基作空白測定。計算公式如 下
絮凝活性(Flocculation Rate， U/mL)=x 100 x Z)
式中，A:待測樣品的OD55Q值，B:空白培養(yǎng)基的OD55o值，D:發(fā)酵液稀釋倍數(shù)。 生物絮凝劑的特征分析如下
利用紫外分光光度計、紅外光譜儀、斐林反應、雙縮脲反應等方式對純品生物絮凝劑進 行成分分析，初步推斷本發(fā)明涉及的生物絮凝劑主要活性物質是糖類物質。
本發(fā)明由地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法與現(xiàn)有技術中各種生物絮凝劑的制備方法 相比具有原料成本低、發(fā)酵周期短、活性高等特點，該生物絮凝劑無毒無害、無二次污染、 其生產工藝適合大規(guī)模生產及工業(yè)應用，具有很好的推廣價值。


圖1為本發(fā)明實施例不同發(fā)酵時間對絮凝率的影響。在圖1中，橫坐標為培養(yǎng)時間/h， 縱坐標為絮凝活性U/mL。
圖2為本發(fā)明實施例生物絮凝劑的紫外掃描圖譜。在圖2中，橫坐標為波長/nm，縱坐標 為吸光度。
圖3為本發(fā)明實施例生物絮凝劑的紅外光譜。在圖3中，橫坐標為波數(shù)/cm'1，縱坐標為 透光率/%。
具體實施例方式
以下實施例將結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，以便為更好地理解本發(fā)明提供依據(jù)。 實施例1地衣芽孢桿菌合成生物絮凝劑的發(fā)酵過程曲線
將新鮮斜面上的菌苔轉接至100mL種子培養(yǎng)基中，37'C搖床培養(yǎng),轉速195 r/min， 20 h 后，按4%的接種量轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)。測定不同時間發(fā)酵液的絮凝活 性，結果如圖1所示。從圖1可以看出發(fā)酵44h時絮凝活性達716U/mL。
種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖IO，酵母膏0.5，尿素0.5， KH2PO40.1， NaC10.1， MgSCV7H20 0.2，蒸餾水，pH7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):糖蜜10，酵母膏1，尿素l， KH2PO40.1， K2HPO40.1， NaC10.1， MgSO4.7H2O0.2，蒸餾水，pH7.2。
實施例2生物絮凝劑的紫外掃描圖譜
將50 mL發(fā)酵液于4500 r/min離心20 min，除去沉淀，收集上清液。向上清液中加入2倍體積的95%乙醇，4。C靜置過夜后，4500 r/min再次離心20 min;重復上述操作2次。向乙 醇沉淀物中加入1倍體積的濃度為2%的十六烷基三甲基溴化銨，4500r/min離心，除去上清 液收集沉淀物。將沉淀物溶解于4e/。NaCl溶液中并攪拌2h，加入2倍體積無水乙醇，攪拌均 勻，4'C靜置過夜，離心除去上清液得沉淀物，將沉淀物冷凍真空干燥即得到純品生物絮凝劑。 將提純的生物絮劑用水稀釋經進行紫外可見分光光度掃描，結果如圖2所示。從圖2可以看 出，該生物絮凝劑在260 nm和280 nm均沒有峰出現(xiàn)，由此推測該生物絮凝劑的主要活性成 分既不是蛋白質也不是核酸類物質。 實施例3生物絮凝劑的紅外光譜圖
將實例2提純的生物絮劑經傅立葉變換紅外光譜儀掃描，結果如圖3所示。從圖3可以 看出，該生物絮凝劑在2927.96 cn^處吸收，C-H不對稱伸縮振動產生的結果，此吸收峰是 糖類的特征峰；3423.68cm—1處有強而寬的吸收峰，是糖環(huán)中-OH中和N-H振動所致，表明分 子內存在氫鍵；1637.14 cm'1處吸收峰為多糖中的乙酰氨基(-NHC0CH3)的C=0鍵伸縮振動造 成的；1384.28 cm'1處吸收峰為羧基中的-COO—中C-O鍵對稱伸縮振動的體現(xiàn)；1003.48 cm—1 強吸收峰是酯內的C-O-C反對稱伸縮振動吸收譜帶。該紅外光譜不僅顯示了糖的特征結構， 還有酰胺結構的特征吸收峰，由此可以推斷該生物絮凝劑可能是一種氨基多糖。
權利要求
1. 利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于所述地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，該微生物已于2009年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2876；其具體操作步驟如下1)生物絮凝劑的發(fā)酵合成將新鮮斜面上的菌苔轉接至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，得生物絮凝劑發(fā)酵液；2)生物絮凝劑的制備將生物絮凝劑發(fā)酵液第一次離心，除去沉淀，收集上清液，向上清液中加入乙醇，靜置后第二次離心，除去上清液，向第二次離心后的沉淀物中再加入無水乙醇，攪拌，第三次離心，除去上清液，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化銨，第四次離心，除去上清液得到沉淀物，將沉淀物溶解于NaCl溶液中，加入無水乙醇，攪拌，靜置，第五次離心除去上清液得沉淀物，將沉淀物冷凍真空干燥得到純品生物絮凝劑。
2. 如權利要求1所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于所述將新 鮮斜面上的菌苔轉接至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為35 40'C，搖床轉速為150 200 r/min，培 養(yǎng)時間為16 20h。
3. 如權利要求1所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于所述轉接 至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的接種量為1% 8%，
4. 如權利要求1或3所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于培養(yǎng) 的溫度為30 40。C，搖床轉速為150 200r/min,培養(yǎng)的時間為l 2d。
5. 如權利要求1所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于所述種子 培養(yǎng)基由以下配比原料組成，單位為g/L:葡萄糖7 12，酵母膏0.3 0.6，尿素0.3 0.6， KH2P04 0.1~0.3， NaCl 0.1~0.3， MgSO4.7H2O0.2 0.5，蒸餾水，pH7.2 8.0。
6. 如權利要求1所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下配比原料組成，單位為g/L:糖蜜7 12，酵母膏1 3，尿素1 3， KH2PO40.1 0.3， K2HPO40.1 0.3， NaCl 0.1 0.3， MgSO4-7H2O0.2 0.5，蒸餾7jC， pH7.2 8.0。
7. 如權利要求1所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于向上清液 中加入乙醇的量按體積比為上清液的2 3倍，乙醇的濃度按體積百分比為95%，靜置的溫度 為4。C。
8. 如權利要求1所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于向乙醇沉 淀物中加入十六垸基三甲基溴化銨的量按體積比為乙醇沉淀物的0.5 1倍，十六垸基三甲基 溴化銨的濃度按體積百分比為2%。
9. 如權利要求1所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于將沉淀物 溶解于NaCl溶液中的NaCl溶液的濃度按體積百分比為3% 5%，加入無水乙醇的量按體積 比為2 3倍。
10. 如權利要求1所述的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于所述第 一、二、三、四、五次離心的轉速為4000 4500r/min，離心的時間為20min。
全文摘要
利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，涉及一種生物絮凝劑。提供一種具有較高絮凝活性、原料成本低、工業(yè)應用潛力較大的利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法。微生物為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。將新鮮斜面上的菌苔轉接至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，得生物絮凝劑發(fā)酵液，離心除去沉淀收集上清液，加入乙醇靜置后離心，除去上清液，向沉淀物中再加入無水乙醇，攪拌，離心，除去上清液，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化銨，離心，除去上清液得沉淀物，將沉淀物溶解于NaCl溶液中，加入無水乙醇，攪拌，靜置，離心除去上清液得沉淀物，將沉淀物冷凍真空干燥得到純品生物絮凝劑。
文檔編號C12P1/04GK101503709SQ20091011126
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月13日 優(yōu)先權日2009年3月13日
發(fā)明者怡 于, 寧 何, 盧英華, 李清彪, 熊裕焱, 王遠鵬 申請人:廈門大學