專利名稱：一種體外干眼模型的建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種干眼模型，尤其是涉及一種采用結膜組織培養(yǎng)制備體外干眼模型的方法以及在模擬、研究和防治干眼中的應用。
背景技術：
干眼為任何原因所致淚液質和量及動力學的異常，從而導致淚膜不穩(wěn)定和/或眼表面的異常，并伴有眼部不適癥狀的一類疾病。根據(jù)維持穩(wěn)定淚膜的要素，干眼可以分為蒸發(fā)過強
型干眼(脂質層異常為主)、水液缺乏型干眼(Sj5gren綜合征以及非Sj5gren綜合征)、粘蛋白異常型干眼(眼表上皮細胞受損為主)、淚液動力學異常型干眼及混合型干眼([l]劉祖國.干眼的診斷.中華眼科雜志,2002，38(5):318-320)。臨床調查顯示，干眼是目前最為常見的眼表疾病(據(jù)估算我國的干眼患者超過8千萬)，影響人民的生活質量，嚴重者可以引起角膜炎、角膜新生血管以及角膜潰瘍等，因此也是重要的致盲性眼病之一，是近年來眼科的研究重點及難點([2〗The epidemiology of dry eye disease: report of the Epidemiology Subcommittee of theInternational Dry Eye Workshop (2007). Ocul Surf 2007;5:93-107)。然而，由于干眼發(fā)病的復雜性及多樣性，目前關于干眼的發(fā)病機制、診斷和治療的一系列問題的基礎以及臨床研究尚有待進一步深入。
雖然各種類型的干眼其發(fā)病機制各有不同，但是干眼發(fā)病的病生理特征卻有較多共同點，包括眼表上皮屏障破壞，結膜杯狀細胞減少或消失，眼表上皮鱗狀上皮化生，眼表上皮的膜結合型粘蛋白及分泌型粘蛋白改變，結膜上皮更新加速以及炎癥介質及凋亡參與疾病的發(fā)生發(fā)展等([3] Research in dry eye: report of the Research Subcommittee of the International DryEye Workshop (2007). Ocul Surf2007;5:179-193)。由于結膜占據(jù)了眼表面的大部分區(qū)域，而且杯狀細胞及某些特異性粘蛋白在眼表面為結膜上皮所特有，因此結膜在干眼發(fā)生發(fā)展中的變化就尤為重要。
疾病模型的建立是研究干眼的發(fā)病機制，探索治療方法的有效且實用的手段。目前已報道的建立干眼動物模型的方法包括通過營養(yǎng)因素、環(huán)境因素、毒性物質、藥物作用、改變動物性激素分泌水平、去除淚腺或眼表的神經(jīng)支配、誘導淚腺產(chǎn)生自身免疫反應及手術摘除淚腺等([3] Research in dry eye: report of the Research Subcommittee of the International Dry EyeWorkshop (2007). Ocul Surf 2007;5:179-193)。這些干眼動物模型的建立往往需要較高的技術條件或較長的時間，而且變異性較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對影響干眼動物模型制作的影響因素眾多，而通過眼表上皮細胞培養(yǎng)進行干眼的發(fā)病機制研究及藥物篩選的方法缺乏組織學的相關證據(jù)，現(xiàn)有的各種干眼疾病研究模型均存在其相應局限性等問題，提供一種不僅簡便易行、重復性好、較動物模型成本低，而且具有與干眼相似的許多組織病理學特征的體外干眼模型的建立方法以及在模擬、研究和防治干眼中的應用。
本發(fā)明的技術方案是將結膜組織在氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)，即將結膜上皮于空氣暴露條件下培養(yǎng)，從而獲得具有結膜上皮鱗狀上皮化生、結膜上皮杯狀細胞減少并消失、結膜上皮細胞粘蛋白改變、培養(yǎng)體系內(nèi)炎癥介質增高以及結膜組織細胞凋亡等特征的體外模型。
本發(fā)明所述的體外干眼模型的建立方法的具體步驟如下
1) 將包含結膜上皮和結膜下基質的結膜組織剪下，置于培養(yǎng)基內(nèi)備用；
2) 用眼科手術器械將置于培養(yǎng)基內(nèi)的結膜組織修剪成為合適大小的結膜組織塊，得含有結膜上皮和結膜下組織的結膜組織塊；
3) 將修剪后的結膜組織塊置于I型膠原包被的培養(yǎng)皿插件上，結膜上皮面朝上；
4) 將培養(yǎng)基加入插件外的培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基氣液界面處于結膜組織塊的結膜上皮與結膜下組織交界處；
5) 將結膜組織塊置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至少4 20d，即得體外干眼模型。
在步驟1)中，所述培養(yǎng)基選自上皮細胞培養(yǎng)液(SHEM培養(yǎng)基)或細胞培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基內(nèi)可添加抗生素，進行防污染處理。
在步驟2)中，所述結膜組織塊的大小一般為(3 6) mmx (3 6) mm，或者為直徑(3 8) mm大小，結膜組織塊的大小也可以根據(jù)具體實驗調整組織塊大小。
在步驟4)中，所述培養(yǎng)基選自上皮細胞培養(yǎng)液(SHEM培養(yǎng)基)或細胞培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基內(nèi)可添加抗生素，進行防污染處理。
在步驟5)中，所述將結膜組織塊置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至少4 20d期間，最好定期更換培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基的時間最好每l 3d更換一次。
可對氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)2、 4、 6、 8、 10、 12和14d后的結膜組織塊進行組織病理檢査，如發(fā)現(xiàn)本方法制備的體外結膜組織塊具有與干眼發(fā)病時結膜組織改變相類似的多項病理學特征，表明本方法制備的體外結膜組織塊即為體外干眼模型，并可將此體外干眼模型應用于干眼的模擬、研究和防治。
采用本發(fā)明建立的體外干眼模型具有如下特點
1) 制作簡單，可重復性高，價格相對低廉。
2) 在培養(yǎng)過程中，自培養(yǎng)2d起，結膜上皮細胞逐漸出現(xiàn)鱗狀上皮化生的病理學特征改變包括上皮層數(shù)明顯增加，具有高增殖能力的細胞明顯增加(通過細胞增殖能力標志物的免疫組織化學等方法證明)，細胞正常分化標志物(如結膜上皮特異性標志物角蛋白K19)表達下降，并出現(xiàn)異常分化標志物的陽性表達(如皮膚上皮細胞特異性標志物角蛋白KIO)。
3) 在培養(yǎng)過程中，結膜上皮細胞中的杯狀細胞逐漸減少并消失，可以用特異性標志物MUC5AC免疫組織染色證實。
4) 在培養(yǎng)過程中，結膜上皮細胞的膜結合型粘蛋白及分泌型粘蛋白的量發(fā)生改變。
5) 在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液以及結膜組織中炎癥介質的量增高，如基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、白細胞介素-lp (IL-1卩)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)等。
6) 在培養(yǎng)過程中，結膜組織的上皮及基質內(nèi)出現(xiàn)凋亡細胞，且其數(shù)量逐漸增加。本發(fā)明還擴展到干眼發(fā)病的相關機制的研究。如前所述，各種類型的干眼雖然病因不盡
相同，但是具有其高度相似的病生理特征。而本發(fā)明所建立的體外干眼模型也具有上述干眼的組織病理學特征。本發(fā)明可以用于干眼鱗狀上皮化生、眼表上皮屏障破壞、眼表上皮粘蛋白改變、干眼發(fā)病中炎癥介質的參與以及凋亡在干眼發(fā)生發(fā)展中的作用等相關研究。
本發(fā)明的體外干眼模型，對于測試用于干眼治療的新藥或者新治療方法也是有用的，因此本發(fā)明還擴展到干眼治療中對有效治療藥物及方案的篩選、鑒定方法。


圖1為本發(fā)明實施例的結膜組織塊在培養(yǎng)皿插件上于氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)的模式圖。在圖l中，l為培養(yǎng)皿，2為I型膠原包被的培養(yǎng)皿插件，3為培養(yǎng)基液氣界面，4為結膜組織塊的結膜上皮部分，5為結膜組織塊的結膜下組織部分。
圖2為本發(fā)明實施例的結膜組織塊在培養(yǎng)皿插件上于氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)的大體照片。
圖3為本發(fā)明實施例的結膜組織塊在所述的條件下培養(yǎng)后的蘇木素伊紅染色圖片(200倍)。D2、 D4、 D8、 D12、 D14分別代表培養(yǎng)第2d、第4d、第8d、第12d以及第14d。
圖4為本發(fā)明實施例的結膜組織塊在上述條件下培養(yǎng)后進行粘蛋白MUC5AC染色圖片(200倍)。D0、 D2、 D6、 D8、 D12、 D14分別代表培養(yǎng)即刻、培養(yǎng)第2d、第6d、第8d、第12d以及第14d。
5圖5為本發(fā)明實施例的結膜組織塊在上述條件下培養(yǎng)后進行P63染色圖片(400倍)。DO、D2、 D4、 D8、 D12、 D14分別代表培養(yǎng)即刻、培養(yǎng)第2d、第4d、第8d、第12d以及第14d。
圖6為本發(fā)明實施例的結膜組織在所述的條件下培養(yǎng)后進行角蛋白K10染色圖片(200倍)。DO、 D2、 D4、 D8、 D12、 D14分別代表培養(yǎng)即刻、培養(yǎng)第2d、第4d、第8d、第12d以及第14d。
圖7為本發(fā)明實施例的結膜組織氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)2 12d培養(yǎng)基中白介素一1P濃度曲線。在圖7中，橫坐標為培養(yǎng)天數(shù)(d)，縱坐標為白細胞介素-ip (pg/ml)。
圖8為本發(fā)明實施例的結膜組織氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)2 12d培養(yǎng)基中基質金屬蛋白酶9(MMP-9)濃度曲線。在圖8中，橫坐標為培養(yǎng)天數(shù)(d)，縱坐標為基質金屬蛋白酶-9(ng/ml)。
圖9為本發(fā)明實施例的結膜組織氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)2 12d培養(yǎng)基中炎癥介質腫瘤壞死因子(x (TNF-alpha)濃度曲線。在圖9中，橫坐標為培養(yǎng)天數(shù)(d)，縱坐標為腫瘤壞死因子a (pg/ml)。
圖10為本發(fā)明實施例的結膜組織氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)2 14d的凋亡試劑盒末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口標記技術染色(TUNEL)檢測結果(IOOX)。在圖10中，行A為細胞核染色結果，行B為TUNEL陽性細胞；點線所示為結膜上皮和結膜下組織交界位置；D2、 D4、 D8、 D12、 D14分別代表培養(yǎng)第2d、第4d、第8d、第12d以及第14d。
具體實施例方式
以下結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步的詳細描述。實施例1
本發(fā)明所述的結膜組織在氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)而建立的干眼模型的制備方法，其具體步驟如下
① 將眼庫獲得的捐贈尸眼的球結膜連同結膜下組織剪下，用含有抗生素的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，置于加入3X抗生素的上皮細胞培養(yǎng)液(SHEM培養(yǎng)基)中30min，再轉
移到含有普通抗生素濃度的SHEM培養(yǎng)基中備用。
② 用I型膠原包被培養(yǎng)皿插件底部膠原濃度為lmg/ml，每個插件內(nèi)使用0.3ml。
③ 將結膜組織修剪成5mm見方大小，置于包被好的培養(yǎng)皿插件的中央，上皮面朝上。 將SHEM培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿內(nèi)插件外部，并讓液面維持于結膜組織的上皮與基質交界處。
⑤將上述結膜組織培養(yǎng)體系置于含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2d更換培養(yǎng)基。結果顯示，將培養(yǎng)基液面維持于結膜組織塊的上皮與基質交界處，結膜組織能夠良好附
6著于I型膠原包被的培養(yǎng)皿插件上，且組織塊邊緣于培養(yǎng)l 3d可見到向外生長的結膜上皮細胞，見圖1和2。結膜上皮細胞在上述條件下培養(yǎng)6 14d達到融合。實施例2
分別冷凍包埋上述條件下培養(yǎng)2 14天的結膜組織并進行冰凍切片，進行組織病理學及免疫組織化學染色觀察，具體如下-
主要試劑與儀器鼠抗人單克隆抗角蛋白K19抗體、抗角蛋白K10抗體及抗P63抗體(美國Dako公司)，鼠抗人單克隆抗粘蛋白MUC5AC抗體(美國Abcam公司)，F(xiàn)ITC標記的山羊抗鼠IgG二抗(美國Sigma公司)，OCT包埋劑(美國SAKURA公司產(chǎn)品，型號OCT4583)。Leica CM1850冰凍切片機(德國Leica公司)，Nikon TE2000倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。
蘇木素一伊紅染色上述條件下培養(yǎng)的結膜組織標本在不同時間點取下后立即用OCT包埋，液氮預冷lmin，置一8(TC低溫冰箱保存。將低溫保存的標本作連續(xù)冰凍切片，片厚6nm。將組織切片用4%多聚甲醛固定15min，稍水洗后蘇木素染色5min，流水洗去蘇木素液，1%鹽酸酒精分化10s，流水返藍15min, 0.5%伊紅染色lmin，蒸餾水水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。
免疫熒光組織化學染色法上述條件下培養(yǎng)的結膜組織標本在不同時間點取下后立即用OCT包埋，液氮預冷lmin，置一80'C低溫冰箱保存。將低溫保存的標本作連續(xù)冰凍切片，片厚6nm。超薄組織切片用4%多聚甲醛固定15min， PBS加2%小牛血清去除非特異性染色，加第一抗體(KIO， K19， MUC5AC工作濃度均為1 : 200)置于4'C孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5min，加熒光素標記的第二抗體(工作濃度l : 100)， 37。C孵育lh， PBS洗滌3次，每次5min。加封片劑后蓋蓋玻片，置熒光顯微鏡觀察結果，照相。
免疫酶組織化學染色法組織切片用4%多聚甲醛固定15min， 0.3%過氧化氫甲醇溶液30min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS洗滌3次，每次5min;加入血清稀釋液稀釋的第一抗體(P63工作濃度1 : 50), 4'C冰箱內(nèi)孵育過夜，吸去抗體，PBS洗滌3次，每次5min;滴加血清稀釋液稀釋的生物素標記兔抗鼠二抗(工作濃度1 : 100)，室溫孵育lh;吸去二抗，PBS洗滌3次，每次5min;加入親合素-生物素-過氧化物酶復合物(Avidin-biotin-peroxidasecomples， ABC),孵育30min， PBS洗滌3次，每次5min; 二氨基聯(lián)苯胺(Diamlnobenzidinl, DAB)溶液顯色2min，終止反應；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；蓋蓋玻片，置光鏡下觀察結果，照相。陰性對照以PBS代替一抗。
結果顯示，蘇木素一伊紅染色(圖3)顯示所述條件下培養(yǎng)的結膜組織在第2 14d出現(xiàn)上皮細胞層數(shù)較正常明顯增加，且其高峰為第6 8d，上皮基底層細胞呈波浪狀排列，部分 結膜上皮基底區(qū)域呈指狀突起伸入基質層中，基質層中可見呈團簇狀的結膜上皮細胞團。 MUC5AC組織免疫熒光染色(圖4)證實了所述條件下培養(yǎng)2 8d的結膜組織中杯狀細胞數(shù) 量逐漸減少并消失。P63免疫酶組織化學染色法(圖5)證實了所述條件下培養(yǎng)2 8d的組織 中具有高度增殖能力的結膜上皮細胞數(shù)量增加。角蛋白K10組織免疫熒光染色(圖6)證實 了所述條件下培養(yǎng)2 14d的結膜組織上皮細胞發(fā)生異常分化，其結膜上皮特征性角蛋白K19 的表達量減少，而皮膚角化上皮特征性角蛋白K10在所述條件下培養(yǎng)的的結膜組織的表層逐 漸到基底上層細胞出現(xiàn)陽性表達。 實施例3
本發(fā)明所述的結膜組織在氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)而建立的干眼模型的制備方法，其具體步 驟如下
① 將眼庫獲得的捐贈尸眼的球結膜連同結膜下組織剪下，進行必要的防止污染處理后轉 移到含有普通抗生素濃度的培養(yǎng)基中備用。
② 用I型膠原包被培養(yǎng)皿插件底部膠原濃度為lmg/ml，每個插件內(nèi)使用0.3ml。
③ 將結膜組織用直徑為7mm的環(huán)鉆取下大小一致的組織塊，置于包被好的培養(yǎng)皿插件的 中央，上皮面朝上。
④ 將培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿內(nèi)插件外部，并讓液面維持于結膜組織的上皮與基質交界處。
⑤ 另外設置對照組，即將培養(yǎng)液加入培養(yǎng)體系中并完全覆蓋環(huán)鉆獲取的等同大小的結膜 組織塊。
⑥ 將上述2組結膜組織培養(yǎng)體系置于含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2d更換培養(yǎng)基， 收集更換的培養(yǎng)基，100,000轉/min離心10min后分裝并儲存于-80'C冰箱內(nèi)備用。
⑦ 取適量收集分裝的培養(yǎng)基按試劑盒說明進行酶聯(lián)免疫夾心法檢測炎癥介質MMP-9、 IL-ip及TNF-a的濃度。
結果顯示，每2d收集的所述氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)結膜組織的條件培養(yǎng)基中炎癥介質，包 括MMP9、 IL-1(3及TNFw的濃度較正常培養(yǎng)基以及對照組明顯增高，其中MMP-9的高峰出 現(xiàn)在第10d， IL-ip的高峰出現(xiàn)在第8d，而TNF-a的高峰出現(xiàn)在第6d。具體詳見圖7 9。
實施例4
每2d將本發(fā)明所述的氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)的結膜組織標本包埋并進行冰凍切片，并按凋 亡試劑盒說明進行DNA斷端末端標記法(TUNEL)檢測凋亡細胞，具體如下 ①用4Q/。多聚甲醛固定30min。② 磷酸鹽緩沖液洗滌2次，每次10min。
③ 加入含0.1X Triton X-100的磷酸鹽緩沖液，孵育10min。
④ 按說明書要求配制TUNEL檢測液每l個樣品需要TUNEL檢測液50jU，其中含有TdT 酶2pl，熒光標記液48pl，需充分混勻。
用磷酸鹽緩沖液洗滌2次。
⑥ 在樣品上加50plTUNEL檢測液，37'C避光孵育60min。注意孵育時需注意保持濕潤， 以盡量減少TUNEL檢測液的蒸發(fā)。
⑦ 磷酸鹽緩沖液洗滌3次。
⑧ 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。
結果顯示，在所述條件下培養(yǎng)的結膜組織標本切片TUNEL法染色后可見結膜上皮及基 質內(nèi)出現(xiàn)陽性的凋亡細胞(圖IO， A行為DAPI獲得的核染色，B行為凋亡陽性細胞染色)， 且凋亡細胞數(shù)量隨氣液界面環(huán)境下培養(yǎng)時間的延長而明顯增加。
權利要求
1. 一種體外干眼模型的建立方法，其特征在于具體步驟如下1)將包含結膜上皮和結膜下基質的結膜組織剪下，置于培養(yǎng)基內(nèi)備用；2)用眼科手術器械將置于培養(yǎng)基內(nèi)的結膜組織修剪成為合適大小的結膜組織塊，得含有結膜上皮和結膜下組織的結膜組織塊；3)將修剪后的結膜組織塊置于I型膠原包被的培養(yǎng)皿插件上，結膜上皮面朝上；4)將培養(yǎng)基加入插件外的培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基氣液界面處于結膜組織塊的結膜上皮與結膜下組織交界處；5)將結膜組織塊置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至少4～20d，即得體外干眼模型。
2. 如權利要求1所述的一種體外干眼模型的建立方法，其特征在于在步驟l)中，所述 培養(yǎng)基選自上皮細胞培養(yǎng)液或細胞培養(yǎng)基。
3. 如權利要求1或2所述的一種體外干眼模型的建立方法，其特征在于在步驟l)中， 所述培養(yǎng)基內(nèi)添加抗生素，進行防污染處理。
4. 如權利要求1所述的一種體外干眼模型的建立方法，其特征在于在步驟2)中，所述 結膜組織塊的大小為(3 6) mmx G 6) mm，或者為直徑3 8mm大小。
5. 如權利要求1所述的一種體外干眼模型的建立方法，其特征在于在步驟4)中，所述 培養(yǎng)基選自上皮細胞培養(yǎng)液或細胞培養(yǎng)基。
6. 如權利要求1所述的一種體外干眼模型的建立方法，其特征在于在步驟4)中，所述 培養(yǎng)基內(nèi)添加抗生素，進行防污染處理。
7. 如權利要求1所述的一種體外干眼模型的建立方法，其特征在于在步驟5)中，所述 將結膜組織塊置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至少4 20d期間，定期更換培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基的時間每1 3d更換一次。
8. 如權利要求1所述的一種體外干眼模型在干眼的模擬、研究和防治中的應用。
全文摘要
一種體外干眼模型的建立方法，涉及一種干眼模型。提供一種不僅簡便易行、重復性好、較動物模型成本低，而且具有與干眼相似的許多組織病理學特征的體外干眼模型的建立方法以及在模擬、研究和防治干眼中的應用。將包含結膜上皮和結膜下基質的結膜組織剪下置于培養(yǎng)基內(nèi)；將結膜組織修剪成為結膜組織塊；將結膜組織塊置于I型膠原包被的培養(yǎng)皿插件上，結膜上皮面朝上；將培養(yǎng)基加入插件外的培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基氣液界面處于結膜組織塊的結膜上皮與結膜下組織交界處；將結膜組織塊置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)即得。可用于干眼鱗狀上皮化生、眼表上皮屏障破壞、眼表上皮粘蛋白改變、干眼發(fā)病中炎癥介質的參與以及凋亡在干眼發(fā)生發(fā)展中的作用等相關研究。
文檔編號C12N5/08GK101508974SQ200910111318
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月19日 優(yōu)先權日2009年3月19日
發(fā)明者劉祖國, 煒 李, 輝 林, 瞿楊洛娃 申請人:廈門大學