專利名稱：天山雪蓮sikPrx基因在培育抗逆植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir)中克隆得到SikPrx基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，并對(duì)植物抗旱、抗寒和抗鹽效 果進(jìn)行評(píng)價(jià)，增加了植物的抗逆性能。
背景技術(shù)：
在有氧環(huán)境下，各種生物的代謝產(chǎn)物中普遍含有活性氧族(ROS)，其中包括過(guò)氧 化氫(H2O2)、這些活性氧在機(jī)體的大量堆積可導(dǎo)致蛋白質(zhì)損傷、膜脂過(guò)氧化、堿基突變、 DNA斷裂等，妨礙各種生理生化代謝過(guò)程的正常進(jìn)行，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞、組織死亡，因此逆 境對(duì)植物的傷害實(shí)際上可以歸結(jié)為過(guò)量的ROS對(duì)植物產(chǎn)生的傷害。為了減輕活性氧對(duì)植 物傷害，生物在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展形成了各種抗氧化系統(tǒng)，以抵抗這些活性氧族的破壞作 用，并由一些酶類來(lái)修復(fù)由氧化作用所致的損害?？寡趸瘎┌ňS生素E、維生素C、維生 素A、類胡蘿卜素、超氧歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶以及 peroxiredoxin (Prx)等。peroxiredoxin (Prx)基因是新近發(fā)現(xiàn)的一類編碼過(guò)氧化物酶的基因，主要包括硫 氧化還原蛋白過(guò)氧化物酶(TPx)、烷基過(guò)氧化氫還原酶C(AhpC)等，其中最早報(bào)道的是在釀 酒酵母中發(fā)現(xiàn)的TPx。該抗氧化酶系分布廣泛，幾乎存在于所有酵母、真菌、植物、寄生蟲(chóng)、哺 乳動(dòng)物和人類等多種生物體內(nèi)。最初對(duì)Prx功能的描述主要來(lái)源于對(duì)細(xì)菌和酵母的研究。 其編碼蛋白屬于抗氧化蛋白超家族，其催化活性和蛋白序列與其它抗氧化劑完全不同，它 除了在清除活性氧中具有重要作用以外，還具有刺激細(xì)胞增殖，參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等其 它多種功能。由于它在清除活性氧族中具有重要作用，已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。Prx不含有結(jié)合金屬的離子，無(wú)需與金屬離子結(jié)合就具有抗氧化作用。其抗氧化活 性是通過(guò)分解烷基過(guò)氧化物和過(guò)氧化氫，從而阻止強(qiáng)氧化劑-羥自由基的產(chǎn)生。Prx含高 度保守的具還原活性的半胱氨酸，與酶的抗氧化活性有關(guān)。根據(jù)已知的Prx基因序列與氨 基酸序列，可將其分為I-Cys和2-Cys兩類。前者僅在47位上有一個(gè)高度保守的半胱氨酸 殘基，后者則在47位和170位上分別有一個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基。此外，2-Cys類Prx 在Cys47周圍的保守序列為苯丙氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-脯氨酸，簡(jiǎn)稱FVCP，而I-Cys類 Prx在Cys47周圍的保守序列為脯氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-蘇氨酸，簡(jiǎn)稱PVCT。2-Cys類Prx是通過(guò)一條肽鏈上的Cys47巰基與對(duì)應(yīng)肽鏈上的Cysl70巰基之間 脫氫形成分子內(nèi)二硫鍵即Cys47S-SCysl70，以供氫而還原氧化，然后再依靠其他供氫體將 還原型輔酶II的H+轉(zhuǎn)移至Prx，使其恢復(fù)原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能。例如酵母的TPx，其結(jié)構(gòu)為 25kDa的二聚體，當(dāng)與過(guò)氧化物反應(yīng)時(shí)，首先是一條肽鏈上的Cys47巰基被氧化為Cys47硫 鍵，再與另1條肽鏈上的Cysl70巰基結(jié)合，這樣氫離子可還原過(guò)氧水，從而發(fā)揮抗氧化作 用。爾后通過(guò)硫氧化還原蛋白氧化態(tài)與還原態(tài)間的轉(zhuǎn)換，將還原型輔酶II的氫離子轉(zhuǎn)移給 Prx，使Prx再生。許多試驗(yàn)證明植物的2-CysPrxs大都定位于葉綠體中。正常條件下，當(dāng)葉綠體中產(chǎn)生0_2后即能快速地為SOD歧化為H2O2和02，H2O2及其衍生物則被APX、GPX或2_Cys Prxs 快速地清除或還原。然而，在受到干旱、鹽堿、低溫逆境條件下，葉綠體的S0D、APX、GPX等活 性氧清除酶的生成易被抑制或易失活。因此，如何激活葉綠體清除酶或調(diào)節(jié)其基因表達(dá)，或 導(dǎo)入能夠高效表達(dá)的活性氧清除酶基因，對(duì)提高植物抗逆性具有重要意義。新疆雪蓮(Sasussured involucrate Kar. et Kir.)為多年生一次性開(kāi)花結(jié)實(shí)的 高山草本植物，主要分布在2400 4000m的高原寒帶地區(qū)，其境特異，最高月平均溫度3 5°C，最低月平均溫度19 21°C。與一般抗寒植物不同，雪蓮在極端低溫下通過(guò)積極的生命 活動(dòng)來(lái)適應(yīng)嚴(yán)寒，在雪中能旺盛生長(zhǎng)并且開(kāi)花。具有極強(qiáng)的耐寒、抗輻射、抗風(fēng)沙、抗缺氧的 能力，是天山雪線以上的惟一大型高等植物。雪蓮長(zhǎng)年生長(zhǎng)在極端環(huán)境下，決定了其具有許 多特殊的抗逆功能基因，其表達(dá)產(chǎn)物可能在逆境條件下，具有更好的穩(wěn)定性和更好的活性 功能。目前還未見(jiàn)關(guān)于天山雪蓮peroxiredoxin (Prx)基因sikPrx的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是為植物抗逆育種提供有價(jià)值的天山雪蓮 peroxiredoxin (Prx)的基因sikPrx，其發(fā)明的目還在于構(gòu)建植物表達(dá)載體 pBI121-sikPrx，在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性、抗旱性和耐鹽性，通 過(guò)該基因的過(guò)量表達(dá)，使植物的抗逆脅迫性能得到提高，最終獲得抗寒性、抗旱性和耐鹽性 能力明顯增強(qiáng)的植物。通過(guò)天山雪蓮低溫誘導(dǎo)下基因的表達(dá)譜分析，從已建的天山雪蓮cDNA文庫(kù)中篩 選到了一個(gè)peroxiredoxin (Prx)的基因sikPrx，其序列為<210>1。該基因基因全長(zhǎng)935bp， 開(kāi)放閱讀框?yàn)?92bp，編碼263個(gè)氨基酸。通過(guò)亞細(xì)胞定位在線軟件分析表明，該蛋白質(zhì)含 有定位于葉綠體信號(hào)肽，長(zhǎng)54個(gè)氨基酸。在成熟肽的第62位和182位含有2個(gè)-Cys，Cys62 位周圍含保守序列為苯丙氨酸_纈氨酸_半胱氨酸_脯氨酸(FVCP)，屬2-Cys類Prx，與已 知的油菜(Brassica napus)的 2_Cys-peroxiredoxin 同源性最高。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下過(guò)程和方法實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的從天山雪蓮中克隆sikPrx基因，其序列為<210>1。本發(fā)明的從天山雪蓮中克隆sikPrx基因的過(guò)程如下以天山雪蓮cDNA文庫(kù)單克隆質(zhì)粒為模板，用PPl其序列為<210>2和PP2其序列 為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因；sikPrx基因植物表達(dá)載體構(gòu)建構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-SikPrx ；利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物NaCl處理后，轉(zhuǎn)sikPrx基因煙草的相對(duì)含水量比對(duì)照煙草的含水量高；傷害率較 對(duì)照減弱；MDA含量較低；過(guò)氧化物酶活性是對(duì)照煙草的10倍。轉(zhuǎn)sikPrx基因煙草在鹽脅 迫下表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗鹽性。不同濃度PEG6000處理后，轉(zhuǎn)sikPrx基因煙草的相對(duì)含水量比對(duì)照煙草的含水量 高；隨著PEG6000濃度的升高，傷害率呈上升趨勢(shì)，較對(duì)照煙草低；MDA含量較低；過(guò)氧化物 酶活性始終高于對(duì)照煙草。水分脅迫試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)sikPrx基因煙草的相對(duì)含水量始終高于對(duì)照組煙草，隨著脅迫的時(shí)間延長(zhǎng)，相對(duì)含水量的下降趨勢(shì)小于對(duì)照煙草；傷害率較對(duì)照減弱，下降的幅度高達(dá) 10倍；MDA含量較對(duì)照較低；過(guò)氧化物酶的活力呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)SikPrx基因煙草 在干旱脅迫下表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗旱性。低溫脅迫試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)SikPrx基因煙草的相對(duì)含水量始終高于對(duì)照組煙草，相對(duì)含 水量的下降趨勢(shì)小于對(duì)照煙草；傷害率較對(duì)照低；MDA含量較對(duì)照較低；過(guò)氧化物酶的活力 呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)SikPrx基因煙草在低溫下表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗寒性。轉(zhuǎn)天山雪蓮peroxiredoxir^Prx)基因sikPrx煙草的抗逆功能分析表明，轉(zhuǎn)基因 煙草對(duì)干旱、高鹽和低溫都表現(xiàn)出了極強(qiáng)的抗性水平。


圖 1 是天山雪蓮 pGM-sikPrx PCR 鑒定圖 Figl :The amplification of pGM-sikPrx圖 2 是天山雪蓮 pGM-sikPrx 酶切鑒定圖 Fig2 :The enzyme digestion ofpGM-sikPrx圖3是天山雪蓮sikPrx氨基酸同源性分析Fig3 :The homology analysis of amino acid of sikPrx圖 4 是 pBI121-sikPrx PCR 鑒定 Fig4 :PCR identification ofpBI121-sikPrx圖 5 是 sikPrx 轉(zhuǎn)化煙草 PCR 檢測(cè) Fig5 :The amplification of transgenic tobacco ofsikPrx圖 6 是 sikPrx 轉(zhuǎn)基因煙草 RT-PCR 分析 Fig6 =RT-PCR analysis on sikPrx transgenic tobacco圖7是逆境脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草形態(tài)的影響圖8是鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)的影響圖9是PEG6000脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)的影響圖10是水分脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)的影響圖11是低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)的影響圖12是天山雪蓮sikPrx植物表達(dá)載體pBI121_SikPrx的構(gòu)建流程 1 中1, MarkerIII 2-3, pGM-sikPrx 1, MarkerIII 2-3, pGM-sikPrx圖 2 中1. enzyme digestion(Xbal/SacI) 3. enzyme digestion (EcoRl)2. 4 Plasmid 5. MarkIII圖 4 中l(wèi).Markerlll 2. Negaive 3-5. PCR of pBI121_sikPrx圖 5 中l(wèi)-10.pBI121-sikPrx 轉(zhuǎn)化煙草 0. Negative Μ· Marker III圖 6 中3-5.pBI121-sikPrx 轉(zhuǎn)化煙草 2. Negative Μ· Marker III圖 7 中
l,500mmoINaCl 處理 2，30% PEG6000 處理 8d 3，干旱脅迫 9d 的實(shí)驗(yàn)
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Tiangen公司生產(chǎn)；EcoR I、XbaI、 SacI、T41igase和Taq酶均購(gòu)于上海生物公司；pGM-Τ載體購(gòu)于北京Tiangen公司；DNA瓊 脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)于北京百泰克公司。具體實(shí)驗(yàn)操作依據(jù)[美]J.薩姆布魯克D. W.拉 塞爾的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。實(shí)施例1 天山雪蓮cDNA文庫(kù)單克隆質(zhì)粒的提取取天山雪蓮cDNA文庫(kù)單克隆保存的甘油管于IOmlLB液體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml) 中，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。蘸取菌液于LB固體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml)平板上劃線培 養(yǎng)，37°C暗培養(yǎng)12-16hr。挑取單克隆于20mlLB液體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm 振蕩培養(yǎng)14hr，提取質(zhì)粒，具體方法如下1)將菌液分裝于1. 5ml Ep管，12000rpm離心3min，棄上清液；2)加入400ml STE溶液，重懸，12000rpm離心3min，棄上清液；
3)沉淀用150 μ L堿裂解溶液I重懸，混勻；4)加入新鮮配制的300 μ L堿裂解溶液II，輕輕混勻，至溶液清澈；5)加入225 μ L堿裂解溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min ；離心(12000rpm， 5min)；6)吸取上清于另一新Ep管，加入等體積三氯甲烷，充分混勻，室溫放置5min ；離心 (10000rpm,5min)；7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入兩倍體積無(wú)水乙醇約為850 μ L，-20°C放置 IOmin ；離心(12000rpm, 5min)；8)棄去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫吹干后溶于40 μ L TE (含RNase A 20 μ g/ml)溶液中，37°C溫育 30min。實(shí)施例2 從天山雪蓮中克隆到SikPrx基因以天山雪蓮cDNA文庫(kù)單克隆質(zhì)粒為模板，用PPl其序列為<210>2和PP2其序列 為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以去離子水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對(duì)照。PP1 為<210>2
5' TCTAGAAGATTCAACGATGGCT 3'
PP2為<210>3
5’ GAGCTCTTAGTTATACAGCTGCAA 3’
PCR反應(yīng)體系(20 μ 1)為:
10XPCR Buffer 2. 0 μ 1
dNTPs (各 2. 5mM) 0. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 2μ 1
上游引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
下游引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
模板 DNA (ddH20)0. 5μ 1
Taq DNA Polymerase(2. 5U/μ 1)0. 3μ 1
ddH2014. 5μ 1Total20. 0μ 1PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性 4min ；95°C變性 30s，60°C 復(fù)性 30s，72°C 延伸 45s， 30cycles ；72°C延伸 IOmin ；4°C保溫。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)濃度為1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用Tiangen 的瓊脂糖凝膠回收試劑盒按照說(shuō)明書(shū)方法分別回收目的基因，得到的目的片段命名為 sikPrxο 如圖 1、2。實(shí)施例3 構(gòu)建sikPrx基因植物表達(dá)載體構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-SikPrx。用Xbal/SacII分別雙酶切植物表達(dá)載體 PBI121，獲得載體片段?；厥漳康幕蚱魏洼d體片段。將目的基因片段與載體片段進(jìn)行 體外連接，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pBI121-sikPrx。在本實(shí)施方案中，我們選用 煙草作為轉(zhuǎn)基因植物材料，也可選用其它植物作為轉(zhuǎn)基因材料。如圖4、12。在本實(shí)施方案中，sikPrx基因和pBI121構(gòu)成一個(gè)植物表達(dá)載體，用于植物的轉(zhuǎn) 化。根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，構(gòu)建所選用的植物表達(dá)載體除了 PBI121之外，還可以選 用其他植物表達(dá)載體。實(shí)施例4 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化4. 1農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備1)從新鮮的GV3101平板上挑取一個(gè)單菌落于LB液體培養(yǎng)基(5ml)+Rif (50ug/ ml)+Gen(50ug/ml)中，于 28°C、200rpm 振蕩培養(yǎng) 48hr ；2)取 200ul 菌液于 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen(50ug/ml)的 LB 液體培養(yǎng)基中 活化培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；3)分裝菌液于1. 5ml離心管，于4°C，6000rpm離心5min，棄盡上清，收集農(nóng)桿菌細(xì) 胞；4)將沉淀的農(nóng)桿菌用750ul預(yù)冷的0. 05mol/LCaCl2重懸，4 °C，8000rpm離心 5min ；5)棄上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重懸細(xì)胞，保存于_70°C。4. 2植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101 (凍融法)1)吸取10 μ 1上述重組載體質(zhì)粒(約0. 5 μ g/ μ 1)，與75 μ 1 GV3101感受態(tài)細(xì)胞 輕輕混勻，冰浴30min，然后液氮凍存5min ；2)迅速置于37°C水浴2min ；3)加入 600 μ 1 液體 LB 培養(yǎng)基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振蕩培養(yǎng) 5hr ；4)將上述培養(yǎng)液于6000rpm離心5min，收集農(nóng)桿菌細(xì)胞，棄去500 μ 1液體培養(yǎng) 基，剩余100 μ 1重懸細(xì)胞；5)將菌液涂布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固體 LB 培 養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)24-48hr。4. 3陽(yáng)性克隆篩選挑取若干單菌落，進(jìn)行菌落PCR，將篩選出的陽(yáng)性克隆命名為 pBI121-sikPrx-GV3101。在本實(shí)施方案中，植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉的技術(shù)操作，不是本發(fā)明的關(guān)鍵。通過(guò)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的農(nóng)桿菌菌株，用于轉(zhuǎn) 化植物。實(shí)施例5 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及再生本發(fā)明中對(duì)于靶植物的轉(zhuǎn)化方法不是關(guān)鍵，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的各 種不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組DNA序列導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化的靶植物細(xì)胞。這些方法包括但不僅限于農(nóng) 桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法 等均可。本方案中用于將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株的方法，可以使用適合于其他靶植物。最好 使被轉(zhuǎn)化的序列穩(wěn)定的整合到靶植物細(xì)胞的基因組中，從而使其在傳代的過(guò)程中不被丟 失。另外，用于轉(zhuǎn)化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染 色體的形式存在。5. 1農(nóng)桿菌浸染液的制備1)從-70°C保存的含有pBI121-sikPrx-GV3101的GV3101農(nóng)桿菌甘油管中挑取 菌塊，接種于5ml附加有Kan 50 μ g/ml, Rif 50 μ g/ml, Gen 50 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中， 28 0C，200rpm 振蕩培養(yǎng)約 30hr ；2)吸取 200 μ 1 菌液，再用 20ml LB 液體培養(yǎng)基(Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml)稀釋，28°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)約 4hr ；3)活化的菌液培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 4-0. 6時(shí)，即為轉(zhuǎn)化用的浸染液。5. 2 浸染1)超凈工作臺(tái)上將浸染液倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將無(wú)菌煙草葉片剪成Icm2大小的方 塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin ；2)取出煙草葉片，用濾紙吸干凈葉盤上附著的菌液；3)在共培養(yǎng)基(MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. 3mg/L)上覆一張無(wú)菌濾紙，將浸染過(guò)的葉 盤均勻地?cái)[放在濾紙上；在26°C暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2-3天。5. 3抗性愈傷組織篩選及出芽誘導(dǎo)將共培養(yǎng)過(guò)的煙草葉盤轉(zhuǎn)移至MS+6-BA 2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的煙草誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基上，葉盤傷口充分接觸培養(yǎng)基。每15-20天轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接
1-2次以后，葉盤邊緣逐漸產(chǎn)生淡綠色、致密的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)直至誘導(dǎo)出叢生芽。5. 4轉(zhuǎn)化植株的生根培養(yǎng)和移栽待叢生芽長(zhǎng)至2-3cm左右時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)接到MS+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的煙草生根選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因煙草15天左右開(kāi)始有根生成，待根系發(fā)達(dá)時(shí)，將根系生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化植 株，去除封口膜，室溫環(huán)境中進(jìn)行煉苗7天左右，然后用水洗凈培養(yǎng)基，將苗轉(zhuǎn)入基質(zhì)(蛭 石腐質(zhì)土 =2 1)中，26°C，16hr 40 μ mol · πΓ2 · s—1光照，70%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)，前
2-3天需遮陰、避光、保濕。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)6. 1轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定6. 1. 1 煙草 DNA 的提取(SDS 法)(1)稱取植物幼嫩葉片約0. Ig于研缽中，加液N充分研磨至粉末狀。
(2)將粉末分裝至1. 5mL的小離心管中，加入800 μ 1的CTAB提取緩沖液，充分混 勻，于 65°C水浴 20-30min。(3)將離心管冷卻至室溫后，加入400 μ 1的氯仿，充分混勻后，于10，OOOrpm離心 5min。(4)吸取上清至另一離心管，加入1/10V的10%的CTAB和600 μ 1的氯仿，充分混 勻后，10，OOOrpm離心5min。(重復(fù)一次)(5)吸取上層液體至另一離心管，加入1/10V的NaAC(pH5. 2)和2V的預(yù)冷的無(wú)水 乙醇，在_20°C沉淀IOmin。(6) 10，OOOrpm離心IOmin后，倒掉液體，可在離心管底部看到白色膠狀物質(zhì)即為 DNA。(7)用70%的乙醇洗沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入40 μ 1的ddH20溶解。6. 1.2轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定以提取的轉(zhuǎn)化基因的煙草DNA為模板，用LPl其序列為<210>2和LP2其序列為 <210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以去離子水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對(duì)照，擴(kuò)增體系如實(shí)施 例2。如圖5。6. 2轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測(cè)6. 2. 1待檢測(cè)植株總RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol總RNA提取試劑提取已鑒定的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)化的煙草 總 RNA 1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的槍頭、離心管均 使用0. 1 %的DEPC處理，高壓滅菌；2)取植物幼嫩葉片約0. Ig于研缽中，加液N充分研磨至粉末狀；3)將粉末分裝至1. 5mL的小離心管中，加入Iml的TRNzol提取試劑，充分快速混 勻，室溫放置3-5min。4) 10000rpm，4°C離心5min，吸上清至一新的離心管，加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩 混勻；5) 10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管后，加入600 μ 1預(yù)冷 的異丙醇，于_20°C沉淀30min ；6) IOOOOrpm,4°C離心IOmin后，倒掉液體，在離心管底部即可見(jiàn)到白色沉淀，即為 總 RNA。7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入30 μ 1 ddH20 (DEPC處理)溶解，保存于_20°C備用。6. 2. 2cDNA 第一鏈的合成在DEPC 處理的 0. 2ml 離心管中加入 RNA 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) 1 μ 1，Oligo dT 1 μ LddH2O 5μ 1后，在70°C水浴5min后迅速置于冰上lmin。然后在離心管中加入Rnase Inhibitor 0. 5 μ 1，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ 1，42°C 0. 5hr,95°C 5min 后，冷卻至 4°C。6. 2. 3cDNA第二鏈的合成及擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入cDNA第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物1 μ l，5XTaq buffer 4 μ 1， MgCl2 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. 5mM) 0. 5 μ 1，上下游引物(25ymol)各 0· 5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至20 μ 1，條件同實(shí)施例2。如圖6。實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因植株抗逆生理指標(biāo)的測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)的活力測(cè)定、丙二醛(MDA)含量的測(cè)定、相對(duì)含水量的測(cè)定和傷 害率的測(cè)定參照李合生(李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[Μ].北京高等教育出版 社，2003. Ρ164-165，，Ρ260-261，Ρ261-263)。重復(fù) 3 次。如圖 8、9、10、11。轉(zhuǎn)基因植株被鑒定后，通過(guò)無(wú)性繁殖獲得無(wú)菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后。植株成 活后選取生長(zhǎng)一致的苗(5-7葉期)，用打孔器打取已檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因的 煙草(NC89)植株的葉片各10片，放入裝有IOml的去離子水的玻璃試管中。低溫脅迫設(shè)置 四個(gè)溫度梯度15°C，4°C，0°C，-4°C。在低溫培養(yǎng)箱中，待溫度降到設(shè)定溫度時(shí)，處理8h，后 取植株第二到第五片葉片進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定。PEG6000 模擬干旱設(shè)置四個(gè)濃度梯度0% PEG6000,10% PEG6000,20% PEG6000, 30% PEG6000, NC89空白煙草對(duì)照組，每個(gè)濃度分別處理三棵，各組每株每天施IOOml PEG6000溶液，高濃度的PEG6000溶液從低濃度開(kāi)始，每隔24h遞增10%，直到達(dá)到終濃度， 處理9d后取植株第二到第五片葉片進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定。NaCl 設(shè)置四個(gè)濃度梯度0mmolNaCl、IOOmolNaCl，200mmolNaCl，500mmolNaCl， NC89空白煙草對(duì)照組，每個(gè)濃度分別處理三棵，各組分別每株每天施IOOmlNaCl溶液，高濃 度的NaCl溶液從低濃度開(kāi)始，每隔24h遞增lOOmmolNaCl直到達(dá)到終濃度，處理8d后取植 株第二到第五片葉片進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定。序列表<110>石河子大學(xué)<120>天山雪蓮SikPrx基因在培育抗逆植物中的應(yīng)用<160>3<210>1<211>935<212>DNA<213> ^Lljll^ (Saurrea. involucrata Kar. etKir.)<220><221>5，UTP<222>(1). . . (9)<220><221>CDS<222>(10). . . (801)<220><221>3，UTP<222>(802). . . (935)<400>1Translation of DNAMAN2(10—801)Universal codeTotal amino acid number :263，MW = 340940162]Max0163]10164]10165]0166]610167]210168]0169]1210170]410171]0172]1810173]610174]0175]2410176]810177]0178]3010179]1010180]0181]3610182]1210183]0184]4210185]1410186]0187]4810188]1610189]0190]5410191]1810192]0193]6010194]2010195]0196]6610197]2210198]0199]7210200]241
Max ORF starts at AA pos 3(may be DNA pos 9)for 263AA(789bases), Mff = 29085 gattcaacg atg get tgt tea tct get tea cct get ctt ctt tct tct cca ate get aga Met Ala Cys Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Leu Ser Ser Pro lie Ala Arg 70809010010120
tac att tcc ccc aaa tcc gtt ctc tcc caa acc cta agt ttt tcc ggt tc
aac Asn
ttc Ser
tcc Ser
tct Ser
Tyr lie Ser Pro Lys 130140
ctc gat caa ttt cag ate caa Ser lie Asn Phe Arg Ser Lys 190200
cgc tcg ttg caa tcg att cgt tgt Ala Arg Cys Asn Arg Phe Val Val
250260
aga ctt cga age aga age cgt ttt Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe
310320
tat egg gag gaa ata tgt ggt act lie Gly Arg Lys Tyr Val 370
tga gat cac tgc ttt Glu lie Ihr Ala Phe 430
ggg tgt ttc tgt aga Gly Val Ser Val Asp
aac Ihr
att Leu
gtc Ser
gga Glu
tgg ggg Gly Gly
tgg tga GlyAsp
gtc Ser
aga caa Asp Lys
aga tga Asp Glu
atg ccc Cys Pro
gtt Phe
gga Glu
aac Ihr
age Ala
ttc Ser 490 cct Leu 550 taa Asn 610 agg Gly 670 aat Met 730
tgg atg gaa Gly Trp Lys
tgt Val
ι
ggt Val
ι
gag Arg
gtt Leu
tat lie
aac Ihr
Ser Val Leu Ser Gln Thr
150160
ate cat cca ctc cgc act Ser lie His Ser Ala Leu 210 220 caa ggc tgg act acc act Lys Ala Gly Leu Pro Leu
270280
tga tea aga gtt cat caa Asp Gln Glu Phe lie Asn
330340
ctt ctt cta ccc att gga Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp 380390400
tag cga ccg ata tgc tga att tga Ser Asp Arg Tyr Ala Glu Phe Glu 440450460
cag cgt gtt ctc gca tct tgc ttg Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp 500510520
ttt gaa cta tcc att gat ttc gga Leu Asn Tyr Pro Leu lie Ser Asp 560570580
gat caa aga tea ggg gat age gtt lie Lys Asp Gln Gly lie Ala Leu 620630640
tea gca ctc gac gat caa caa tct Gln His Ser Thr lie Asn Asn Leu 680690700
act tea cgc att gca att tgt aca Leu His Ala Leu Gln Phe Val Gln 740750760
gcc tgg ggg gaa gtc aat gaa gcc Pro Gly Gly Lys Ser Met Lys Pro
Leu Ser Phe Ser Gly Ser
170180
ccc cgt tcg ctc ttc tac Pro Val Arg Ser Ser Ihr
230240
agt tgg aaa caa ggc acc Val Gly Asn Lys Ala Pro
290300
tgt taa get ctc tga tta Val Lys Leu Ser Asp Tyr
350360
ctt cac ttt tgt ttg tcc Phe Thr Phe Val Cys Pro
410420
gaa gtt gaa cac aga agt Lys Leu Asn Thr Glu Val
470480
ggt aca aac aga tag aaa Val Gln Thr Asp Arg Lys
530540
tgt gac aaa gtc aat ttc Val Thr Lys Ser lie Ser
590600
gag agg get att cat aat Arg Gly Leu Phe lie lie
650660
tgc aat egg cag aag cgt Ala lie Gly Arg Ser Val
710720
aga gaa ccc aga tga ggt Glu Asn Pro Asp Glu Val
770780
tga tcc taa act cag caa Asp Pro Lys Leu Ser Lys
790 800 810 820 830 840
781 gga ata ctt tgc age tgt ata act aaa ttc att att att aaa ata taa ttt taa gaa ggg
261 Glu Tyr Phe Ala Ala Val * * *
850 860 870 880 890
841 gtgggtgttt ttttttgcgg actccaggca tcactaactg ggagcgcttt tcctagtata
901 tataacaaac ccccccaagc ctaatatagt gatag
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tctagaag attcaacgatggct
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gagctcgagtttaggatcaggc
權(quán)利要求
1.一種從天山雪蓮中克隆SikPrx基因，其特征在于該基因935bp，其序列為<210>1， 在5’非編碼區(qū)有9bp，3’非編碼區(qū)有134bp，最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?92bp，編碼263個(gè)氨基酸。 通過(guò)亞細(xì)胞定位在線軟件分析表明，該蛋白質(zhì)含有定位于葉綠體信號(hào)肽，長(zhǎng)54個(gè)氨基酸。 在成熟肽的第62位和182位含有2個(gè)-Cys，Cys62位周圍含保守序列為苯丙氨酸-纈氨 酸_半胱氨酸_脯氨酸(FVCP)，屬2-Cys類Prx。
2.一種利用上述基因SikPrx基因構(gòu)建的植物表達(dá)載體。
3.一種從天山雪蓮中克隆序列為<210>1的SikPrx基因的用途，其特征在于利用上述 基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗寒轉(zhuǎn)基因植物。
4.一種從天山雪蓮中克隆序列為<210>1的SikPrx基因的用途，其特征在于利用上述 基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗旱轉(zhuǎn)基因植物。
5.一種從天山雪蓮中克隆序列為<210>1的SikPrx基因的用途，其特征在于利用上述 基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗鹽轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天山雪蓮sikPrx基因在培育抗寒、抗旱和抗鹽植物中的應(yīng)用，本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikPrx基因，利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗逆轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikPrx基因，并在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒、抗旱和抗鹽性，通過(guò)該基因的過(guò)量表達(dá)，使植物的抗低溫脅迫、抗旱和抗鹽性能得到提高，最終獲得抗逆能力明顯增強(qiáng)的植物。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102115758SQ200910113590
公開(kāi)日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者喻娜, 張煜星, 徐登獻(xiàn), 王愛(ài)英, 祝建波 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)