專利名稱：：天山雪蓮sikLTP基因在培育抗逆植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(SaussureainvolucrataKar.etKir)中克隆得到sikLTP基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，并對(duì)植物抗寒、抗旱和抗蟲效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，增加了植物的抗逆性能。
背景技術(shù)：
：LTP即脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Lipidtransferprotein)，是一類小的Cysteine-richlipid-binding蛋白(Jian-XunFENG,Sheng-JianJI,AnalysisofFiveDifferentiallyExpressedGeneFamiliesinFastElongatingCottonFiber,ActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2004,36(1):51-56)，具有在細(xì)胞膜內(nèi)外轉(zhuǎn)移磷脂的能力。植物中的LTP具有共同的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)分子量較低(大約為9-lOkDa)(Ζ.S.Gao·W.Ε.vandeffeg*J.G.Schaart,I.M.vanderMeer*L.Kodde*M.Laimer,LinkagemappositionsandallelicdiversityoftwoMal(non-specificlipidtransferprotein)genesinthecultivatedapple(Malusdomestica),TheorApplGenet,2005,110:479-491)(F.Chen·Μ.R.Foolad,Nucellar-cell-specificexpressionofalipidtransferproteingeneinbarley(HordeumvulgareL.)，PlantCellR印orts，1999，18:445-450)、高等電點(diǎn)、存在7-8個(gè)Cysteine殘基、具有90_93個(gè)氨基酸、位于保守位點(diǎn)并形成4個(gè)二硫橋、表達(dá)具有專一性(MariangelaS.S.Diz,AndreO.CarvalhoandValdireneΜ.Gomes,PurificationandmolecularmassdeterminationofalipidtransferproteinexudedfromVignaunguiculataseeds,Braz.J.PlantPhysiol,2003,15(3):171_175)0LTP具有4個(gè)α螺旋(α-helice)和一個(gè)C端，由4個(gè)二硫鍵所穩(wěn)定，并具一個(gè)內(nèi)陷的疏水腔，LTP運(yùn)輸磷脂分子時(shí)就是磷脂分子的疏水脂肪鏈尾嵌入LTP的疏水。LTP的這一特點(diǎn)恰好適于轉(zhuǎn)運(yùn)磷月旨功能(KrestenLindori-Larsen,JakobR.ffinther,Surprisinglyhighstabilityofbarleylipidtransferprotein,LTP1,towardsdenaturant,heatandproteases,FederationofEuropeanBiochemicalSocieties,2001,488:145-148),LTP在膜之間進(jìn)行磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)比較公認(rèn)的模式是LTP與磷脂形成LTP磷脂復(fù)合體。LTP對(duì)?；湹膹?qiáng)烈結(jié)合作用，及LTP空間結(jié)構(gòu)已表明有一疏水腔，LTP正好以其疏水腔容納磷脂分子的一個(gè)?；?，而不是整個(gè)磷脂分子。磷脂分子的兩個(gè)酰基鏈同LTP的作用是一個(gè)強(qiáng)一個(gè)弱，這有利于當(dāng)LTP攜帶磷脂分子到達(dá)膜表面時(shí)，進(jìn)行磷脂的交換。LTP能夠在生物膜之間轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂，參與了細(xì)胞內(nèi)生物膜形成，近期的研究又發(fā)現(xiàn)LTP具信號(hào)肽，可從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，位于細(xì)胞壁上，因而又對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)能力產(chǎn)生疑問(wèn)。而有證據(jù)表明LTP參與了角質(zhì)與臘質(zhì)的形成、植物的抗病反應(yīng)和植物對(duì)環(huán)境變化(溫度、鹽、干旱協(xié)迫)(張明永，梁承鄴，植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000,27(3):244-247)的適應(yīng)。Hany(HanyΑ.Μ.Sror,a,GilbertTischendorf,Cryoprotectinprotectsthylakoidsduringafreeze-thawcyclebyamechanisminvolvingstablemembranebinding,Cryobiology,2003,47:191-203)等人發(fā)現(xiàn)，LTP雖然在菠菜的抗寒中通過(guò)與類囊體膜結(jié)合，穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)從而增加了菠菜的抗寒性。LTP的定位研究提供了LTP可將?；鶈误w轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的證據(jù)，從而認(rèn)為L(zhǎng)TP參與了臘質(zhì)(wax)和角質(zhì)(cutin)的形成(JohanEdqvist,IsabelleFarbos,Characterizationofgermination-specificlipidtransferproteinsfromEuphorbialagascae，Planta，2002，215:41-50)。這一假設(shè)可從LTP是花椰菜葉表面臘質(zhì)中一種主要的蛋白質(zhì)，并且LTP基因主要在周邊細(xì)胞及幼胚中表達(dá)得到證實(shí)。LTP的向外分泌功能與體胚發(fā)生的聯(lián)系可解釋為它可能參與了幼胚外保護(hù)層的形成。最近的研究還表明LTP參與了植物的抗病反應(yīng)，是一種植物的抗病蛋白，純化的植物L(fēng)TP蛋白在體外可抑制細(xì)菌及真菌的生長(zhǎng)(SubhankarRoy-Barman,ChristofSautter,ExpressionofthelipidtransferproteinAce-AMPIintransgenicwheatenhancesantifungalactivityanddefenseresponses,TransgenicRes,2006,15=435-446)LTP參與植物抗病的機(jī)制卻不明確，一種觀點(diǎn)認(rèn)為它可能作為一種極性蛋白質(zhì)影響了真菌的細(xì)胞膜。洋蔥的一種抗病蛋白與LTP有同源性，但它不表現(xiàn)在轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)的功能。還有研究表明，LTP的表達(dá)受環(huán)境因子影響，如溫度、鹽和干旱協(xié)迫可誘導(dǎo)LTP基因的表達(dá)。NaCl、甘露醇、脫落酸(ABA)處理蕃茄可誘導(dǎo)LTP基因在莖的表達(dá)，大麥、棉花的LTP基因則可由低溫和ABA誘導(dǎo)表達(dá)。它們?cè)谀婢硡f(xié)迫下的表達(dá)同植物的抗逆性有關(guān)。LTP除了具有以上功能外，S.Gorjanovic等人發(fā)現(xiàn)大麥中的LTP還扮演著一個(gè)重金屬清道夫的角色(S.Gorjanovic.D.Sunjevic.M.Beljanski,Barleylipid-transferproteinasheavymetalscavenger,EnvironChemLett,2004(2):113-116),以及LTP$±曾與雖胃iffllfill白勺CJeroenNieuwland,RichardFeron,etal,LipidTransferProteinsEnhanceCellWallExtensioninTobacco,ThePlantCell,2005,7(17)2009-2019)等方面具有作用。國(guó)內(nèi)對(duì)LTP基因的研究相對(duì)較少。葛曉春(葛曉春，陳繼超，水稻非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的原核表達(dá)、純化及抑菌功能，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2002,34(1)83-87)等人在國(guó)內(nèi)首先克隆得到了兩個(gè)水稻的LTP，并且對(duì)LTP的脂質(zhì)結(jié)合活性以及對(duì)水稻病原真菌稻瘟病菌作了活性測(cè)定和抑菌實(shí)驗(yàn)。證明LTP確實(shí)具有結(jié)合脂肪酸分子的特性以及LTP濃度在13;3mg/L時(shí)能夠明顯抑制水稻病原真菌稻瘟病菌的生長(zhǎng)。新疆雪蓮(SasussuredinvolucrateKar.etKir.)為多年生一次性開花結(jié)實(shí)的高山草本植物，主要分布在MOO4000m的高原寒帶地區(qū)，其境特異，最高月平均溫度35°C，最低月平均溫度1921°C。與一般抗寒植物不同，雪蓮在極端低溫下通過(guò)積極的生命活動(dòng)來(lái)適應(yīng)嚴(yán)寒，在雪中能旺盛生長(zhǎng)并且開花。具有極強(qiáng)的耐寒、抗輻射、抗風(fēng)沙、抗缺氧的能力，是天山雪線以上的惟一大型高等植物。雪蓮長(zhǎng)年生長(zhǎng)在極端環(huán)境下，決定了其具有許多特殊的抗逆功能基因，其表達(dá)產(chǎn)物可能在逆境條件下，具有更好的穩(wěn)定性和更好的活性功能。我們從天山雪蓮中得到了SikLTP基因，其序列為<210>1，基因全長(zhǎng)620bp，5，非編碼區(qū)有49bp，3，非編碼區(qū)有19!3bp。最大開放閱讀框?yàn)?78bp，編碼125個(gè)氨基酸。編碼的氨基酸中有11個(gè)半胱氨酸，它們之間可形成多個(gè)二硫鍵，約占到總氨基酸數(shù)量的10%，這在LTP基因家族中較為少見。與擬南芥的LTPlike,proteaseinhibitor和seedstorage的氨基酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與他們的相似性均很差，其相似性在10.94%-17.46%之間。利用在線信號(hào)肽分析軟件SignalP3.OServer分析，其中前23個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽區(qū)域，其可能使表達(dá)蛋白分泌至胞外，涉及到細(xì)胞膜組分的改變。DNAMAN軟件對(duì)sikLTP基因的氨基酸的親水性進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)天山雪蓮LTP是明顯的疏水性蛋白，這與前人報(bào)道的LTP是堿性的可溶性蛋白不相吻合。將其氨基酸序列在NCBI比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與Blackcottonwood(Populustrichocarpa)在進(jìn)化上同源性最高。構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，并對(duì)植物抗寒、抗旱和抗蟲效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，sikLTP基因增加了植物的抗逆性能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是為植物抗逆育種提供有價(jià)值的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因sikLTP，其發(fā)明的目還在于構(gòu)建植物表達(dá)載體pBin438-sikLTP，在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性、抗旱性和抗蟲性，通過(guò)該基因的過(guò)量表達(dá)，使植物的抗逆脅迫性能得到提高，最終獲得抗寒性、抗旱性和抗蟲性能力明顯增強(qiáng)的植物。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下過(guò)程和方法實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的從天山雪蓮中克隆sikLTP基因，其序列為<210>1。本發(fā)明的從天山雪蓮中克隆sikLTP基因的過(guò)程如下以天山雪蓮cDNA文庫(kù)單克隆質(zhì)粒為模板，用CPl其序列為<210>2和CP2其序列為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因；sikLTP基因植物表達(dá)載體構(gòu)建構(gòu)建植物表達(dá)載體pBin438-sikLTP；利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物以未轉(zhuǎn)化煙草植株葉片為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因株系在模擬抗寒脅迫3小時(shí)后，與未轉(zhuǎn)基因株系相比，從室溫降至o°c的過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草的電導(dǎo)率差異很小，僅相差0.5%左右。但當(dāng)溫度降至-2-4°C，轉(zhuǎn)sikLTP煙草電導(dǎo)率明顯低于對(duì)照煙草。且在-4°C時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的電導(dǎo)率比對(duì)照煙草的電導(dǎo)率低近一倍。這表明轉(zhuǎn)基因煙草在-2-4°C時(shí)，未轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞已經(jīng)不能耐受低溫，細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物溢出，導(dǎo)致電導(dǎo)率上升，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞能夠耐受低溫，電導(dǎo)率并未出現(xiàn)大的變化，較對(duì)照煙草表現(xiàn)出了極強(qiáng)的耐寒能力。當(dāng)溫度低于-4°C時(shí)，無(wú)論是轉(zhuǎn)sikLTP基因煙草，還是對(duì)照煙草，其電導(dǎo)率均超過(guò)50%以上，此時(shí)表明細(xì)胞膜完全被破壞，細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)，因而電導(dǎo)率迅速升高。對(duì)轉(zhuǎn)sikLTP基因煙草和對(duì)照煙草的油酸和亞油酸的相對(duì)含量計(jì)算后對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)從正常室溫條件降至6°C的過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草中的油酸和亞油酸的相對(duì)含量的變化趨勢(shì)較為平緩，幾乎沒有很大的波動(dòng)。轉(zhuǎn)基因煙草中的油酸和亞油酸的相對(duì)含量稍高，且亞油酸的含量要高于油酸的含量。這可能因?yàn)檗D(zhuǎn)sikLTP基因煙草中，LTP蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂使得細(xì)胞膜的膜相構(gòu)成發(fā)生改變，不飽和脂肪酸的含量升高。當(dāng)溫度經(jīng)4°C降至-3°C時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草中的油酸和亞油酸的相對(duì)含量均有所增加，且在溫度為0°C時(shí)，其油酸和亞油酸的含量增加到最大值，但對(duì)照煙草中兩種不飽和脂肪酸的增加量不如轉(zhuǎn)基因煙草明顯。溫度降至_4°C后，轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草中的油酸和亞油酸的相對(duì)含量均出現(xiàn)回落。轉(zhuǎn)sikLTP煙草在溫度為4°C至_3°C時(shí)，具有較好的抗冷性。這與電導(dǎo)率測(cè)定得出的結(jié)果相同。轉(zhuǎn)sikLTP煙草在4°C_3°C的低溫范圍內(nèi)，具有較好的抗寒能力。轉(zhuǎn)sikLTP基因煙草和對(duì)照煙草經(jīng)5%的PEG6000模擬干旱脅迫3天后，其表型上觀察發(fā)現(xiàn)，它們均出現(xiàn)了輕度的萎焉現(xiàn)象，很難發(fā)現(xiàn)二者有所差異。但從測(cè)定的組織相對(duì)含水量來(lái)看，對(duì)照煙草的相對(duì)含水量降低了30%左右，而轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)含水量?jī)H僅降低了左右。且轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)含水量遠(yuǎn)高于對(duì)照煙草。表明轉(zhuǎn)SikLTP基因煙草在輕度的干旱脅迫下，具有較強(qiáng)的抗旱能力。溫室白粉虱通過(guò)刺吸煙草葉片的汁液造成煙草營(yíng)養(yǎng)缺乏，葉片變黃，最后慢慢死去。轉(zhuǎn)sikLTP基因的煙草上的白粉虱數(shù)量明顯少于非轉(zhuǎn)基因煙草。在非轉(zhuǎn)基因的煙草葉片的正面和背面，均附著有大量的白粉虱，發(fā)病最輕的葉片當(dāng)中，在約30cmX14cm大小的葉片上存在的白粉虱大約也有340只，嚴(yán)重時(shí)，其害蟲密度達(dá)到3.89只/cm2(700只/[15cmX12cm])。而轉(zhuǎn)sikLTP基因的煙草葉片上的數(shù)量明顯較少。在最多的葉片上，其害蟲密度也只有0.36只/cm2(80只/[25cmX9cm])，有些葉片上甚至根本沒有白粉虱存在。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于sikLTP基因的抗蟲性未有報(bào)道，煙草轉(zhuǎn)sikLTP基因出現(xiàn)的抗溫室白粉虱現(xiàn)象究其原因，可能是轉(zhuǎn)sikLTP基因煙草的表面產(chǎn)生蠟質(zhì)或角質(zhì)使得白粉虱難以刺入。本發(fā)明不僅得到天山雪蓮抗逆相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因sikLTP，而且將其構(gòu)建成的植物表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)基因植物中研究了該基因在提高植物抗寒性、抗旱性和抗蟲性性能中的重要功能。圖1是天山雪蓮pUCM-sikLTPPCR和酶切鑒定圖Figl:TheamplificationandenzymedigestionofpUCM-sikLTP圖2是天山雪蓮sikLTP氨基酸同源性分析Fig2:ThehomologyanalysisofaminoacidofsikLTP圖3是pBin438-sikLTPPCR鑒定Fig3:PCRidentificationofpBin438_sikLTP4^pBin438-sikLTPg|^^Fig4:TheenzymedigestionofpBin438-sikLTP圖5是sikLTP轉(zhuǎn)化煙草PCR檢測(cè)Fig5:TheamplificationoftransgenictobaccoofsikLTP圖6是sikLTP轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR分析Fig6=RT-PCRanalysisonsikLTPtransgenictobacco圖7是低溫脅迫下煙草電導(dǎo)率測(cè)定Fig7:ThemeasurementofconductivityoftobaccounderLowtempreture圖8是轉(zhuǎn)sikLTP煙草低溫下油酸含量測(cè)定Fig8:ThecontentmeasureofoleicacidoftransgenictobaccoofsikLTPunderlowtempreture圖9是轉(zhuǎn)sikLTP煙草低溫下亞油酸含量測(cè)定Fig9:ThecontentmeasureoflinoleicacidoftransgenictobaccoofsikLTPunderlowtempreture圖10是5%PEG6000脅迫下相對(duì)含水量變化FiglO:Thechangeofrelativewatercontentunder5%PEG6000stress圖11是溫室白粉虱侵害狀況對(duì)比Figll:ThestatusofinfringementbygreemhousewhitefIy圖12是植物表達(dá)載體是pBin438-sikLTP的構(gòu)建流程圖圖1中1,2.SikLTP(PCR)3.NegativeΜ.MarkerIII4.sikLTP(BamHI/Sall)5.Plasmid圖3中1.Negative2.pBin438_sikLTPΜ.MarkerIII圖4中1,2:pBin438-sikLTP(BamHI/SalI)M.MarkerII圖5中1-7.pBin438-sikLTP轉(zhuǎn)化煙草8.NegativeΜ·MarkerIII圖6中1-5.pBin438-sikLTP轉(zhuǎn)化煙草6.NegativeΜ·MarkerIII具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Tiangen公司生產(chǎn)；RNA酶、Taq酶、T4-DNA連接酶(T4-DNAligase)、Marker、TRNzol總RNA提取試劑購(gòu)于Tiangen公司；BamHI、SalI等限制性內(nèi)切酶為i^ermentas公司原裝；IPTG、X-gal及抗生素購(gòu)自上海Sangon公司；其他試劑及配制MS培養(yǎng)基的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。具體實(shí)驗(yàn)操作依據(jù)[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。實(shí)施例1天山雪蓮cDNA文庫(kù)單克隆質(zhì)粒的提取取天山雪蓮cDNA文庫(kù)單克隆保存的甘油管于IOmlLB液體培養(yǎng)基(Cm50μg/ml)中，37°C220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。蘸取菌液于LB固體培養(yǎng)基(Cm50μg/ml)平板上劃線培養(yǎng)，37°C暗培養(yǎng)12-16hr。挑取單克隆于20mlLB液體培養(yǎng)基(Cm50μg/ml)中，37°C220rpm振蕩培養(yǎng)14hr，提取質(zhì)粒，具體方法如下1)將菌液分裝于1.5mlEp管，12000rpm離心3min，棄上清液；2)加入400mlSTE溶液，重懸，12000rpm離心3min，棄上清液；3)沉淀用150μL堿裂解溶液I重懸，混勻；4)加入新鮮配制的300μL堿裂解溶液II，輕輕混勻，至溶液清澈；5)加入225μL堿裂解溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min；離心(12000rpm，5min)；6)吸取上清于另一新Ep管，加入等體積三氯甲烷，充分混勻，室溫放置5min；離心(10000rpm,5min)；7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入兩倍體積無(wú)水乙醇約為850μL，_20°C放置IOmin；離心(12000rpm,5min)；8)棄去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫吹干后溶于40μLTE(含RNaseA20μg/ml)溶液中，37°C溫育30min。實(shí)施例2從天山雪蓮中克隆到sikLTP基因以天山雪蓮cDNA文庫(kù)單克隆質(zhì)粒為模板，用LPl其序列為<210>2和LP2其序列為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以去離子水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對(duì)照。LP1為<210>25'GGATCCkCClATGGCGACTCACTCCATCACTT3’BamHILP2為<210>35’GTCGACTTATTCGCACTTGAAGCCTGGT3’SalIPCR反應(yīng)體系(20μ1)為:10XPCRBuffer2.0μ1dNTPs(各2.5mM)0.5μ1MgCl2(25mM)1.2μ1上游引物(25μΜ)0.5μ1下游引物(25μΜ)0.5μ1模板DNA(ddH20)0.5μ1TaqDNAPolymerase(2.5U/μ1)0.3μ1ddH2014.5ulTotal20.0μ1PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性4min；95°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸45s，30cycles；72°C延伸IOmin；4°C保溫。如圖1、2。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用Tiangen的瓊脂糖凝膠回收試劑盒按照說(shuō)明書方法分別回收目的基因，得到的目的片段命名為SikLTP0實(shí)施例3構(gòu)建SikLTP基因植物表達(dá)載體構(gòu)建植物表達(dá)載體PBin438-sikLTP。用BamHI/&ilI分別雙酶切植物表達(dá)載體pBin438，獲得載體片段?；厥漳康幕蚱魏洼d體片段。將目的基因片段與載體片段進(jìn)行體外連接，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pBin438-sikLTP。在本實(shí)施方案中，我們選用煙草作為轉(zhuǎn)基因植物材料，也可選用其它植物作為轉(zhuǎn)基因材料。如圖3、4。在本實(shí)施方案中，SikLTP基因和pBin438構(gòu)成一個(gè)植物表達(dá)載體，用于植物的轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，構(gòu)建所選用的植物表達(dá)載體除了pBin438之外，還可以選用其他植物表達(dá)載體。實(shí)施例4農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化4.1農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備1)從新鮮的GV3101平板上挑取一個(gè)單菌落于LB液體培養(yǎng)基(5ml)+Rif(50ug/ml)+Gen(50ug/ml)中，于、200rpm振蕩培養(yǎng)48hr；2)取200ul菌液于20ml的含Rif(50ug/ml)及Gen(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)至OD6tltl=0.5-0.8收集菌液，冰浴30min；3)分裝菌液于1.5ml離心管，于4°C，6000rpm離心5min，棄盡上清，收集農(nóng)桿菌細(xì)胞；4)將沉淀的農(nóng)桿菌用750ul預(yù)冷的0.05mol/LCaCl2重懸，4°C，8000rpm離心5min；5)棄上清用75ul0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重懸細(xì)胞，保存于_70°C。4.2植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101(凍融法)1)吸取10μ1上述重組載體質(zhì)粒(約0.5μg/μ1)，與75μ1GV3101感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，冰浴30min，然后液氮凍存5min；2)迅速置于37°C水浴anin；3)加入600μ1液體LB培養(yǎng)基(Rif+Gen)，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)5hr；4)將上述培養(yǎng)液于6000rpm離心5min，收集農(nóng)桿菌細(xì)胞，棄去500μ1液體培養(yǎng)基，剩余100μ1重懸細(xì)胞；5)將菌液涂布在含有Kan50μg/ml,Rif50μg/ml及Gen50μg/ml的固體LB培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)M-4ir。4.3陽(yáng)性克隆篩選挑取若干單菌落，進(jìn)行菌落PCR，將篩選出的陽(yáng)性克隆命名為pBin438-sikLTP-GV3101。在本實(shí)施方案中，植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉的技術(shù)操作，不是本發(fā)明的關(guān)鍵。通過(guò)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的農(nóng)桿菌菌株，用于轉(zhuǎn)化植物。實(shí)施例5煙草遺傳轉(zhuǎn)化及再生本發(fā)明中對(duì)于靶植物的轉(zhuǎn)化方法不是關(guān)鍵，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的各種不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組DNA序列導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化的靶植物細(xì)胞。這些方法包括但不僅限于農(nóng)桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等均可。本方案中用于將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株的方法，可以使用適合于其他靶植物。最好使被轉(zhuǎn)化的序列穩(wěn)定的整合到靶植物細(xì)胞的基因組中，從而使其在傳代的過(guò)程中不被丟失。另外，用于轉(zhuǎn)化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。5.1農(nóng)桿菌浸染液的制備1)從_70°C保存的含有PBin438-sikLTP-GV3101的GV3101農(nóng)桿菌甘油管中挑取菌塊，接種于5ml附加有Kan50μg/ml,Rif50μg/ml,Gen50μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)約30h.；2)吸取200μ1菌液，再用20mlLB液體培養(yǎng)基(Kan50μg/ml，Rif50μg/ml，Gen50μg/ml)稀釋，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)約4hr；3)活化的菌液培養(yǎng)至OD6tltl=0.4-0.6時(shí)，即為轉(zhuǎn)化用的浸染液。5.2浸染1)超凈工作臺(tái)上將浸染液倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將無(wú)菌煙草葉片剪成Icm2大小的方塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin；2)取出煙草葉片，用濾紙吸干凈葉盤上附著的菌液；3)在共培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.3mg/L)上覆一張無(wú)菌濾紙，將浸染過(guò)的葉盤均勻地?cái)[放在濾紙上；在暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2-3天。5.3抗性愈傷組織篩選及出芽誘導(dǎo)將共培養(yǎng)過(guò)的煙草葉盤轉(zhuǎn)移至MS+6-BA2.Omg/L+IAA0.3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的煙草誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基上，葉盤傷口充分接觸培養(yǎng)基。每15-20天轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接1-2次以后，葉盤邊緣逐漸產(chǎn)生淡綠色、致密的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)直至誘導(dǎo)出叢生芽。5.4轉(zhuǎn)化植株的生根培養(yǎng)和移栽待叢生芽長(zhǎng)至2-3cm左右時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)接到MS+IAA0.3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的煙草生根選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因煙草15天左右開始有根生成，待根系發(fā)達(dá)時(shí)，將根系生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化植株，去除封口膜，室溫環(huán)境中進(jìn)行煉苗7天左右，然后用水洗凈培養(yǎng)基，將苗轉(zhuǎn)入基質(zhì)(蛭石腐質(zhì)土=21)中，26°C，16hr40μmol·πΓ2·s—1光照，70%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)，前2-3天需遮陰、避光、保濕。實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)6.1轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定6.1.1煙草DNA的提取(SDS法)(1)稱取植物幼嫩葉片約0.Ig于研缽中，加液N充分研磨至粉末狀。(2)將粉末分裝至1.5mL的小離心管中，加入800μ1的CTAB提取緩沖液，充分混勻，于65°C水浴20-30min。(3)將離心管冷卻至室溫后，加入400μ1的氯仿，充分混勻后，于10，OOOrpm離心5min。(4)吸取上清至另一離心管，加入1/10V的10%的CTAB和600μ1的氯仿，充分混勻后，10，OOOrpm離心5min。(重復(fù)一次)(5)吸取上層液體至另一離心管，加入1/10V的NaAC(pH5.2)和2V的預(yù)冷的無(wú)水乙醇，在_20°C沉淀IOmin。(6)10，OOOrpm離心IOmin后，倒掉液體，可在離心管底部看到白色膠狀物質(zhì)即為DNA。(7)用70%的乙醇洗沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入40μ1的ddH20溶解。6.1.2轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定以提取的轉(zhuǎn)化基因的煙草DNA為模板，用LPl其序列為<210>2和LP2其序列為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以去離子水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對(duì)照，擴(kuò)增體系如實(shí)施例2。如圖5。6.2轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測(cè)6.2.1待檢測(cè)植株總RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol總RNA提取試劑提取已鑒定的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)化的煙草總RNA1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的槍頭、離心管均使用0.1%的DEPC處理，高壓滅菌；2)取植物幼嫩葉片約0.Ig于研缽中，加液N充分研磨至粉末狀；3)將粉末分裝至1.5mL的小離心管中，加入Iml的TRNzol提取試劑，充分快速混勻，室溫放置3-5min。4)10000rpm，4°C離心5min，吸上清至一新的離心管，加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻；5)10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管后，加入600μ1預(yù)冷的異丙醇，于_20°C沉淀30min；6)IOOOOrpm,4°C離心IOmin后，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉淀，即為總RNA。7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入30μ1ddH20(DEPC處理)溶解，保存于_20°C備用。6.2.2cDNA第一鏈的合成在DEPC處理的0.2ml離心管中加入RNA2μ1，dNTP(2.5mM)1μ1，OligodT1μLddH2O5μ1后，在70°C水浴5min后迅速置于冰上lmin。然后在離心管中加入foiaseInhibitor0.5μ1，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μ1，42°C0.5hr,95°C5min后，冷卻至4°C。6.2.3cDNA第二鏈的合成及擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入cDNA第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物1μl，5XTaqbuffer4μ1，MgCl2(25mM)1.0μ1，dNTP(2.5mM)0.5μ1，上下游引物(25ymol)各0.5μ1，ddH20補(bǔ)足至20μ1，反應(yīng)條件同實(shí)施例2。如圖6。實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因植株的模擬寒害處理及葉片質(zhì)膜透性測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株被鑒定后，通過(guò)無(wú)性繁殖獲得無(wú)菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后。植株成活后選取生長(zhǎng)一致的苗(5-7葉期)。用打孔器打取已檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因的煙草植株的葉片各10片，放入裝有IOml的去離子水的玻璃試管中。分別在10°C、0°C、-2°C、-3°C、、-4V、-5°C、-6V和-7V低溫培養(yǎng)箱處理3h。如圖7。實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因植株的模擬寒害處理葉片不飽和脂肪酸含量測(cè)定將對(duì)照和轉(zhuǎn)LTP基因煙草整株分別放置于10°C、6°C、4°C低溫培養(yǎng)箱處理12h，在0°C、-2°C、-3°C、和-4°C低溫培養(yǎng)箱各處理證。用剪刀剪取葉片后，天平稱量，提取不飽和脂肪酸，具體提取方法如下(1)稱取植物葉片0.lg，放入裝有700μ1提取液的2ml離心管當(dāng)中，于80°C水浴處理3h。(2)將離心管取出，冷卻至室溫后，加入500μ1的去離子水，Iml正己烷，緩慢充分混勻。(3)分層后，吸上清至一新的離心管，自然干燥。(4)待上機(jī)測(cè)定時(shí)，加入50μ1正己烷，充分溶解。用島津GC-2010氣相色譜儀測(cè)定其油酸和亞油酸的含量，以標(biāo)準(zhǔn)品做出峰參照。氣相色譜條件色譜柱為DB-l，30mX0.25umX0.25mm;分流比為501；進(jìn)樣溫度為2900C；進(jìn)樣量為Iul；柱溫為120°C；界面溫度為270°C；柱流速為0.3ml/min；載氣為氮?dú)?空氣。如圖8、9。實(shí)施例9轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性分析濃度為5%的pEG6000，澆注于新移栽的轉(zhuǎn)基因煙草(處于相同含水量條件的蛭石當(dāng)中)的營(yíng)養(yǎng)缽中。如圖10。約脅迫3天后，剪取葉片，稱重，測(cè)定組織含水量，具體測(cè)定方法如下(1)稱取組織鮮重A后，然后將樣品浸入蒸餾水中12h，使組織吸水達(dá)飽和狀態(tài)。(2)取出用吸水紙吸去表面的水分，稱重B。(3)將組織葉片放入80°C烘干，稱重C。0150](4)計(jì)算相對(duì)含水量=(A-C)/(B-C)X100%0151]序列表0152]<110>石河子大學(xué)0153]<120>天山雪蓮SikLTP基因在培育抗逆植物中的應(yīng)用0154]<160>30155]<210>10156]<211>6200157]<212>DNA0158]<213>天山雪蓮(Saurrea.involucrataKar.etKir.)0159]<220>0160]<221>5，UTP0161]<222>(1)...(49)0162]<220>0163]<221>CDS0164]<222>(50)...(427)0165]<220>0166]<221>3，UTP0167]<222>(428)...(620)0168]<400>10169]TranslationofLTP(50-427)0170]Vertebratemitochodrialcode0171]Totalaminoacidnumber:126,MW=216000172]MaxORFstartsatAApos16(maybeDNApos49)for126AA(378bases),MW=14193120gettgtAlaCys180tgccctCysRro240gtggttValVal300gaagtcGluVal360gtccca0173]1acctcacatttgaagaacccatagctacaatctttgtctctcactagctatggcgactcac0174]1MetAlaHirHis70809010011061tccateacttgtatettcatttcctttctcatettcaccgtcacatattct21SerlieIhrCysliePhelieSerPheLeuliePheHirValHirTyrSer130140150160170121ggttcgtgcatgccaacaccattaccacctaagggtCCCCCggcgaatccc41GlySerCysMetProIhrProLeuProRroLysGlyRroRroAlaAsnRro190200210220230181agggacgcattgaagttaggagtttgtgccgatgttCtgggtCtggtcaat61ArgAspAlaLeuLysLeuGlyValCysAlaAspValLeuGlyLeuValAsn250260270280290241ggaaccccaacateaageaaatgttgtgcactacttgagggtttggttgat81GlyIhrProIhrserSerLysCysCysAlaLeuLeuGluGlyLeuValAsp31032033034035030gcagettgtCtttgcactgccateaaggetaacgtcttgggaateaacctcgatAspttcPhegtaValttgLeuaac0189]101AlaAlaCysLeuCysThrAlalieLysAlaAsnValLeuGlylieAsnLeuAsnValRro0190]3703803904004104200191]361ateacattaagettgttgctcagtgettgtggcaagaccgttccaccaggcttcaagtgc0192]121lieThrLeuSerLeuLeuLeuSerAlaCysGlyLysThrValRroRroGlyPheLysCys0193]4304404504604704800194]421gaataaatatgcagtttgatagaaacttataaccctttcgtttaattcatecatcatgtt0195]141Glu-k-k-k0196]4905005105205300197]481catcaaatgggtatttattgcccacaaaatgagcatgaaaagtattaaaacgaatggatt0198]541ataatttttataaatatttaaattgtgaatttgttaagggggctcttgattggggtttta0199]601tttgtaacatgcttgtgat0200]<210>20201]<211>310202]<212>DNA0203]<213>人工序列0204]<400>20205]ggatccaccatggcgactcactccatcactt0206]<210>30207]<211>280208]<212>DNA0209]<213>人工序列0210]<400>30211]gtcgacttattcgcacttgaagcctgg權(quán)利要求1.一種從天山雪蓮中克隆SikLTP基因，其特征在于該基因全長(zhǎng)620bp，其序列為<210>1，在5，非編碼區(qū)有49bp，3’非編碼區(qū)有193bp，最大開放閱讀框?yàn)?78bp，編碼125個(gè)氨基酸，有11個(gè)半胱氨酸，可形成多個(gè)二硫鍵，占到總氨基酸數(shù)量的10%，在LTP基因家族中較為少見。在線信號(hào)肽分析軟件SignalP3.(Server分析，其前23個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽區(qū)域，其可能使表達(dá)蛋白分泌至胞外，涉及到細(xì)胞膜組分的改變。2.一種利用上述基因sikLTP基因構(gòu)建的植物表達(dá)載體。3.一種從天山雪蓮中克隆序列為<210>1的sikLTP基因的用途，其特征在于利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗寒轉(zhuǎn)基因植物。4.一種從天山雪蓮中克隆序列為<210>1的sikLTP基因的用途，其特征在于利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗旱轉(zhuǎn)基因植物。5.一種從天山雪蓮中克隆序列為<210>1的sikLTP基因的用途，其特征在于利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植物。全文摘要本發(fā)明涉及一種天山雪蓮sikLTP基因在培育抗寒、抗旱和抗蟲植物中的應(yīng)用，本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikLTP基因，利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗逆轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikLTP基因，并在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒、抗旱和抗蟲性，通過(guò)該基因的過(guò)量表達(dá)，使植物的抗低溫脅迫、抗旱和抗蟲性能得到提高，最終獲得抗逆能力明顯增強(qiáng)的植物。文檔編號(hào)C12N15/84GK102041261SQ20091011359公開日2011年5月4日申請(qǐng)日期2009年12月22日優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日發(fā)明者劉紅玲,張煜星,沈海濤,王愛英,祝建波申請(qǐng)人:石河子大學(xué)