專利名稱：一種香蕉枯萎病菌快速分離鑒定培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其是涉及一種香蕉枯萎病菌快速分離鑒定培養(yǎng)基?？?用于香蕉組培苗苗期病原鑒定，亦可用于土壤中分離香蕉枯萎病原菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有 實際意義。
背景技術(shù)：
目前，香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usarium oxysporumf. sp. CUbense(FOC)侵染引起的一種世界性土傳維管束病害，近年來在我國香蕉主產(chǎn)區(qū)持續(xù) 暴發(fā)，造成嚴(yán)重?fù)p失。香蕉枯萎病菌根據(jù)鑒別寄主的不同分為4個生理小種，其中4號生理 小種幾乎對所有香蕉栽培種均致病，嚴(yán)重威脅香蕉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。迄今為止，還沒 有一種理想的藥劑可以有效防治該病，因此加強(qiáng)香蕉枯萎病的檢驗檢疫工作，尋找有效的 防治方法，控制該病的蔓延和危害迫在眉睫，而研制出一種快速檢測香蕉枯萎病菌的技術(shù) 方法將為檢驗檢疫提供有力的技術(shù)支持。土壤中存在著大量的微生物，所以從土壤中特異 性分離某一微生物是非常困難的。選擇性培養(yǎng)基必須具備極強(qiáng)的特異性選擇能力，才有實 際應(yīng)用價值。香蕉枯萎病是一種毀滅性病害，為了控制其擴(kuò)散蔓延，有必要研制出實用的早 期快速檢測技術(shù)，采取有效的防治措施，避免可能造成的重大經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于尖孢鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基，國內(nèi)外已有一些報道。雖然國內(nèi)學(xué)者韓寶坤，杜 艷華等，在植物病理學(xué)報，2001,31 (4)公開了在非無菌操作下分離尖孢鐮刀菌的培養(yǎng)基，但 是，用于從土壤中計數(shù)尖孢鐮刀菌時極易被雜菌污染，在非無菌操作不能從土壤中分離香 蕉枯萎病菌的培養(yǎng)基，達(dá)不到大量、快速檢測病原菌的目的；國外學(xué)者除把葡萄糖、蛋白胨、 酵母提取物作為鐮刀菌生長的基本營養(yǎng)物質(zhì)外，并添加許多微量元素，這些培養(yǎng)基的制作 成本普遍偏高，需經(jīng)高溫滅菌，而且所有操作須在無菌條件下進(jìn)行，這給大量快速檢測病原 菌帶來不便，效果往往不太理想。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，為了克服以上現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明專利提供一種香蕉枯 萎病菌快速分離鑒定培養(yǎng)基。本發(fā)明的目的是提供一種不僅能在非無菌操作下從感病植物組織中分離尖孢鐮 刀菌，而且能較好的從土壤中分離香蕉枯萎病菌的培養(yǎng)基，從而達(dá)到大量、快速檢測病原菌 的目的。本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)的—種香蕉枯萎病菌快速分離鑒定培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為一組組合物，其特征在于每 IOOOml水溶液含有下列組分的培養(yǎng)基馬鈴薯180 220g，五水硫酸銅 0. 4 0. 6g，七水硫酸鎂0. 5 0. 7g，磷酸二氫鉀 0. 08 0. 12g，瓊脂18 20g，95%酒精溶液 10 15ml，
75%敵克松結(jié)晶粉 2. 5 3. 0g，硫酸鏈霉素 0. 5 0. 8g，較佳地，該培養(yǎng)基為一組組合物，其特征在于每IOOOml水溶液含有下列組分的培
養(yǎng)基75%敵克松結(jié)晶粉 3. 0g，硫酸鏈霉素 0.75g，本發(fā)明的培養(yǎng)基與其它常見分離培養(yǎng)基相比具有的優(yōu)點是本發(fā)明的培養(yǎng)基不但 不需無菌操作，成分簡單、而且檢測率顯著、抑菌效果好、病菌在其上生長快、菌落典型，是 一種較為理想的選擇性培養(yǎng)基。具體的實施例制備實施例一本實施例的培養(yǎng)基成分原料配比組成馬鈴薯180g;五水硫酸銅0. 4g;七水硫酸鎂 0. 5g;磷酸二氫鉀0.08g;瓊脂18g; 95%酒精溶液IOml;75%敵克松結(jié)晶粉 2. 5g;硫酸鏈霉素0. 5g ；水溶液1000ml。本實施例培養(yǎng)基的制備方法為1、取去皮馬鈴薯180g切成小塊狀置入鍋中，向鍋中加入700ml水溶液并熬煮20 分鐘，取濾液備用；2、向步驟1制得的備用濾液中加入五水硫酸銅0. 4g、七水硫酸鎂0. 5g、磷酸二 氫鉀0. 08g、瓊脂18g煮溶，涼至45°C時分別加入95%酒精溶液10ml、75%敵克松結(jié)晶粉 2. 5g、硫酸鏈霉素0. 5g，然后加入水溶液補(bǔ)足1000ml，調(diào)pH至5. 8，攪拌均勻，直接倒平板， 室溫放置10分鐘后成品。制備實施例二本實施例的培養(yǎng)基成分原料配比組成馬鈴薯200g;五水硫酸銅0. 5g;七水硫酸鎂 0. 6g;磷酸二氫鉀0. Ig;瓊脂19g; 95%酒精溶液IOml;75%敵克松結(jié)晶粉2. 8g;硫酸鏈霉素0. 75g ；水溶液1000ml。本實施例培養(yǎng)基的制備方法為1、取去皮馬鈴薯200g切成小塊狀置入鍋中，向鍋中加入750ml水溶液并熬煮20 分鐘，取濾液備用；2、向步驟1制得的備用濾液中加入五水硫酸銅0. 5g、七水硫酸鎂0. 6g、磷酸二氫 鉀0. lg、瓊脂19g煮溶，涼至45°C時分別加入95%酒精溶液10ml、75%敵克松結(jié)晶粉2. Sg、 硫酸鏈霉素0. 75g，然后加入水溶液補(bǔ)足1000ml，調(diào)pH至5. 8，攪拌均勻，直接倒培養(yǎng)皿，室 溫放置15分鐘后成品。制備實施例三本實施例的培養(yǎng)基成分原料配比組成馬鈴薯220g;五水硫酸銅0.6g;七水硫酸鎂 0. 7g ；磷酸二氫鉀0. 12g;瓊脂20g; 95%酒精溶液15ml;75%敵克松結(jié)晶粉 3. Og;硫酸鏈霉素0.8g;水溶液1000ml。本實施例培養(yǎng)基的制備方法為1、取去皮馬鈴薯220g切成小塊狀置入鍋中，向鍋中加入800ml水溶液并熬煮20馬鈴薯七水硫酸鎂瓊脂
200g，五水硫酸銅 0. 5g， 0. 6g，磷酸二氫鉀 0. lg， 19g，95%酒精溶液10ml，分鐘，取濾液備用；2、取濾液加五水硫酸銅0. 6g、七水硫酸鎂0. 7g、磷酸二氫鉀0. 12g、瓊脂20g煮溶， 涼至50°C時分別加入95%酒精溶液15ml、75%敵克松結(jié)晶粉3. 0g、硫酸鏈霉素0. 8g，然后 加入溶液補(bǔ)足1000ml，調(diào)pH至5. 8，攪拌均勻，直接倒平板或培養(yǎng)皿，室溫放置20分鐘后成品。生物實施例一.材料香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；虵usarium oxysporumf. sp. CUbense(FOC),由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所實驗室分離、鑒定和保 存；二 .供驗培養(yǎng)基本發(fā)明的一種香蕉枯萎病菌快速分離鑒定培養(yǎng)基(以下簡稱為 本發(fā)明培養(yǎng)基)；三.試驗方法1、土樣制備在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所細(xì)胞樓基地，用取土 器在0 20cm的耕作層內(nèi)隨機(jī)多點取樣。土樣混合后在室內(nèi)自然風(fēng)干，并用制樣粉碎機(jī)粉 碎，過篩(篩孔直徑2mm)，然后裝入塑料袋保存在4 5°C恒溫箱中備用。2、檢測方法采用稀釋平板法，稱取IOg 土樣溶于裝有90mL水的250mL錐形管中， ISOrpm振蕩20分鐘，用10倍稀釋法逐步稀釋樣品，涂布于本發(fā)明培養(yǎng)基上，^TC下培養(yǎng) 3-5d，挑取與鐮刀菌形態(tài)相似的菌落，在普通光學(xué)顯微鏡下檢查是否有小型分子孢子及大 型分生孢子。3、本發(fā)明培養(yǎng)基特異性試驗，設(shè)計七種處理①半敞口狀態(tài)下將本發(fā)明培養(yǎng)基置于空氣中放置10分鐘；②涂布0. Iml水于本發(fā)明培養(yǎng)基中；③涂布0. Iml 土壤懸浮液于本發(fā)明培養(yǎng)基中；④涂布土壤懸浮液和香蕉枯萎病病原菌混合物于本發(fā)明培養(yǎng)基中；⑤涂布0. Iml水和香蕉枯萎病病原菌混合物于本發(fā)明培養(yǎng)基中；⑥點接感病香蕉組織于本發(fā)明培養(yǎng)基中；⑦點接常見青霉、曲霉、黑根霉等主要污染菌于本發(fā)明培養(yǎng)基中。^TC暗培養(yǎng)4-5d，觀察本發(fā)明培養(yǎng)基是否長出白色菌落，并統(tǒng)計雜菌生長狀況見 表1。表1本發(fā)明培養(yǎng)基特異性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種香蕉枯萎病菌快速分離鑒定培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為 IOOOml水溶液含有下列組分的培養(yǎng)基馬鈴薯180 220g， 五水硫酸銅 0.4 -七水硫酸鎂0. 5 0. Ig, 磷酸二氫鉀 0.08瓊脂18 20g，95% 酒精溶液 10 75%敵克松結(jié)晶粉2.5 3.0g， 硫酸鏈霉素 0.5--組組合物，其特征在于每 0. 6g, 0. 12g, 15ml,乂 0. 8g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種香蕉枯萎病菌快速分離鑒定培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為-合物，其特征在于每IOOOml水溶液含有下列組分的培養(yǎng)基-組組馬鈴薯200g，七水硫酸鎂0. 6g，瓊脂19g， 75%敵克松結(jié)晶粉3.0g，五水硫酸銅0. 5g，磷酸二氫鉀0. Ig, 95%酒精溶液10ml，硫酸鏈霉素0. 75g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種香蕉枯萎病菌快速分離鑒定培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為一組組合物，其特征在于每1000ml水溶液含有下列組分的培養(yǎng)基馬鈴薯180～220g，五水硫酸銅0.4～0.6g，七水硫酸鎂0.5～0.7g，磷酸二氫鉀0.08～0.12g，瓊脂18～20g，95％酒精溶液10～15ml，75％敵克松結(jié)晶粉2.5～3.0g，硫酸鏈霉素0.5～0.8g。本發(fā)明的培養(yǎng)基原料成分合理，香蕉枯萎病病原菌生長旺盛，形成白色菌落，菌落特征明顯，菌落出現(xiàn)率高；培養(yǎng)基不經(jīng)高壓蒸汽滅菌即可直接倒制平板，培養(yǎng)皿洗凈晾干后亦不需高壓蒸汽滅菌，接種操作時不需無菌操作；原料易得，提高功效，節(jié)約成本。
文檔編號C12Q1/04GK102115715SQ200910113659
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者區(qū)小玲, 吳倫英, 吳 琳, 景曉輝, 朱利林, 楊臘英, 薛玉瀟, 黃俊生 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所