專利名稱：一個在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子及其在大腸桿菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個可以在大腸桿菌中進(jìn)行組成型表達(dá)的啟動子的方法，屬于 基因表達(dá)技術(shù)的研究領(lǐng)域，本發(fā)明涉及進(jìn)一步利用這種啟動子進(jìn)行基因的表達(dá) 和有用蛋白的工業(yè)表達(dá)生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)技術(shù)是基因工程技術(shù)的核心技術(shù)，克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白 質(zhì)可進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的研究，有些在醫(yī)學(xué)上、以至在工業(yè)上都是很有應(yīng)用價值 的具有特定生物活性的蛋白質(zhì)，可以通過克隆其基因進(jìn)行人工控制其表達(dá)，實 現(xiàn)大量低成本獲得目的基因的蛋白質(zhì)?？寺』蚩梢苑旁诓煌乃拗骷?xì)胞中表 達(dá)，至今，人們已建立了許多基因表達(dá)系統(tǒng)，既有原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，也 有真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，可用大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、培養(yǎng) 的哺乳類動物細(xì)胞、以至整體動物。其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中 發(fā)展最早，研究最廣，應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌培養(yǎng)操作簡單、生長 繁殖快、價格低廉，人們用大腸桿菌研究背景清楚，用于外源基因的表達(dá)工具 已有二十多年的經(jīng)驗積累，大腸桿菌表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因
表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的80%，因此大腸桿菌 是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。
在原核生物中啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5端上游，與DNA依賴的RNA聚合酶相結(jié)合的一段DNA序列，能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄出目標(biāo)基因的mRNA。以表達(dá)目的基因為 目的的基因表達(dá)系統(tǒng)是由載體系統(tǒng)和宿主系統(tǒng)組成，而啟動子是基因工程表達(dá) 載體的重要元件，啟動子對外源基因的表達(dá)水平影響很大，對研究基因的表達(dá) 調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體至關(guān)重要。隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構(gòu)建能高水平 表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)，同時其調(diào)控方式簡單，操作成本低。理想的啟動 子具有以下特性作用強(qiáng)；容易調(diào)控；容易轉(zhuǎn)導(dǎo)入其他以便篩選大量的 用于生產(chǎn)蛋白的菌株；而且對其誘導(dǎo)是簡便和廉價的。
能在五.co//中發(fā)揮作用的啟動子很多，根據(jù)調(diào)控的方式不同可以把啟動子 分成組成型表達(dá)啟動子和誘導(dǎo)表達(dá)啟動子。誘導(dǎo)調(diào)控型的啟動子只有在誘導(dǎo)劑 存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物，這種方法有助于避免菌體生長前期高表達(dá)對 菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒 蛋白的表達(dá)。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo) 表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。目前大腸桿菌最常用的啟動子是化學(xué)誘導(dǎo)啟動 子(Plac，P印)和熱誘導(dǎo)啟動子U尸L)，利用異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG) 為化學(xué)誘導(dǎo)物的雜交啟動子toc或frr都是強(qiáng)啟動子。雖然化學(xué)誘導(dǎo)的啟動在調(diào) 控性非常容易操作，但是作為誘導(dǎo)劑的IPTG本身具有毒性而且價格昂貴，因 而不適合用于大規(guī)模工業(yè)的應(yīng)用或者用于大量生產(chǎn)人用治療性蛋白，所以大多 應(yīng)用于基礎(chǔ)研究中。熱誘導(dǎo)(入戶L)啟動子是由于編碼熱敏阻遏蛋白的突 變(Ts)基因的出現(xiàn)使得目前能夠?qū)@些啟動子進(jìn)行熱誘導(dǎo)。熱誘導(dǎo)(入 戶L)啟動子的調(diào)控依賴于突變/^/的菌株，盡管野生型/^/基因也能熱誘導(dǎo)， 但不能對其進(jìn)行嚴(yán)緊型調(diào)節(jié)，且不能用于/ac/q菌株，因為溫度的變化不能遏制由阻遏蛋白的過量表達(dá)所造成的嚴(yán)緊性抑制，因此，該系統(tǒng)只能用于生 產(chǎn)對宿主菌無害的一些蛋白。溫度誘導(dǎo)型啟動子存在不利于在大規(guī)模工業(yè)表達(dá) 的缺點，如在大型發(fā)酵罐進(jìn)行溫度的的快速轉(zhuǎn)換存在很大的困難，從而影響到 誘導(dǎo)表達(dá)的效果，此外在高于菌體的最適生長溫度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)容易使表達(dá) 產(chǎn)物形成沒有活力的包涵體，同時由于在高溫條件下容易激活宿主內(nèi)的蛋白酶 降解表達(dá)的目的蛋白，從而不利于表達(dá)產(chǎn)物的積累。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中還
廣泛應(yīng)用T7啟動子，T7啟動子本身不是屬于化學(xué)調(diào)控，而是受T7RNA聚合 酶調(diào)控的，但T7表達(dá)系統(tǒng)的T7 RNA聚合酶調(diào)控又是受Plac啟動子的化學(xué)調(diào) 控，所以在實際超過過程還是利用IPTG進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)的，所以大腸桿菌的T7 表達(dá)系統(tǒng)也是屬于化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)。
組成型表達(dá)啟動子也就是一直不停表達(dá)目的蛋白的啟動子，利用這類型的 啟動子可以構(gòu)建組成型表達(dá)系統(tǒng)，如pMAL系統(tǒng)。組成型表達(dá)持續(xù)性表達(dá)通常 表達(dá)量比較高，而且不需要添加誘導(dǎo)劑在工業(yè)規(guī)模表達(dá)目的基因時可以減少生 產(chǎn)成本，還可以避免表達(dá)藥物蛋白不能加入有毒的IPTG誘導(dǎo)劑，因而組成型 表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是工業(yè)表達(dá)有用蛋白的理想啟動子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子及其在大腸 桿菌中的應(yīng)用，該啟動子能夠在不需要添加誘導(dǎo)劑的條件下實現(xiàn)外源基因在大 腸桿菌中的高水平表達(dá)。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，通過提取土壤微生物總DNA構(gòu)建宏基因組文庫，然 后對文庫進(jìn)行隨機(jī)測序獲得大量的DNA序列，再將獲得的大量DNA序列放到啟 動子的預(yù)測分析網(wǎng)站http:〃www. fruitfly. org/seq—tools/promoter, html進(jìn)行啟動子的預(yù)測分析，同時結(jié)合利用Vector NTI軟件進(jìn)行分析，得到可能為啟 動子的DNA序列。
所述啟動子的DNA序列它具有
SEQ ID NO. 1的信息
序列信息NO.:l
序列長度51堿基對
序列類型核酸
鏈型雙鏈
拓樸學(xué)線性
分子類型基因組DNA
假設(shè)的NO 反義的NO
來源土壤未培養(yǎng)微生物
序歹(J: aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc
其全部序列或者部分序列具有在大腸桿菌中啟動子轉(zhuǎn)錄活性。 其全部序列的連續(xù)或者非連續(xù)序列具有在大腸桿菌中啟動子轉(zhuǎn)錄活性。 其突變體和變異體具有在大腸桿菌中啟動子轉(zhuǎn)錄活性。 在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子的應(yīng)用，是將該啟動子用于構(gòu)建表達(dá)載 體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中高水平表達(dá)。
在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子的應(yīng)用，是將外源基因連接到該啟動子 的下游，然后引導(dǎo)外源基因?qū)氪竽c桿菌驅(qū)動外源基因的高水平表達(dá)。
能在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子，其表達(dá)宿主包含大腸桿菌所有的菌株。
由于構(gòu)建文庫的DNA來源于土壤未培養(yǎng)微生物，因此需要對獲得可能為啟 動子的DNA序列進(jìn)行同源性的分析，從而確定其可能的來源。分析的方法把序 列放到http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi即NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源 性檢索分析，把同源性較低的序列確定候選的啟動子DNA序列，然后再進(jìn)行基 因大腸桿菌表達(dá)實驗以確定該啟動子在大腸桿菌具有組成型轉(zhuǎn)錄活性。
本發(fā)明的有益效果和突出的實質(zhì)性特點在于
1、 本發(fā)明提供的啟動子的DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫同源檢索分析，在 Highly similar sequences的檢索項中檢索不到和本序列高度同源的序列，表 明本啟動子DNA是一個新的DNA序列。
2、 本發(fā)明提供的啟動子能在大腸桿菌中組成型表達(dá)，不需要添加任何化學(xué) 誘導(dǎo)物，也不需要物理條件的誘導(dǎo)就可以實現(xiàn)高水平表達(dá)。
3、 本發(fā)明提供的啟動子能應(yīng)用與表達(dá)外源基因，能夠應(yīng)用于構(gòu)建組成型表 達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌種進(jìn)行表達(dá)。
4、本發(fā)明的目的提供一種啟動的序列，具有全部或部分活性的DNA序列， 包含這樣啟動子序列的載體，和被這種啟動子轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞，利用這樣重 組細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的方法。
由于本發(fā)明啟動子的序列來源于未培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫，其真正來 源宿主不能確定，因此本說明書所述的外源基因，也是指目的基因，沒有特定 的指定來源的指定，可以包括編碼蛋白質(zhì)的基因的DNA序列，也包括編碼核酸 酶和反義核酸的DNA序列，其來源可以是真核的，也可以是原核的，也可以是人工合成的核酸序列。


圖1是本發(fā)明所述的在大腸桿菌中組成型表達(dá)7力e7m &'AVs/mcs淀粉酶 基因和對照相比的SDS-PAGE電泳分析圖。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述
在本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(五^/zeWc/h'aco")菌株， 載體pMD18-T Vector克隆載體購自TaKaRA;限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑等 購自TaKaRA、 MBI; Sac/〃w//c/2em/o，&菌株購買于工業(yè)菌種保藏中心。 1.預(yù)測和篩選候選啟動子DNA序列
土壤未培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫包含大量未知的DNA序列，本發(fā)明人構(gòu) 建的土壤未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫經(jīng)過隨機(jī)測序獲得了大量新的DNA序列， 在這些序列中有可能存在我們需要的目的啟動子DNA序列，通過預(yù)測和實驗研 究就可能找到我們需要的啟動子DNA序列。通常原核生物的啟動子的大小都在 100 bp以下，因此要從大量的序列找出啟動子序列是首先要經(jīng)過預(yù)測分析，然 后再進(jìn)性轉(zhuǎn)錄活性的研究分析才能獲得目的啟動子。首先把隨機(jī)測序獲得的DNA 序列放到http: //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html進(jìn)行啟動子的 預(yù)測分析，該網(wǎng)站預(yù)測分析是通過得分高低的形式提供獲得一些可能為啟動子 的DNA序列，但是不能保證這些序列就是我們需要的啟動子序列，還需要進(jìn)行 轉(zhuǎn)錄實驗的證實。為了保證我們研究的啟動子是新的DNA序列，需要將上面預(yù) 測分析得到的啟動子序列放到http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi上 進(jìn)行同源性檢索分析以排除同源性高的序列，把檢索不到的或者同源性很低的啟動子作為候選的目的啟動子來進(jìn)行下一步的實驗驗證。 2、 5acz7/w //c/zem/om^淀粉酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建
以Sa"7/m //ctem/onT^淀粉基因BLA來檢測啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，根據(jù) Genbank登記號為AY630336的BLA基因序列設(shè)計以下引物
A: 5 -aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctcatgaaacaacaaaaacg-3 B: 5- atgaaaca3caaa犯cggc-3 C: 5-ctatctttgaacataaattg-3
引物A和B都是BLA基因的上游引物，引物B沒有啟動子的序列作為對照， 而為了把要表達(dá)的BLA基因連接到待檢測啟動子的下游，在引物A的5'端設(shè)計 啟動子序列aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc， 引物C為基因 的下游引物。提取Sflcz7/us //ctem/orm^總DNA為模版，采用Taq酶以引物A 和B來BLA基因，利用AT連接法與pMD18-T Vector克隆載體連接，用CaC12 法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，篩選得到BLA基因的重組子即為BLA 基因的表達(dá)載體用于檢測啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；同樣方法以引物B和引物C同樣 方法擴(kuò)增BLA基因連接到pMD18-T Vector克隆載體上用于檢測轉(zhuǎn)錄活性的對 昭。
本發(fā)明是經(jīng)過對許多由步驟1預(yù)測分析獲得的候選啟動子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活 性的研究分析才獲得的，本發(fā)明所陳述的實施方法僅僅是對獲得本發(fā)明啟動子 序列實驗過程的陳述，僅對一個序列而不包括對其它候選啟動子轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn) 錄活性研究過程的陳述。 獲得的啟動子DNA序列
aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc
3、 BLA基因的表達(dá)和檢測
10將步驟2構(gòu)建的表達(dá)載體和對照載體同時導(dǎo)入大腸桿菌菌株JM109和BL21 獲得重組菌株，然后分別接種到20ml含100 ii gZml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中， 37°C， 220rpm振蕩培養(yǎng)12個小時。11000rpm離心3min，收集菌體，用4ml， pH7. 0 ， 100腿的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破胞9min， 12000rpm離心10min 得到上清就是淀粉的粗酶液用于檢測淀粉酶的活力。
酶活測定方法取1%， pH7. O可溶性淀粉溶液lml，，于80。C下水浴預(yù)熱10min 后，加入粗酶液1 ml精確反應(yīng)10 min后，用2ml 0.1 mol/l鹽酸終止反應(yīng)，再取 0. 2ml混合液體于盛有2ml碘液的試管中，搖勻，并立即用分光光度計于660nm處 測定吸光度。用同樣方法測定空白值，但不加酶液,而代之以1.0 ml的蒸餾水， 作為空白對照液。酶活定義 一個淀粉酶單位相當(dāng)于在8(TC、pH7. O條件下，lmin 將1%淀粉溶液的顯藍(lán)強(qiáng)度降低1%時所需酶量。酶活=[(DO - D) X 100 Z DOX 10 ] X稀釋倍數(shù)，DO為空白值吸光度，D為主值吸光度，100為系數(shù)(％)， IO為反應(yīng)時 間(min)。
經(jīng)過淀粉酶活力的檢測，帶有啟動子序列的BLA基因表達(dá)載體在大腸桿菌 菌株的活力JM109是431 U/ml，在菌株BL21的活力是621 U/ml，而不帶有 啟動子序列的對照載體沒有檢測到淀粉酶活力活力。
實驗結(jié)果表明該啟動子序列在大腸桿菌的不同菌株都具有轉(zhuǎn)錄活性，而且 不需要添加化學(xué)誘導(dǎo)劑，也不需要進(jìn)行物理條件的誘導(dǎo)，是一種組成型表達(dá)的 啟動子。
4 、 T7^rwoZ)zy^ayksca淀粉酶基因的表達(dá)
為了研究啟動子對其它基因是否具有同樣的轉(zhuǎn)錄活性，根據(jù)Genbank上登 記號為DQ473479的rterwo&yWa/wca淀粉酶基因的序列設(shè)計以下引物
Sense Primer: 5- aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctcatg gcg ccg tea ggc aac-3，Antisense Primer: 5國tcagcgccaggagtcgta-3
采用與步驟3，步驟4同樣的方法將MeiT^/^/jVa /k ca淀粉酶基因連接 到目的啟動子的下游構(gòu)建表達(dá)載體，然后導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。重組菌株分 別接種到20ml含100pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C， 220rpm振蕩培 養(yǎng)12個小時。然后11000rpm離心lmin，收集菌體，用SDS-PAGE電泳檢測 7%e2m^j'/_2Va /kscs淀粉酶基因的表達(dá)。
經(jīng)過SDSPAGE電泳分析，和對照相比，根據(jù)泳道2所表達(dá)的蛋白質(zhì)特征條 帶表明，連接在啟動子下游的7力ei7^Zu'/i^/lAsw淀粉酶基因得到很好的表達(dá)。
實驗結(jié)果再次表明我們獲得的啟動子序列在大腸桿菌中具有轉(zhuǎn)錄活性，能 夠表達(dá)不同的基因，而且不需要添加化學(xué)誘導(dǎo)劑，也不需要進(jìn)行物理條件的誘 導(dǎo)，是一種組成型表達(dá)的啟動子。
所述實施方式是為了更好的解釋本發(fā)明，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明。
12序列表
1、 SEQ ID NO. 1
(1)序列特征
a. 長度51堿基對
b. 類型核酸 C.鏈型雙鏈 d.拓樸學(xué)線形
(2) 分子類型基因組DNA
(3) 序列描述 aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc
權(quán)利要求
1、一個能在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子Pinv的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1的信息序列信息NO.1序列長度51堿基對序列類型核酸鏈型雙鏈拓樸學(xué)線性分子類型基因組DNA假設(shè)的NO反義的NO來源土壤未培養(yǎng)微生物序列aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc。
2、 如權(quán)利要求l所述的DNA，其特征在于，其全部序列或者部分序列 具有在大腸桿菌中啟動子轉(zhuǎn)錄活性。
3、 如權(quán)利要求l所述的DNA，其特征在于，其全部序列的連續(xù)或者非 連續(xù)序列具有在大腸桿菌中啟動子轉(zhuǎn)錄活性。
4、 如權(quán)利要求l所述的DNA，其特征在于，其突變體和變異體具有在大 腸桿菌中啟動子轉(zhuǎn)錄活性。
5、 如權(quán)利要求1所述的能在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子的應(yīng)用，其特征在于將該啟動子用于構(gòu)建表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中高水平表達(dá)。
6、 如權(quán)利要求l所述的能在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子的應(yīng)用，其特 征在于將外源基因連接到該啟動子的下游，然后引導(dǎo)外源基因?qū)氪竽c桿菌驅(qū) 動外源基因的高水平表達(dá)。
7、 如權(quán)利要求5或權(quán)利6所述的能在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子的應(yīng) 用，其特征在于，其表達(dá)宿主包含大腸桿菌所有的菌株。
全文摘要
一個能在大腸桿菌中組成型表達(dá)的啟動子Pinv的DNA，它具有SEQ ID NO.1的信息，其序列信息為NO.1，序列長度為51堿基對，序列類型為核酸，鏈型為雙鏈，拓樸學(xué)為線性，分子類型為基因組DNA，假設(shè)的為NO，反義的為NO，來源為土壤未培養(yǎng)微生物，序列為aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc。該啟動子在不需要化學(xué)和物理條件的誘導(dǎo)就能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在大腸桿菌中高水平表達(dá)。獲得的啟動子可以用于外源基因在大腸桿菌的表達(dá)，用于有用蛋白的生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/00GK101560516SQ20091011382
公開日2009年10月21日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者杜麗琴, 韋宇拓, 黃日波 申請人:廣西大學(xué)